間充質(zhì)干細(xì)胞源性外泌體治療脊髓損傷的研究進(jìn)展*

張鑫瑞,韓 悅 綜述,耿承奎 審校

(昆明醫(yī)科大學(xué)附屬延安醫(yī)院骨科,云南 昆明 650051)

脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種嚴(yán)重創(chuàng)傷性疾病,導(dǎo)致脊髓功能的損傷[1],患者表現(xiàn)為損傷平面以下運(yùn)動(dòng)和感覺的嚴(yán)重障礙。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一種來源于體內(nèi)多種組織,具有自我更新和多向分化的潛能的細(xì)胞[2]。外泌體(exosomes,Exos)源于MSCs,是一種細(xì)胞分泌物,較MSCs具有一定的優(yōu)勢(shì)[3]。SCI主要分為原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷兩個(gè)病理過程,原發(fā)性損傷是指脊髓受到外力后發(fā)生的損傷,原發(fā)性損傷后會(huì)引起繼發(fā)性損傷[4]。針對(duì)SCI的治療,目前集中治療繼發(fā)性損傷,為了減輕SCI患者的功能障礙,探索新的SCI治療方案是全球都密切關(guān)注的問題,目前Exos是對(duì)SCI治療的研究熱點(diǎn),因此,本文將從MSCs來源Exos對(duì)促進(jìn)SCI后神經(jīng)元細(xì)胞的再生進(jìn)行綜述,現(xiàn)報(bào)告如下。

1 脊髓損傷后神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的程序性死亡,神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制復(fù)雜。SCI后可造成損傷區(qū)域神經(jīng)元的凋亡以及局部微環(huán)境的改變,微環(huán)境的改變對(duì)神經(jīng)元的修復(fù)和再生產(chǎn)生抑制作用,并且經(jīng)過一系列復(fù)雜的反應(yīng)加速了神經(jīng)元的凋亡[5],脊髓神經(jīng)細(xì)胞的凋亡對(duì)SCI的功能和預(yù)后起重要作用。有研究報(bào)道[6],凋亡啟動(dòng)子(Caspase-1、2、4、5、8、9、10)和凋亡執(zhí)行子(Caspase-3、6、7、14)在神經(jīng)元細(xì)胞凋亡中都起到重要作用,可以通過作用于細(xì)胞凋亡信號(hào)通路的下游階段,激活神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡過程,導(dǎo)致發(fā)生凋亡,其中Caspase-3是最重要的分子。雖然通過研究已知一些和神經(jīng)元細(xì)胞凋亡有關(guān)的促進(jìn)因子,但是凋亡仍是一個(gè)復(fù)雜的病理生理過程,具體機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。現(xiàn)在,已被報(bào)道的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡途徑有氧化應(yīng)激反應(yīng)、線粒體途徑和死亡受體途徑,可以為SCI后修復(fù)提供新思路。

1.1 氧化應(yīng)激反應(yīng)

氧化應(yīng)激反應(yīng)是脊髓損傷后氧化和抗氧化作用失衡的一種關(guān)系,氧化大于抗氧化作用,以大量自由基生成為特征,產(chǎn)生負(fù)面作用,導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的發(fā)生[7]。在一般情況下,各組織細(xì)胞可產(chǎn)生抗氧化酶清除產(chǎn)生的自由基,避免自由基對(duì)所在的組織器官帶來損害,但脊髓損傷后,自由基的生成量超出抗氧化酶的清除范圍,導(dǎo)致自由基大量存在于SCI處,對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生損害,最終對(duì)脊髓造成繼發(fā)性損傷。抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)可以對(duì)SCI后神經(jīng)元起到保護(hù)的作用。

1.2 線粒體途徑

線粒體是存在于大多數(shù)細(xì)胞中的半自主細(xì)胞器,能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生供能的作用,并參與細(xì)胞中的多種反應(yīng)。脊髓損傷后,神經(jīng)元細(xì)胞中產(chǎn)生的信號(hào)誘導(dǎo)線粒體中的細(xì)胞色素C(Cytochrome C,Cyt-C)釋放到基質(zhì)中,引起凋亡蛋白酶活化因子-1(Apoptotic Protease Activating Factor-1,APAF-1)激活半胱天冬酶-9(Caspase-9),導(dǎo)致凋亡蛋白酶即半胱天冬酶-3(Caspase-3)被激活,引起神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡。當(dāng)線粒體通透性增加時(shí),引起膜內(nèi)Cyt-C的快速釋放,加速了神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡進(jìn)程[8]。

1.3 死亡信號(hào)途徑

死亡信號(hào)途徑在神經(jīng)細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要作用,死亡信號(hào)途徑中重要的介導(dǎo)因子是調(diào)亡相關(guān)因子(Factor associated suicide,Fas),Fas是腫瘤壞死因子受體家族(Tumor Necrosis Factor Receptor,TNFR)中的一種蛋白,通過跨膜傳遞信號(hào),其在I型受體細(xì)胞基質(zhì)中的結(jié)構(gòu)稱為死亡結(jié)構(gòu)域(Death Domain,DD),可傳遞神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的信號(hào),Fas可與配體在DD結(jié)合,直接作用于Caspase家族中的一些分子,經(jīng)過一系列反應(yīng)激活Caspase-3,導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

2 間充質(zhì)干細(xì)胞治療脊髓損傷

MSCs來源于多能干細(xì)胞,是一類具有自我更新和多向分化潛能的基質(zhì)細(xì)胞,因其增值能力強(qiáng)、來源廣泛、易于分離和保存等特點(diǎn),被廣泛運(yùn)用于各項(xiàng)基礎(chǔ)研究和臨床研究,MSCs通過多種機(jī)制修復(fù)SCI,對(duì)SCI后神經(jīng)元細(xì)胞的再生和神經(jīng)功能恢復(fù)具有促進(jìn)作用。脊髓損傷后造成了損傷區(qū)域神經(jīng)元細(xì)胞的丟失和凋亡,并產(chǎn)生對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞再生有抑制作用的微環(huán)境,MSCs移植可促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞修復(fù)和再生,分化為具有特定功能的神經(jīng)細(xì)胞替代損傷的神經(jīng)細(xì)胞,還可通過旁分泌產(chǎn)生抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗凋亡、促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)釋放的作用[9],調(diào)節(jié)微環(huán)境,促進(jìn)軸突生長。但有研究顯示[10],MSCs移植具有存活率低、靶向性差、成瘤性和低神經(jīng)元分化性,并且在脊髓損傷微環(huán)境中細(xì)胞存活時(shí)間短等,所以在臨床應(yīng)用MSCs具有不穩(wěn)定性和不安全性等。

3 間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體

Exos來源于胞內(nèi)體,細(xì)胞膜內(nèi)陷形成胞內(nèi)體,早期形成的胞內(nèi)體在活性物質(zhì)的積累和其他蛋白質(zhì)的參與下形成晚期胞內(nèi)體,最終形成多囊泡體,多囊泡體與細(xì)胞膜融合后釋放到細(xì)胞外,形成直徑為40～100nm的細(xì)胞外小囊泡,內(nèi)含核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄因子受體和生物活性物質(zhì)[11]。在使用MSCs的早期,Exos被當(dāng)作細(xì)胞代謝的無關(guān)物質(zhì),一直都未對(duì)其進(jìn)行深入研究,直到最近幾年,外泌體的作用才逐漸被人們所關(guān)注。Exos經(jīng)過細(xì)胞的旁分泌后與靶細(xì)胞的受體相結(jié)合,傳遞細(xì)胞間信號(hào)并將所攜帶的物質(zhì)運(yùn)輸至靶細(xì)胞,從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能。間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體(MSCs-Exos)被用于多領(lǐng)域的研究并取得了一定的療效,但在脊髓損傷中運(yùn)用的研究還處于早期階段。MSCs-Exos和MSCs有相似的功能,但MSCs-Exos較MSCs具有穩(wěn)定性高、劑量和濃度易于控制、易于運(yùn)輸和貯存并且無免疫排斥反應(yīng)等特點(diǎn),使其在SCI的治療中更具有優(yōu)勢(shì)。

4 MSCs-Exos治療脊髓損傷

MSCs-Exos對(duì)SCI的治療在近幾年來受到人們的關(guān)注,脊髓損傷后導(dǎo)致脊髓周圍的血管破裂、出血、神經(jīng)元細(xì)胞的軸突斷裂,造成瓦勒變性,進(jìn)而加重軸突壞死、髓鞘分解,從而抑制軸突再生[12]。脊髓損傷后,在原發(fā)性損傷的基礎(chǔ)上發(fā)生繼發(fā)性損傷,加重了損傷的嚴(yán)重程度,對(duì)損傷的預(yù)后起著重要作用,研究發(fā)現(xiàn)[13],MSCs-Exos中的微小RNA(MicroRNA,miRNA)能改善繼發(fā)性損傷,促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞的修復(fù)和再生。

4.1 MSCs-Exo抑制脊髓損傷后的炎癥反應(yīng)

有研究發(fā)現(xiàn)[14]用骨髓干細(xì)胞來源的外泌體(BMSCs-Exos)對(duì)SCI大鼠和小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行處理,結(jié)果抑制了促炎因子水平,并提高了大鼠的運(yùn)動(dòng)功能,在大鼠的神經(jīng)元細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)miRNA-181c的水平升高并且核因子信號(hào)的磷酸化水平受到抑制,說明BMSCs-Exos可以抑制細(xì)胞的炎癥反應(yīng),從而保護(hù)受損的神經(jīng)元細(xì)胞。當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central Nervous System,CNS)受損時(shí),處于靜息狀態(tài)的星形膠質(zhì)細(xì)胞就會(huì)向起到促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡、抑制軸突生長作用的A1型星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化,有研究表明[15]在SCI后BMSCs-Exos抑制A1型星形膠質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化,從而減少了脊髓損傷部位的炎癥反應(yīng),降低了TNF-α、C3等促炎因子的表達(dá)水平,說明BMSCs-Exos可通過抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞向A1型轉(zhuǎn)化,從而起到保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞的作用。

4.2 MSCs-Exo抑制脊髓損傷后的細(xì)胞凋亡

一般來說,神經(jīng)細(xì)胞受損發(fā)生凋亡后是不能再生的,脊髓損傷后神經(jīng)元出現(xiàn)一系列反應(yīng)后導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。miRNA是一類由內(nèi)源基因編碼的非編碼單鏈RNA分子,能參與生物體內(nèi)的病理生理過程,對(duì)細(xì)胞的生長發(fā)育起到重要作用,miRNA與SCI后神經(jīng)元細(xì)胞凋亡、炎癥、氧化應(yīng)激等反應(yīng)密切相關(guān)[16]。有研究證明了[17]將含有miRNA-544的MSCs-Exo注射到SCI大鼠模型中,并分析了其組織的促炎因子的水平,結(jié)果顯示注射了含miRNA-544的MSCs-Exo大鼠神經(jīng)元細(xì)胞的丟失和凋亡減少,并且促進(jìn)了大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)。

4.3 MSCs-Exo促進(jìn)脊髓損傷后神經(jīng)細(xì)胞軸突的生長

神經(jīng)元細(xì)胞軸突的生長在脊髓損傷后神經(jīng)修復(fù)和再生中起著重要作用,生長相關(guān)蛋白43(Growth-associated protein,GAP-43)和神經(jīng)絲蛋白200(Neurofilament protein,NF-200)是軸突生長的重要蛋白。研究表明[18],BMSCs-Exos通過作用于STAT3/GAP-43通路,改善SCI后大鼠的感覺功能,結(jié)果顯示注射了BMSCs-Exos的大鼠細(xì)胞中NF-200染色陽性的數(shù)量增加,轉(zhuǎn)錄激活因子3(Signal transducers and activators of transcription,STAT3)和生長相關(guān)蛋白43(GAP-43)的表達(dá)增加,說明BMSCs-Exos能通過作用于STAT3/GAP-43通路改善大鼠的感覺功能,促進(jìn)軸突再生,進(jìn)而促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞的修復(fù)和再生。SCI后軸突的生長并不是只有一種形式,也不只受單個(gè)因素影響,因此,不同程度的脊髓損傷需要用不同的治療方案來促進(jìn)其軸突的再生。

5 討論

脊髓損傷后會(huì)導(dǎo)致多系統(tǒng)的功能障礙,并且出現(xiàn)繼發(fā)性損傷,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量,為了攻克這一難題,研究人員對(duì)SCI患者提出了諸多治療方案,但臨床效果并不明顯。近年來,間充質(zhì)干細(xì)胞來源Exos治療SCI逐漸被人們所重視,Exos與MSCs相比具有較高的存活率和低免疫原性等優(yōu)勢(shì),被廣泛運(yùn)用于各個(gè)領(lǐng)域的研究。Exos對(duì)脊髓損傷后神經(jīng)元細(xì)胞的修復(fù)和再生有良好的促進(jìn)作用,對(duì)損傷局部微環(huán)境有改善效果,因此對(duì)SCI小鼠治療效果明顯,也可作為載體靶向治療疾病。因Exos被關(guān)注的時(shí)間比較晚,大部分實(shí)驗(yàn)還處于基礎(chǔ)研究階段,其作用和功能需進(jìn)一步探索,但其有望成為今后臨床治療脊髓損傷后神經(jīng)恢復(fù)的有效治療手段。