基于Wnt信號通路探究上調miR-184對糖尿病視網膜病變模型大鼠的干預效果

鄭麗 秦學維 王利民 姚賢鳳 陳梅 伍丹丹

(貴州中醫藥大學第一附屬醫院眼科，貴州 貴陽 550001)

隨著社會經濟水平增長，生活質量及飲食結構改變，導致我國趕超美國成為糖尿病第一大國〔1〕。糖尿病發展后期容易出現糖尿病視網膜病變、糖尿病腎病、糖尿病足等嚴重并發癥〔2〕。據臨床數據統計，糖尿病視網膜病變在糖尿病患者中約占40%，且若無法及時控制血糖會導致視網膜持續出血，對視力造成嚴重影響〔3〕。糖尿病視網膜病變是指機體長期處于高糖狀態，導致視網膜血管自我調節出現紊亂的過程，嚴重者可導致失明。臨床對糖尿病視網膜病變進行治療以降血糖為主，同時配合血管、神經保護劑進行對癥治療〔4,5〕。本研究建立糖尿病視網膜病變模型，通過Wnt信號通路探究上調miR-184對糖尿病視網膜病變模型大鼠的干預效果。

1 材料與方法

1.1材料 研究動物：選取40只SD健康大鼠，來源于上海斯萊克實驗動物公司。9～12月齡，平均(10.5±1.3)月齡。體重200～220 g，平均體重(210.0±8.5)g。環境溫度(23.1±1.7)℃，濕度35%～42%，12 h光照晝夜交替照明環境下喂養1 w，給予標準鼠科動物飼料，不限制飲水與飲食。本文研究獲得醫院倫理委員會批準。

主要試劑：兔抗小鼠谷胱甘肽(GSH)抗體、兔抗大鼠一氧化氮(NO)抗體(Hyclone公司)；兔抗糖原合成激酶(GSK)-3β、β-連環蛋白(catenin)、原癌基因(C-Myc)多克隆抗體(北京搏奧森生物技術有限公司)；小鼠抗大鼠總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)抗體(Dako公司)

1.2方法

1.2.1建模及分組 大鼠飼養1 w，飼養環境溫度保持在21～25℃，12 h光照，不限制飲水與飲食。參考時倩倩等〔6〕研究中糖尿病視網膜病變大鼠模型建立方法并進行細微改動，對隨機選取的30只SD健康大鼠建立糖尿病視網膜病變模型。大鼠禁食12 h后尾靜脈注射鏈尿佐菌素(STZ)溶液40 mg/kg建立高糖模型，72 h后對所有大鼠進行空腹血糖水平檢測，若檢測水平≥16.7 mmol/L，則代表糖尿病模型建模成功。大鼠均給予高脂飼料喂養1個月后，進行熒光素血管造影檢查，若糖尿病大鼠眼底出現明顯視網膜出血及滲出等視網膜病變表現，說明糖尿病視網膜病變大鼠建模成功。建模過程中死亡5只，成功25只。將建模成功的25只大鼠，隨機分為模型組9只、下調miR-184組8只、上調miR-184組8只。下調miR-184組尾部靜脈注射30 mg/kg miR-184拮抗劑(antagomiR-184)，上調miR-184組大鼠尾部靜脈注射30 mg/kg雙鏈形式miR-184(agomiR-184)，正常組、模型組采用同等劑量的生理鹽水進行尾部靜脈注射。各組大鼠連續干預10 w。

1.2.2標本采集 所有大鼠連續干預1 w后取靜脈血液3 ml，2 000 r/min離心20 min，分離上清液，置于-70℃溫度下保存。麻醉處死后，對大鼠進行解剖，快速取出新鮮大鼠雙眼視網膜。

1.2.3蘇木素-伊紅(HE)染色 取大鼠雙眼視網膜，液氮冷凍后常規脫水、透明、石蠟包埋，做5 μm切片。將切片烤干后進行脫蠟處理，之后順序置入不同濃度的酒精中各復水3 min。使用蘇木素染色15 min后清洗3次，使用鹽酸酒精分化處理30 s，充分清洗之后使用1%伊紅染色，酒精脫水處理后進行脫蠟處理，封片后使用顯微鏡進行觀察。

1.2.4血脂、血糖、GSH、NO水平檢測 對TC、TG、GSH、NO水平采用免疫比濁法進行檢測。準備3個試管并分別標記為標準管、測定管及空白管，3個試管中均加入350 μl緩沖液，標準管中加入20 μl TC、TG標準液，測定管中加入20 μl血清，空白管中加入20 μl蒸餾水3個試管分別搖晃均勻，常溫環境靜置5～10 min后使用分光光度計進行比色，在500 nm波長處以空白管調零，記錄吸光度，對TC、TG、GSH、NO水平進行計算。采用血糖分析儀對空腹血糖水平進行檢測，并進行組間比較。

1.2.5血管內皮生長因子(VEGF)、腫瘤壞死因子(TNF)-α采用酶聯免疫吸附試驗進行水平檢測 將待測標本置于室溫后，標記酶標板，制作標準品，然后取出試劑盒，以1∶2的稀釋液稀釋樣品；在反應孔上依次加入稀釋好的待測血清和標準品100 μl/孔，放置37℃恒溫孵育箱中濕育2 h；用專用的洗滌液將反應板清洗3次以后，再加入抗體工作液(1∶100倍稀釋后)100 μl/孔，放于37℃恒溫孵育箱中濕育45 min；繼續清洗反應板4次后，在反應孔內加入四甲基聯苯胺(TMB)溶液100 μl/孔，置于37℃恒溫孵育箱中濕育45 min后在反應孔內加入終止液100 μl/孔終止反應，在450 nm波長測定吸光度，經繪制標準曲線計算VEGF、TNF-α水平。

1.2.6Western印跡檢測各組大鼠GSK-3β、β-catenin、C-Myc表達 使用磷酸鹽緩沖液(PBS)緩沖液對標本沖洗之后裂解30 min，測定蛋白濃度。取20 μg/孔蛋白質，添加蛋白緩沖液后進行電泳，10 min后將電轉膜置于10%的牛奶中浸泡，常溫環境下封閉90 min。之后結合一抗、稀釋，孵育1 d，取出后使用TBST液沖洗，結合二抗，60 min后清洗、顯色，對細胞凋亡相關蛋白GSK-3β、β-catenin、C-Myc表達進行檢測。

1.3統計學處理 采用SPSS21.0軟件進行重復測量數據方差分析、F檢驗、獨立t檢驗。

2 結 果

2.1各組病理形態 如圖1所示，正常組視網膜表面光滑、結構清晰、無異常增生。與正常組相比，模型組視網膜各層充血、細胞排列不勻。與模型組相比，下調miR-184組視網膜各層充血嚴重、視網膜外有萎縮現象、表面凹凸不平，上調miR-184組視網膜各層充血量相對較少、內膜較為光滑、未見視網膜萎縮、細胞排列緊密。

圖1 各組視網膜病理形態(HE染色，×400)

2.2各組TC、TG、空腹血糖水平對比 如表1所示，與正常組相比，模型組TC、TG、空腹血糖水平顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，下調miR-184組TC、TG、空腹血糖水平顯著升高(P<0.05)；與下調miR-184組相比，上調miR-184組TC、TG、空腹血糖水平顯著降低(P<0.05)。

2.3各組VEGF、TNF-α水平比較 與正常組相比，模型組VEGF、TNF-α水平上升(P<0.05)；與模型組相比，下調miR-184組VEGF、TNF-α水平顯著上升(P<0.05)；與下調miR-184組相比，上調miR-184組VEGF、TNF-α水平顯著下降(P<0.05)。見表1。

2.4各組GSH、NO水平對比 與正常組相比，模型組GSH顯著下降、NO水平顯著上升(P<0.05)；與模型組相比，下調miR-184組GSH下降、NO水平顯著上升(P<0.05)；與下調miR-184組相比，上調miR-184組GSH顯著上升、NO水平顯著下降(P<0.05)。見表2。

2.5各組GSK-3β、β-catenin、C-Myc表達對比 如表2、圖2所示，與正常組相比，模型組GSK-3β表達顯著升高、β-catenin、C-Myc表達顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，下調miR-184組GSK-3β表達顯著升高、β-catenin、C-Myc表達顯著降低(P<0.05)；與下調miR-184組相比，上調miR-184組GSK-3β表達顯著降低，β-catenin、C-Myc表達顯著升高(P<0.05)。

表1 各組TC、TG、空腹血糖、VEGF、TNF-α水平對比

表2 各組GSH、NO水平及GSK-3β、β-catenin、C-Myc表達對比

1～4：正常組、模型組、下調miR-184組、上調miR-184組

3 討 論

據流行病學數據顯示，我國糖尿病發病率在13%左右，其中糖尿病視網膜病變是因糖尿病誘發的以微血管損傷為特征的并發癥之一，其發病率約占糖尿病患者總數的40%〔7〕。微血管長期處于高糖狀態下導致的視網膜微血管代謝能力是導致糖尿病視網膜病變的主要原因，若血糖無法控制則會導致視網膜持續出血，對視力造成影響。持續出血導致視網膜屏障受損，微血管異常增生，對視網膜功能產生影響，導致患者視力下降，嚴重者甚至導致失明〔8〕。

高血糖導致眼底微循環紊亂，激活催化相關酶，促進新生血管發生。在糖尿病大鼠中其視神經纖維軸漿流，導致視神經纖維萎縮，激活誘導凋亡基因，集中視神經損害〔9〕。相關研究發現，Wnt信號傳導通路是一條廣泛存在于度細胞生物體內的具有高度進化保守性的信號通路，該通路對細胞的增生、分化、凋亡具有調節作用，在多種器官發育過程及生命體的眾多病理生理過程中具有重要作用。研究表明，免疫功能維持、炎癥發生、新生血管形成及創傷愈合及組織再生與Wnt信號通路之間具有潛在聯系〔10,11〕。

Wnt信號通路由Wnt配對蛋白、細胞質、細胞膜上受體內的信號傳導部分和細胞核內轉錄調控部分組成。其與視網膜發育、視網膜血管發育、視網膜保護之間密不可分，同時與視網膜疾病之間存在密切聯系〔12,13〕。視網膜中β-catenin表達在糖尿病視網膜病變患者中呈異常高表達，經典Wnt信號通路在糖尿病視網膜病變中處于激活狀態。動物模型中發現，Wnt信號通路共受體低密度脂蛋白受體相關蛋白(LRP5/6)呈現異常表達，分泌型蛋白(Dkk1)抑制劑對視網膜炎癥及新生血管滲漏具由改善作用，同時阻斷活性氧簇產生，Wnt信號通路參與糖尿病視網膜病變的發生發展〔13,14〕。

糖尿病的發生會降低脂蛋白酶活性，從而導致患者血脂水平上升〔15〕。VEGF作為具有特異性的血管內皮細胞生長因子，對血管生成具有誘導作用，在糖尿病視網膜病變發生時，VEGF對血-視網膜屏障造成損傷，同時對血管的通透性產生促進作用導致血漿外滲，對纖維蛋白凝膠形成的同時對內皮細胞增殖及新生血管內向生成產生促進效果。相關研究顯示，VEGF在糖尿病視網膜病變的發生發展過程中發揮重要作用〔16,17〕。TNF-α作為常見的且即為重要的炎性因子，對單核細胞與中性粒細胞具有活化或趨化的作用，同時其能夠促進血管內皮細胞釋放大量凝血因子，強化局部炎性反應作用〔18〕。本研究結果顯示，上調miR-184干預糖尿病視網膜病變模型大鼠可有效調控血脂、血糖水平，改善眼底視網膜環境。

高血糖引起的機體氧化應激反應是糖尿病視網膜病變的主要原因，抗氧化物質GSH水平降低和氧化炎癥因子水平的提高為其主要表現。低水平的GSH和水平升高的NO能夠導致視網膜血流改變，造成白細胞黏滯增加，對視網膜基底膜產生增厚作用，對GSH、NO水平逆轉能夠對視網膜血流產生改善作用〔19,20〕。本文研究結果顯示，上調miR-184干預糖尿病視網膜病變模型大鼠可有效降低血管通透性，從而改善糖尿病誘發的視網膜病變。

楊靜〔21〕研究中表示，對糖尿病大鼠模型眼內的β-catenin基因進行敲除，發現大鼠視網膜新生血管及血管滲漏減少，有效緩解炎性因子的過表達和周細胞缺失，證實Wnt信號通路的激活對糖尿病視網膜病變的發生在具有重要作用。同時研究中表示，大鼠模型中視網膜內的miR-184表達明顯上調，而miR-184對Wnt信號通路具有調節作用，說明miR-184表達水平上升是視網膜Wnt通路異常激活的機制之一〔22,23〕。本文研究結果顯示，Wnt信號通路在糖尿病視網膜病變的發生發展具有重要意義。