基于HMGB1/Beclin-1信號通路探討雷公藤多苷對腎病綜合征模型大鼠保護機制

羅亞丹 袁立英 裘志成 何鴻

(遵義醫科大學 1第三附屬醫院腎內科，貴州 遵義 563000;2第一附屬醫院腎內科;3遵義醫藥高等專科學校健康管理系)

腎病綜合征(NS)是一種具有復雜發病機制的代謝綜合征，表現為尿蛋白增加，高脂血癥等〔1〕。目前，該病的臨床治療主要以激素干預為基礎，但由于激素的不良反應和患者身體敏感性的差異，其效果有限〔2〕。 MicroRNA是小非蛋白質單鏈RNA，可通過組織中的轉錄調節靶基因的表達。研究表明，MicroRNA參與了一系列過程，包括細胞發育、細胞凋亡和自噬〔2，3〕。研究發現〔4〕，miR-141和HMGB1/Beclin-1之間的平衡是引起NS的重要原因。雷公藤多苷是一種具有強效的調節免疫作用與廣泛性的消炎作用的生物大分子，它從雷公藤植物中提取〔3〕。本研究通過動物實驗研究雷公藤多苷在治療NS中的潛在應用價值及驅動這種效應產生可能的機制。

1 材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物 SPF級的成年Wistar大鼠60只，全部選用雄性，體重200～250 g,8周齡。實驗用大鼠由北京維通利華動物實驗技術有限公司提供，實驗動物使用許可證號：SYXK(京)2014-0002。大鼠飼養于SPF級環境下，定時輻照滅菌，實驗全程給予所有大鼠便捷自由的飲水和采食設備，隨時觀察大鼠狀態，排除飼養過程中產生的系統誤差。適應性喂養1 w后，開始實驗建模。

1.1.2實驗用藥 雷公藤多苷片，每片10 mg，使用時研磨成細粉。批準文號：國藥Z43020138，湖南千金謝利制藥有限公司生產。

1.1.3實驗試劑 注射用鹽酸阿霉素，購自深圳萬樂藥業有限公司，產品批號為：國藥準字H44024359。醋酸潑尼松龍片，購自上海上藥信誼藥廠有限公司，產品批號為：國藥準字H31020771。兔抗大鼠 LC3 購自北京索萊寶科技有限公司，產品批號為：3950。腫瘤壞死因子(TNF)-α酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(批號：E201609)、兔抗大鼠 HMGB1 抗體(批號：11570-1-AP) 、山羊抗大鼠 Beclin-1抗體(批號：9144-3-CB)、白細胞介素(IL)-4 ELISA試劑盒(批號：P201912)和IL-8 ELISA試劑盒(批號：P201905 ) 均由北京森和優生物有限公司生產。

1.2實驗方法

1.2.1分組和建模 60只大鼠隨機分為6個實驗組。除空白對照組外其余組所有大鼠尾靜脈注射鹽酸阿霉素5 mg/kg，建立NS模型〔5〕。大鼠24 h尿蛋白顯著增加，說明模型成功建立〔6〕。空白對照組的大鼠注射等體積生理鹽水。

1.2.2藥物處理 模型建立5 d后開始進行藥物處理。低、中、高劑量組分別給予3、6、12 g/kg雷公藤多苷灌胃處理；陽性對照組給予醋酸潑尼松0.2 g/kg灌胃處理；模型對照組和空白對照組每日給予等體積的蒸餾水。共持續14 d，并且藥物處理組固定時間給藥，空白對照組于相同時刻灌胃蒸餾水。

1.2.3檢測方法

1.2.3.1大鼠一般狀態 給藥期間，觀察大鼠毛發、進食量、精神、大便、體重情況等。

1.2.3.2蘇木素-伊紅(HE)染色組織學觀察 給藥結束后24 h觀察組織，7.5 ml/kg氨基甲酸乙酯麻醉大鼠并處死。從腹部取出腎臟組織，并分兩部分保存，其中一份-80℃冰箱保存，另一份10%多聚甲醛常溫保存。將固定好的腎臟組織包被在石蠟中，切片，進行HE染色。首先，應將固定好的切片放至顯微鏡下，調整視距使鏡內的細胞細節清晰，然后觀察切片組織發生的細胞病理學變化。病理學變化的程度以腎臟組織的病理學評分為標準，分別為：0分：無充血、水腫、炎癥浸潤等現象的正常組織；1分：血管輕度水腫且組織界限模糊，表現為皮質及髓質模糊，并出現炎性浸潤；2分：組織明顯充血水腫，腎皮質與髓質之間的界限消失，細胞的炎性浸潤顯著；3分：腎組織各結構模糊不清，顯著受損，血管模糊，細胞出現嚴重的炎性浸潤。

1.2.3.3TUNEL法腎組織凋亡觀察 取出-80℃放置的腎組織冷凍切片，加入50 μl蛋白酶K，37℃孵育20 min，加入TUNEL反應液，37℃孵育1 h，使用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗兩次切片，添加過氧化物酶結合抗體，37℃孵育1 h，孵育結束后，使用二氨基聯苯胺(DAB)染色，然后用蘇木素復染。脫水封片，并在顯微鏡下觀察細胞凋亡情況。凋亡細胞核染色呈棕色。用ImageJ軟件定量分析細胞凋亡率，細胞凋亡率(%)=棕色細胞數/細胞總數 × 100%。

1.2.3.4外周血細胞TNF-α、IL-4、IL-8含量的測定 處死大鼠后，收集10 ml血液，并以3 000 r/min進行離心，放置在15 ml離心管中離心10 min，取上層分離的血清液采用ELISA檢測血清中TNF-α，IL-4和IL-8的水平。

1.2.3.5ELISA測定HMGB1、LC3與Beclin-1的蛋白表達水平 將腎臟組織添加到IPA裂解緩沖液中，并放置于冰上，低溫裂解20 min。BCA法處理樣本，使用96孔分別添加，對樣本進行總蛋白濃度定量，確定后續加樣量，以進行Western印跡實驗。通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離轉膜質量相等的蛋白質條帶，添加一抗與β-actin內參(1∶500)然后在4℃搖床孵育過夜。 過夜后，先檢查膜上是否有沒浸潤的地方，若浸潤充分則使用TBST進行洗滌，洗滌3次，每次同樣在搖床放置5 min，提高洗滌效率。洗滌后，添加二抗(1∶500)，使用電化學發光(ECL)試劑曝光顯色，并使用QuantityOne軟件分析相對蛋白質表達水平。

1.3統計學方法 采用SPSS23.0統計軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1大鼠一般狀態比較 空白對照組精神狀態良好，反應靈敏，毛發光滑發亮，進食正常。模型對照組造模后第7天，大鼠尿量減少并伴有少量的腹水現象，精神狀態日漸萎靡，進食減少，體重下降；造模后第7～14天，大鼠腹水顯著增多，出現嗜睡、反應遲鈍，有弓背聳肩現象，蜷臥少動，體毛發灰發暗，大便稀溏等體征；與模型對照組相比，低、中、高劑量組在5 d給藥后，大鼠的活躍度較高，精神好轉，毛發漸有光澤。

2.2各組腎組織HE染色 空白對照組腎臟大小正常且組織細胞邊界清晰，無炎癥，浸潤未出現充血。模型對照組腎臟腫大，腎皮質與腎髓質出現分界模糊，血管充血癥狀，炎癥和浸潤明顯。低、中、高劑量組上述癥狀程度較模型對照組輕。

與空白對照組相比，模型對照組腎組織病理評分較高，且差異顯著(P<0.05)；與模型對照組相比，藥物處理各組的腎組織病理評分均較低，且差異顯著(P<0.05)。雷公藤多苷的治療效果具有顯著劑量依賴性(P<0.01)。見圖1、表1。

圖1 各組腎組織形態(HE染色，×200)

2.3各組腎組織凋亡比較 與空白對照組相比，模型對照組與藥物處理各組的凋亡細胞數量增加，且差異顯著(P<0.05)；與模型對照組相比，藥物處理各組腎臟中凋亡細胞數量降低，且差異顯著(P<0.05)。雷公藤多苷治療效果具有顯著劑量依賴性(P<0.01)。見表1，圖2。

2.4各組腎組織TNF-α，IL-4，IL-8含量比較 與空白對照組相比，模型對照組及藥物處理各組TNF-α、IL-4、IL-8含量增加，且差異顯著(P<0.05)；與模型對照組相比，藥物處理各組腎臟中TNF-α、IL-4和IL-8的含量降低，且差異顯著(P<0.05)。雷公藤多苷的治療效果具有顯著劑量依賴性(P<0.01)。見表1。

表1 各組腎組織病理評分、凋亡及TNF-α、IL-4、IL-8表達比較

2.5各組腎組織中HMGB1/Beclin-1信號通路的蛋白表達對比 與空白對照組相比，模型對照組及藥物處理各組HMGB1、LC3、Beclin-1蛋白表達出現增加，且差異顯著(P<0.05)；與模型對照組比較，藥物處理各組中HMGB1/Beclin-1信號蛋白的表達量均降低，且差異顯著(P<0.05)，與低劑量組相比，高、中劑量組HMGB1/Beclin-1信號蛋白的表達均降低，且差異顯著(P<0.01)。見圖3、表2。

圖2 各組腎組織凋亡影響的比較(TUNEL染色，×200)

1～6：模型對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組、陽性對照組、空白對照組

表2 HMGB1/Beclin-1信號通路蛋白表達比較

3 討 論

研究發現〔7，8〕，NS具有復雜的發病機制，可能機制與炎癥反應，微循環阻礙及機體代謝異常有關。在中醫中，NS屬于“水”和“缺乏”兩類。其發病原因，可能主要是由肺、脾和腎的功能障礙導致，其實質是腎虛。處理原則應為除風促水。要移動脾虛消濕，促進血液循環消瘀，促進排濕熱，解濕熱毒等〔9〕。雷公藤多苷是一種植物提取的生物大分子，具有調節免疫作用與消炎作用〔3〕，有“中草藥激素” 之稱，其為我國首先研究利用的一種具有消炎免疫作用的中草藥。自噬是一種程序化的生存模式，通過自噬相關因子調節自噬囊泡的降解，以維持內部環境的穩定性和細胞代謝的平衡〔10〕。研究表明miR-141可以與HMGB1啟動子結合以靶向并抑制HMGB1的表達，從而阻斷HMGB1/Beclin-1途徑，減弱由急性腎損傷(AKI)誘導的NS〔11〕。生理自噬不能觸發NS的病理過程。當人體中發生了炎癥反應時，人體外周血內白細胞的比例類型將發生變化。在免疫機制下，人體白細胞會發生過多變化〔12〕。

有研究指出，TNF-α、IL-4和IL-8可以通過調節多種細胞信號通路來增強炎癥反應〔13〕。雷公藤多苷對NS有較好的改善和治療作用，但具體作用機理尚不清楚。本文結果表明，雷公藤多苷可能通過調節NS大鼠的免疫變化，發揮了抗炎作用。

HMGB1可以在染色質的結構中發揮重要作用，影響核中的轉錄與復制、重組的效率及基因組的整體穩定性，還可以用作胞外信號分子，來進行炎癥，免疫反應，自噬和癌癥的微觀調節〔14〕。Beclin-1是第一個被證實的自噬基因，在炎癥中起重要作用〔15〕。 有研究表明，細胞質HMGB1可將Beclin-1分子從其抑制伴侶Beclin-2分子中分離出來，并通過Beclin-2分子促進Beclin-1分子和Ⅲ型磷酸肌醇3激酶的結合，來激活自噬〔16〕。有證據〔17〕表明，miR-141可以與HMGB1mRNA啟動子上的HMGB1受體結合來阻斷其表達，從而抑制HMGB1/Beclin-1途徑來阻斷刺激自噬體的過程。NS發作期間上述指標是否有變化尚未得到證實〔18〕。本研究表明，HMGB1/Beclin-1信號通路的傳導信號增強。這也證實了HMGB1/Beclin-1信號通路及其調控機制與NS的發病機制有關〔19〕。本實驗表明，雷公藤多苷可有效降低腎臟組織中HMGB1、LC3和Beclin在NS模型大鼠的表達，并通過降低蛋白表達的方式調整了HMGB1/Beclin-1的信號通路HMGB1、LC3、Beclin-1的負反饋機制，從而有效地控制了信號通路的傳導并控制了疾病的進程。

因為雷公藤多苷對蛋白尿的短期作用相對明顯，沒有激素治療導致臉圓、身胖的不良反應，由于原產地國內，且前期研究國內較為深入，作為國內的平價藥物具有價格不貴，服用方便的優點。但有研究表明，其可能對女性腎病患者具有一定的毒害作用〔20〕。后續研究中，應進行對應方面研究的拓展。

綜上所述，雷公藤多苷可通過調節HMGB1/Beclin-1通路，降低蛋白表達的方式，降低腎細胞凋亡，控制細胞內負反饋調節機制，從而影響NS大鼠的病程。表明miR-141可能是NS治療的潛在靶標。下一步可以從分子和遺傳學的角度，繼續深入探討雷公藤多苷對NS的治療作用。