抗磷脂綜合征患者血清Tim-3、Gal-9與輔助性T淋巴細胞因子水平相關性分析

姚奇岑，陳維飛，林嬌麗，楊潔

1 海南醫學院第二附屬醫院風濕免疫科，海口 571100；

2 山西醫科大學第一醫院風濕免疫科

抗磷脂綜合征（APS）是一種以抗磷脂抗體（APL）介導的系統性自身免疫病，主要表現為反復動靜脈血栓形成、病態妊娠等，根據APS典型的臨床特點可分為血栓性APS（TAPS）和產科APS（OAPS）。既往認為，APS 的發病機制是APL 介導的凝血和纖溶系統失調，尤其免疫炎癥極少參與TAPS 的發病。但隨著研究的深入，越來越多的證據表明CD4+T 淋巴細胞亞群介導的免疫炎癥參與了APS血栓形成及不良妊娠的發生［1-2］。CD4+T 淋巴細胞在抗原的刺激和相應細胞因子作用下可分化為多種細胞亞群，包括輔助性T（Th）細胞、調節性T（Treg）細胞和濾泡性T 輔助細胞。其中Th 細胞又可分為Th1、Th2、Th17，Th1細胞可分泌γ干擾素（IFN-γ）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）等細胞因子，Th2 細胞可分泌白細胞介素（IL）-4，Th17 細胞可分泌IL-17［3］。T 細胞免疫球蛋白及黏蛋白域分子3（Tim-3）是一種負性共刺激分子，屬于T細胞免疫球蛋白黏蛋白分子家族一員。Tim-3 主要表達在活化的Th1/Th17 等免疫細胞表面，與天然型配體半乳糖凝集素9（Gal-9）結合參與適應性負性免疫調節［4］。新近研究顯示，Tim-3/Gal-9 信號通路通過負性調節機制參與復發性流產等病態妊娠和系統性紅斑狼瘡（SLE）合并APS 等自身免疫性疾病的發病［5-6］，但具體機制尚未明確，研究推測可能通過調節CD4+T 淋巴細胞的分化、凋亡等方式參與發病。本研究通過觀察APS患者血清Tim-3、Gal-9 水平，并分析其水平與Th 細胞相關因子TNFα、IL-17、IL-4 的相關性，初步探討Tim-3、Gal-9 在APS發病機制中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2020 年1 月—2022 年1 月在海南醫學院第二附屬醫院風濕免疫科、介入科、產科及山西醫科大學第一醫院風濕免疫科門診或住院的APS患者65例，男16例、女49例，年齡16～40歲、平均27.5 歲。患者均符合2006 年悉尼國際APS 會議修訂的分類標準［7］，其中OAPS 35 例（OAPS 組）、TAPS 30例（TAPS 組）。排除標準：①合并蛋白C、蛋白S 和抗凝血酶Ⅲ缺陷癥、血栓性血小板減少性紫癜、纖溶異常、腎病綜合征、陣發性夜間血紅蛋白尿、白塞病、口服避孕藥相關的血栓、糖尿病血管病變、血栓閉塞性脈管炎等疾病；②合并染色體異常、藥物等其他原因繼發的妊娠并發癥；③有慢性支氣管、支氣管哮喘以及支氣管擴張等呼吸系統疾病；④合并感染、腫瘤、嚴重腎功能損害和心功能不全。另選擇同期健康查體者30例作為對照組，男8例、女22例，年齡16～42歲、平均26歲。本研究通過海南醫學院第二附屬醫院醫學倫理委員會審查（批號LW2020378），受試者均簽署知情同意書。

1.2 血清Tim-3、Gal-9、TNF-α、IL-17、IL-4 檢測采集受試者空腹靜脈血5 mL，分離血清，-80 ℃保存待測。采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附試驗（ELISA）法檢測Tim-3、Gal-9、TNF-α、IL-17 及IL-4，嚴格按照試劑盒說明操作。

1.3 統計學方法 采用SPSS22.0 統計軟件。采用Kolmogorov-Smirnov 檢驗計量資料是否符合正態分布，符合正態分布的以±s表示，兩組之間連續性變量的比較采用獨立樣本t檢驗；不符合正態分布的以M（Q1，Q3）表示，首先進行方差齊性檢驗，如結果滿足方差齊性，則采用單因素方差分析或t檢驗方法，如不滿足方差齊性，則采用秩轉換檢驗方法。相關性分析采用Spearman 等級相關。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組血清Tim-3、Gal-9 及TNF-α、IL-17、IL-4 水平比較 三組血清Tim-3 水平比較差異無統計學意義（P均＞0.05）；與對照組比較，OAPS、TAPS 組血清Gal-9、TNF-α、IL-4水平均升高，TAPS組血清IL-17水平升高（P均＜0.01）；與OAPS 組比較，TAPS 組血清TNF-α、IL-4水平升高（P＜0.05或＜0.01）。見表1。

表1 三組血清Tim-3、Gal-9及TNF-α、IL-17、IL-4水平比較（pg/mL± s）

表1 三組血清Tim-3、Gal-9及TNF-α、IL-17、IL-4水平比較（pg/mL± s）

注：與對照組比較，*P＜0.01；與OAPS組比較，#P＜0.05。

組別OAPS組TAPS組對照組n 35 30 30 Tim-3 227.4（189.0，290.2）253.1（180.1，413.2）265.2（188.9，311.2）Gal-9 36.0（31.1，54.3）*43.8（36.7，64.0）*23.1（16.8，29.0）TNF-α 24.0（18.9， 36.8）*37.4（28.1，155.9）*#13.5（10.4， 19.4）IL-17 21.9（18.3，23.9）23.4（22.5，24.4）#20.7（17.8，24.2）IL-4 12.6（11.3，13.2）*13.8（13.2，14.4）*#10.9（10.5，13.2）

2.2 APS 患者血清Tim-3、Gal-9 與TNF-α、IL-4、IL-17的相關性 APS患者血清Tim-3與Gal-9水平呈正相關（r=0.536，P＜0.01）。血清Gal-9 與TNF-α 水平呈正相關（r=0.210，P＜0.01），與IL-17、IL-4水平無明顯相關性（r分別為0.013、0.009，P均＞0.05）；血清Tim-3 與血清TNF-α、IL-17、IL-4 水平均無明顯相關性（r分別為0.187、-0.080、-0.125，P均＞0.05）。

3 討論

APS是一種自身抗體介導的系統性自身免疫性疾病，免疫炎癥在其發病機制中具有重要作用，包括由APL 介導的血小板、單核細胞、中性粒細胞、內皮細胞、促炎細胞因子、補體的激活和黏附分子的改變、組織因子上調等［12］。CD4+T 淋巴細胞亞群及相應的細胞因子穩態在自身免疫性疾病的免疫調節中發揮重要作用，其中Th1 和Th17 分泌的TNF-α、IL-17 為促炎因子，而Th2 參與分泌的IL-4 對Th1 和Th17 具有拮抗作用。在正常妊娠過程中，CD4+T 淋巴細胞亞群的穩態對維持正常妊娠至關重要，CD4+T 淋巴細胞亞群失衡可導致病態妊娠的發生［9-10］。Th 細胞參與的免疫炎癥與APS 的血栓事件和病態妊娠的發病機制相關，但其具體機制尚未明確。

研究表明，TNF-α、IL-17等促炎因子與APS血栓事件密切相關［11-13］。TNF-α是由Th1細胞和巨噬細胞釋放的細胞因子，參與局部和全身炎癥，其通過促炎作用參與APS的發病機制［14-15］。BECAREVIC等［16］報道，TAPS 患者TNF-α 表達升高。XIAO 等［17］報道，原發性APS 患者IL-17 表達上調，其機制可能與血栓、血小板減少有關。本研究結果顯示，OAPS、TAPS 組血清TNF-α 水平高于對照組，且TAPS 組高于OAPS組；TAPS 組血清IL-17 水平高于OAPS 組和對照組。這提示CD4+T 淋巴細胞亞群分泌的細胞因子參與APS患者血清炎癥反應，其中發生血栓事件的APS患者血清TNF-α、IL-17 水平更高，TNF-α、IL-17 等促炎因子參與APS的發病，以TAPS更為顯著。

母胎界面免疫系統的精確調節對正常妊娠至關重要，IL-4 水平是維持正常妊娠的重要免疫調節因子。既往研究表明，正常妊娠早期和中期孕婦的血清IL-4水平高于復發性流產患者，而后者的TNF-α/IL-4 比值升高［10］。因此，Th1/Th2 或Th17/Treg 細胞失衡可能會導致APS 不良妊娠事件（如復發性流產等）的發生。研究顯示，早期妊娠的孕婦母胎界面蛻膜NK 細胞表面IL-4 表達升高，而TNF-α 表達下調［12］。本研究結果顯示，TAPS、OAPS 組血清IL-4 水平均高于對照組，且TAPS 組高于OAPS 組。結合本研究OAPS 患者TNF-α、IL-17 和IL-4 水平均低于TAPS，提示OAPS 炎癥等致病因素可能與母胎界面的免疫細胞密切相關。

Gal-9 是一種多面免疫調節劑，廣泛分布于肝、小腸、胸腺、腎、脾臟、肺、心臟和骨骼肌。Tim-3 主要表達于Th1、Th2 和母胎界面的NKT 等免疫細胞表面與Gal-9 結合后發揮負性免疫調節作用［4］。研究顯示，Gal-9 信號通路通過結合細胞表面的Tim-3參與自身免疫的調節功能，分別通過調節巨噬細胞表面Fcγ 受體的表達、下調效應T 細胞和上調Treg細胞的數量發揮抗炎作用，Tim-3、Gal-9 誘導效應T細胞衰竭或凋亡，調節Treg 細胞、單核—巨噬細胞、樹突狀細胞及自然殺傷細胞的活性［18-19］。研究發現，Tim-3、Gal-9 表達失調可引起系統性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病、妊娠并發癥。VAN DEN HOOGEN等［20］報道，APS和系統性紅斑狼瘡患者血清Gal-9水平升高，且與疾病活動度存在一定相關性。本研究結果顯示，APS 患者血清Gal-9 水平高于對照組，而OAPS、TAPS 組比較差異無統計學意義；APS 患者血清Tim-3 水平與對照組比較差異均無統計學意義；相關性分析顯示Gal-9 與Tim-3 呈正相關。分析其原因可能是Tim-3 在患者血清中不升高，Gal-9 可能通過與CD4+T淋巴細胞表面的Tim-3調控CD4+T淋巴細胞凋亡或活化等方式發揮免疫調節的作用。此外，本研究中APS 患者血清Gal-9 與TNF-α 呈正相關，表明負性調節因子Gal-9代償性升高與TNF-α水平升高有關，提示Tim-3/Gal-9 信號通路與Th 細胞相關的細胞因子TNF-α與APS患者的免疫炎癥機制相關。需指出的是，TNF-α 與IL-17 同為促炎因子，在APS 患者血清中升高，但與IL-4 水平無明顯相關性，可能存在其他的作用通路影響，尚無從得知。

綜上所述，APS 患者血清Gal-9 水平升高，血清促炎因子TNF-α、IL-17 水平升高，尤其TNF-α 在血栓性APS 患者中升高更為明顯；血清Gal-9 水平與Th 細胞因子水平存在一定的相關性。本研究尚存在一定的局限性：首先，隊列中的樣本量較小，且僅局限于血清學層面，未測定外周血或母胎界面免疫細胞的Tim-3 表達。其次，APS 存在諸多爭議性，譬如我們的研究未納入標準外自身抗體和非標準介導的APS 患者。未來我們將進一步深入研究，以闡明Tim-3/Gal-9 信號通路是否通過調節CD4+T 淋巴細胞亞群的穩態來參與APS的發病機制。