抑制內質網應激關鍵信號通路蛋白eIF2α去磷酸化與肝細胞增殖及c-Met表達的關系

陳歡，蔣小鈴，李吉貴，方家琴，馮素敏，何毅懷，陳婭

1 遵義市第五人民醫院內科，遵義 563000；2 遵義醫科大學附屬醫院感染科

肝損傷進展為肝衰竭與肝細胞抗損傷能力低下、肝細胞再生能力等因素相關，因此增強肝細胞抗損傷能力、促進肝細胞增殖是治療肝損傷的基本策略。促肝細胞生長因子（HGF）受體（c-Met）是受體酪氨酸激酶亞家族成員，對細胞生長轉化、細胞周期、細胞抗損傷能力及增殖具有重要作用［1］。研究發現，c-Met 在急性肝衰竭中能夠促進代償性肝再生，是肝病治療的潛在靶點［2］。內質網應激（ERS）是細胞的防御機制之一，對細胞增殖存在廣泛影響。我們的前期研究發現，ERS 可下調c-Met 表達，影響肝細胞增殖，與肝病的發生發展密切相關［3］。ERS 作用于蛋白激酶R 內質網激酶（PERK）/真核細胞起始因子2α（eIF2α）、肌醇激酶1（IRE1）/X 盒結合蛋白1（XBP1）、活化轉錄因子6（ATF6）三條信號通路，通過減少新生蛋白的合成、激活內質網相關降解（ERAD）減輕內質網壓力，恢復內質網穩態［4］。ERS 與肝損傷的發生發展密切相關，但ERS 影響肝細胞增殖的具體分子機制尚不明確。2018年1月—2020年1月，我們通過構建ERS肝細胞模型，探討抑制eIF2α 去磷酸化影響肝細胞增殖及c-Met 表達的潛在機制。

1 材料與方法

1.1 材料 正常人肝細胞株L02購自中國科學院。內質網鈣平衡抑制劑毒胡蘿卜素（TG）、eIF2α 去磷酸化抑制劑Salubrinal 均為Sigma-Aldrich 公司產品；胎牛血清（Gibco），RPMI1640 培養基（Hyclone），青—鏈霉素混合物、0.25%胰酶（索萊寶），DMSO 試劑（Amresco），eIF2α、c-Met單克隆抗體（Santa Cruz），peIF2α、XBP1 單 克隆 抗 體（Cell Signaling），HRD1（SAB4200423，Sigma），GAPDH 多 克 隆 抗 體（ET1601-4）。蛋白質電泳儀（Bio-Rad），ECL 化學發光成像儀（ChemiScope 6000，Clinx），全波長酶標儀（Biotek）。

1.2 細胞培養 取L02細胞，加入含10%胎牛血清的RPMI1640 培養基，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。至細胞生長密度≥85%時進行傳代培養。

1.3 肝細胞ERS模型的構建

1.3.1 細胞分組與干預方法 取1 mg TG 溶于1.537 mL DMSO 中，配制成含1 mg/mL TG 母液，使用前加入含10%胎牛血清培養基稀釋為1 μmol/L的TG 溶液。取對數生長期細胞，隨機分為TG 組和對照組，TG 組加入含1 μmol/L TG 的RPMI1640 培養基，對照組僅加入RPMI1640培養基，培養48 h。

1.3.2 TG 對細胞增殖能力的影響觀察 采用CCK-8 法。于培養0、48 h，取兩組細胞，加入10 μL CCK-8 試劑孵育60 min，置酶標儀450 nm 處測定吸光度（A）值。

1.3.3 TG 對細胞ESR 相關蛋白p-eIF2α、ERAD 通路相關蛋白HRD1 以及c-Met 蛋白表達的影響 采用Western blotting 法。細胞培養0、48 h 時，使用蛋白提取試劑盒按照說明書步驟提取蛋白，用BCA 法檢測蛋白濃度。通過電泳分離肝細胞裂解物，轉移到PVDF 膜上。用TBST 封閉膜，分別加入稀釋的GAPDH、p-eIF2α、HRD1、c-Met 一抗4 ℃孵育過夜。TBST漂洗，加入辣根過氧化物酶標記的抗小鼠或抗兔IgG 二抗，室溫孵育1 h。TBST 漂洗3 次，用ECL試劑盒曝光蛋白條帶，獲得蛋白條帶灰度值。以目標蛋白與GAPDH 蛋白條帶灰度值的比值計算目標蛋白的相對表達量。

1.4 Salubrinal 預處理對肝細胞ERS 及細胞增殖的影響觀察

1.4.1 細胞分組與干預處理 取5 mg Salubrinal溶于208.4 μL DMSO 中，配制成含50 mmol/L Salubrinal的母液，使用前加入含10%胎牛血清培養基稀釋為20 μmol/L。將細胞分為TG 組和Salubrinal+TG組。待細胞生長融合度為70%～80%時，Salubrinal+TG組加入20 μmol/L Salubrinal預處理2 h，然后加入1 μmol/L TG 培養48 h；TG 組加入1 μmol/L TG培養48 h。

1.4.2 細胞增殖能力觀察 采用CCK-8 法檢測兩組細胞增殖能力，步驟參照“1.3.2”。

1.4.3 細胞p-eIF2α、XBP1、HRD1、c-Met 蛋白表達檢測 采用Western blotting 法檢測兩組ESR 相關蛋白p-eIF2α、XBP1，ERAD 通路相關蛋白HRD1，以及c-Met蛋白表達，步驟參照“1.3.3”。

1.5 統計學方法 應用SPSS24.0 統計軟件。計量資料采用Kolmogorov-Smironv法進行正態性檢驗，符合正態分布的資料以± s 表示，兩組間比較采用獨立樣本T檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肝細胞ERS 模型構建結果 與對照組相比，TG 組p-eIF2α、HRD1表達水平升高，c-Met表達水平降低（P均＜0.05）。TG 組ERS 相關蛋白p-eIF2α 表達上調，ERAD 通路激活，表明ERS 細胞模型構建成功。TG 組和對照組細胞增殖A 值分別為2.23 ± 0.18、3.00 ± 0.13，TG 組細胞增殖活力低于對照組（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組細胞p-eIF2α、HRD1、c-Met蛋白表達水平 比較（ s）

表1 兩組細胞p-eIF2α、HRD1、c-Met蛋白表達水平 比較（ s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；

組別TG組對照組p-eIF2α 15.65 ± 1.41*1.00 ± 0.08 HRD1 13.49 ± 1.26*1.00 ± 0.06 c-Met 0.19 ± 0.01*1.00 ± 0.09

2.2 Salubrinal 預處理對肝細胞ERS 及細胞增殖的影響 與TG 組相比，Salubrinal+TG 組細胞p-eIF2α、c-Met 蛋白表達水平升高，XBP1、HRD1 蛋白水平表達降低（P均＜0.05）。見表2。Salubrinal+TG 組和TG 組 細 胞 增 殖A 值 分 別 為2.64 ± 0.19、2.23 ± 0.17，Salubrinal+TG 組細胞增殖活力較TG 組升高（P＜0.05）。

表2 兩組細胞p-eIF2α、XBP1、HRD1、c-Met蛋白表達 水平比較（± s）

表2 兩組細胞p-eIF2α、XBP1、HRD1、c-Met蛋白表達 水平比較（± s）

注：與TG組比較，*P＜0.05。

組別Salubrinal+TG組TG組p-eIF2α 2.46 ± 0.16*1.00 ± 0.06 XBP1 0.54 ± 0.02*1.00 ± 0.07 HRD1 0.68 ± 0.03*1.00 ± 0.07 c-Met 1.77 ± 0.06 1.63 ± 0.09

3 討論

肝臟在受到不同類型的損傷后具有較強的再生能力。肝臟再生的潛力在決定肝臟疾病的結局中至關重要，特別是患有肝功能失代償、肝再生受損的肝纖維、急性肝衰竭的患者［5］。但是，在一些病理條件下，如慢性乙醇攝入、脂肪肝疾病、肝硬化、肝衰竭、膽道梗阻，肝再生是延遲或受損的，其具體機制尚不明確。有研究發現，在急性和慢性肝損傷中，HGF/c-Met 信號對肝細胞和肝祖細胞再生能力具有顯著的促進作用［6］。ERS 是眾多肝臟疾病的常見現象，對肝細胞的增殖與分化存在廣泛影響。內質網是細胞內合成蛋白質、肽鏈折疊、修飾及脂類、糖類合成的重要場所，內質網還通過對鈣的貯存與釋放參與細胞內鈣離子濃度的調節。當細胞受到缺氧、鈣平穩紊亂等刺激引起內質網穩態失衡，使內質網腔內未折疊蛋白、錯誤折疊蛋白聚集，鈣離子濃度改變時，可誘導ERS 發生。ERS 包括未折疊或錯誤折疊在內質網蓄積引起的未折疊蛋白反應（UPR）、正確折疊的蛋白在內質網過度蓄積、激活NF-κB 引發的內質網超負荷反應、膽固醇缺乏引發的膽固醇調節級聯反應。ERS 誘導劑TG 能夠不可逆地阻滯鈣ATP 酶，阻止鈣從細胞質向內質網重吸收，導致ER中鈣濃度降低，抑制鈣依賴性分子伴侶，使錯誤折疊的蛋白質增加，從而誘導ERS［7-8］。本研究采用TG誘導L02 細胞建立ERS 細胞模型，探討ERS 與肝再生之間的潛在關系。結果表明，1 μmol/L TG 可顯著增加肝細胞ERS 相關蛋白p-eIF2α 磷酸化水平，ERAD 通路激活，表明ERS 細胞模型構建成功；肝細胞增殖活力和c-Met 蛋白表達均下降，提示ERS 可下調c-Met蛋白表達，抑制肝細胞的增殖。

目前一般用UPR 來提示ERS 的發生。UPR 有3個應激感受蛋白，即PERK、ATF6、IRE1α，通過這些蛋白發揮作用，增強內質網對蛋白的折疊能力、促進內質網腔的錯誤折疊蛋白降解、減少蛋白質合成，從而恢復內質網的穩態。eIF2α 是調節ERS 的關鍵信號通路蛋白之一。細胞ERS 可激活未折疊蛋白反應，激活PERK 轉化為具有活性的p-PERK，進而磷酸化eIF2α 生成p-eIF2α，p-eIF2α 可抑制eIF2B 催化eIF2·GDP 到eIF2·GTP 交換的功能，使得eIF2 不能被重復利用，降低AUG 啟動密碼子識別率，從而抑制大多數蛋白質合成的啟動過程，抑制細胞整體的蛋白翻譯水平，從而減輕內質網負擔，維持內質網平衡的穩態［9］。p-eIF2α 也可經蛋白磷酸酶1（PP1）作用恢復至eIF2α 非活性狀態。Salubrinal 作為eIF2α去磷酸化抑制劑，通過抑制PP1 活性來抑制p-eIF2α去磷酸化（即保持其磷酸化狀態），減少蛋白合成，從而起到緩解細胞ERS 的作用［10-12］。為了觀察eIF2α對肝細胞中c-Met 表達的影響及機制，本研究用Salubrinal 預處理抑制TG 誘導的ERS 細胞模型eIF2α去磷酸化，結果顯示經過Salubrinal 預處理后，eIF2α磷酸化水平較TG 組顯著增加，ERS 標志蛋白XBP1顯著下降，提示Salubrinal 可以緩解細胞ERS。這與TIAN 等［13］的研究結果相符，即Salubrinal 抑制eIF2α去磷酸化可以減輕細胞ERS。為明確Salubrinal 減輕ERS 后對細胞增殖的影響，隨后檢測了c-Met 蛋白表達和細胞增殖活力，結果顯示經過Salubrinal預處理后，與TG 組相比，c-Met 的下調趨勢可部分逆轉，肝細胞增殖活力部分回升。CHEN 等［11］也得出了類似結果，L02 細胞經Salubrinal 減輕ERS 后，反映再生的標志蛋白Cyclin D1 也得到了部分回升。以上研究表明，Salubrinal 具有抑制蛋白的翻譯作用，但促進再生的指標c-Met 卻部分恢復，提示eIF2α 磷酸化對蛋白質翻譯的抑制作用并不直接調控c-Met蛋白的表達。

ERAD 是ERS 的反應形式之一，其降解機制是IRE1/XBP1/EDEM 信號通路對蛋白質發揮質量控制的關鍵機制，它可以直接作用于錯誤折疊或組裝不完全的前體蛋白，使其逆向轉運進入細胞質并被蛋白酶體降解［14］。HRD1 通過其生物活性域E3 泛素連接酶參與ERAD，促進蛋白質逆轉易位［15］。本研究結果顯示，ERS 能夠上調HRD1，激活ERAD 信號通路；給予Salubrinal 預處理后，XBP1、HRD1 蛋白表達水平較TG 組降低，提示ERAD 及ERS 減弱。c-Met在給予Salubrinal預處理后表達的部分恢復是否與激活內質網相關降解的減弱有關，目前尚不明確，有待進一步研究。

綜上所述，在肝細胞ERS 模型中，抑制eIF2α 去磷酸化可部分恢復肝細胞c-Met 表達，促進細胞存活，其機制可能與反饋減輕ERS 有關。抑制eIF2α去磷酸化有望成為恢復損傷肝細胞增殖的靶點。