紫外分光光度法檢測(cè)海南霉素的研究

池可心，姚衛(wèi)蓉?

（江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

海南霉素鈉（C47H79O15Na）是一種廣泛添加在雞、牛、羊等動(dòng)物飼料中的新型一元酸聚醚類抗生素，主要用于防治球蟲病[1]、調(diào)節(jié)生長(zhǎng)代謝[2-3]。海南霉素的上市產(chǎn)品為含 1%海南霉素純品的預(yù)混劑（球克），《中國(guó)飼料藥物添加劑使用規(guī)范》規(guī)定其預(yù)混合飼料規(guī)格為 10 mg/g，目前海南霉素用于預(yù)防球蟲病的使用以500～750 μg/g水平混飼（以海南霉素鈉預(yù)混劑計(jì)）[4]。

目前飼料中海南霉素檢測(cè)定量方法僅有液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[5]，海南霉素鈉預(yù)混劑生產(chǎn)過程中檢測(cè)方式僅有茴香醛衍生法–紫外分光光度法[6]，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)成本高，對(duì)研究人員操作要求高，需要開發(fā)一種成本低、簡(jiǎn)單的方法以滿足在簡(jiǎn)單條件下對(duì)海南霉素快速檢測(cè)方法，同時(shí)為海南霉素鈉預(yù)混劑生產(chǎn)控制中提供一種簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法。

海南霉素沒有發(fā)光基團(tuán)，要通過分光光度法檢測(cè)海南霉素，需要通過衍生法引入發(fā)色基團(tuán)。目前聚醚類藥物常用的衍生劑有茴香醛[6]、香草醛[7]、對(duì)二甲氨基苯甲醛[8]、2,4-二硝基苯肼（DNP）[9]，本文前期嘗試用不同衍生劑對(duì)海南霉素進(jìn)行衍生化，包括DNP、茴香醛[6]、香草醛、對(duì)二甲氨基苯甲醛，發(fā)現(xiàn)除DNP外，都能與海南霉素發(fā)生顯色反應(yīng)。香草醛等衍生劑一般與濃硫酸、濃鹽酸配合使用，加濃酸的目的主要是使羧基脫水、提供酸環(huán)境。香草醛濃酸顯色原理是海南霉素與香草醛發(fā)生雙分子縮合生成共軛雙鍵系統(tǒng)，濃酸使目標(biāo)物分子中羧基脫水，增加雙鍵結(jié)構(gòu)，再經(jīng)雙鍵位移等反應(yīng)生成共軛雙鍵[10-11]，如圖1所示。本文擬利用對(duì)二甲氨基苯甲醛、香草醛衍生，通過調(diào)節(jié)衍生劑濃度、溫度、不同的酸及濃度對(duì)衍生條件進(jìn)行優(yōu)化，以達(dá)到較低的檢測(cè)限，建立一種低成本、操作簡(jiǎn)單的方法檢測(cè)海南霉素，用于快速檢測(cè)飼料、海南霉素鈉預(yù)混劑中海南霉素的含量。

圖1 海南霉素衍生示意圖Fig. 1 Derivative diagram of hainanmycin

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海南霉素標(biāo)準(zhǔn)品：中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；海南霉素鈉預(yù)混劑（含1%海南霉素）：山東勝利生物工程有限公司；香草醛、茴香醛、對(duì)二甲氨基苯甲醛（分析級(jí)）：北京百靈威科技有限公司；鹽酸、硫酸、甲醇、乙醇（分析級(jí)）：上海國(guó)藥集團(tuán)有限公司；雞飼料，石家莊正大飼料。

1.2 儀器與設(shè)備

小型高速粉碎機(jī)：河北本辰科技有限公司；VORTEX-GENIE2型SI可調(diào)速漩渦混合器：美國(guó)Scientific Industries公司；SHZ-B水浴恒鍋：上海晶談儀器制造有限公司；T10系列雙光束紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；干式氮吹儀：上海梓桂儀器有限公司；Thermo Scientific臺(tái)式離心機(jī)：美國(guó) Thermo Fisher Scientific；Milli-Q 超純水系統(tǒng)：美國(guó) Millipore公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 對(duì)二甲氨基苯甲醛衍生劑的制備與檢測(cè)

對(duì)二甲氨基苯甲醛衍生劑：90 mL無水乙醇，加入3 g對(duì)二甲氨基苯甲醛，超聲溶解后置于冰水中，緩緩加入10 mL濃硫酸，混勻，避光保存，兩周內(nèi)有效。

稱取海南霉素鈉標(biāo)準(zhǔn)品用乙醇稀釋至 20～200 μg/mL得到一系列不同濃度稀釋液，取樣品溶液 0.6 mL（以無水乙醇為空白對(duì)照）、顯色劑0.4 mL置于10 mL 具塞試管內(nèi)，渦旋震蕩1 min混勻，放入90 ℃恒溫水浴中5 min，取出試管后用冷水冷卻，在λmax= 600 nm處測(cè)得其吸光度值，以海南霉素濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 香草醛衍生劑的制備與檢測(cè)

香草醛衍生劑：4 g香草醛溶于80 mL乙醇中，攪拌溶解，置于冰水中，緩緩加入20 mL濃鹽酸，搖勻后放置4 ℃冰箱保存，兩周內(nèi)有效。

稱取海南霉素標(biāo)準(zhǔn)鈉鹽標(biāo)準(zhǔn)品用乙醇稀釋至5～50 μg/mL得到一系列不同濃度稀釋液，取樣品溶液 0.6 mL（另取無水乙醇為空白對(duì)照），置于10 mL具塞試管內(nèi)，加入0.4 mL香草醛衍生劑，渦旋震蕩1 min混勻，放入90 ℃恒溫水浴中反應(yīng)5 min，在λmax= 590 nm處測(cè)得其吸光度值，以海南霉素濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，衍生示意如圖1。

1.4 香草醛衍生條件的優(yōu)化

1.4.1 酸種類與濃度對(duì)吸光度值的影響

在反應(yīng)溫度75 ℃、反應(yīng)時(shí)間35 min香草醛濃度4%（g/100 mL）的條件下，加入不同濃度的鹽酸、硫酸配置衍生劑，硫酸濃度分別為2.5%、5%、10%、15%、20%，鹽酸濃度分別為5%、10%、15%、20%、25%，以海南霉素濃度10 μg/mL按照1.3.2檢測(cè)方法分別測(cè)得吸光度值。

1.4.2 香草醛濃度對(duì)吸光度值的影響

固定反應(yīng)溫度75 ℃、反應(yīng)時(shí)間35 min，以鹽酸濃度20%配置衍生劑，香草醛濃度分別為1、2、4、6 g/100 mL，以海南霉素濃度10 μg/mL按照1.3.2檢測(cè)方法分別測(cè)得吸光度值。

1.4.3 反應(yīng)溫度、時(shí)間對(duì)吸光度值的影響

香草醛濃度 4%，鹽酸濃度 20%，配置衍生化試劑，量取衍生化試劑液0.4 mL于10 mL具塞試管中，加入0.6 mL乙醇–海南霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液（海南霉素濃度為10 μg/mL），渦旋震蕩1 min搖勻，分別放置 65、75、85、90 ℃水浴中反應(yīng)5、15、25、35、45、55 min后，取出冷卻至室溫，在590 nm處測(cè)得最大吸光度值。

1.4.4 衍生劑占反應(yīng)總體積比對(duì)吸光度值的影響

香草醛濃度 4%，鹽酸濃度 20%，配置衍生化試劑，量取衍生化試劑0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.7 mL于10 mL具塞試管中，分別加入0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.3 mL的乙醇–海南霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液（海南霉素含量均為10 μg），渦旋震蕩1 min搖勻，置90 ℃水浴中反應(yīng)5 min，取出試管冷卻至室溫，在590 nm處測(cè)得最大吸光度值。

1.4.5 衍生反應(yīng)后產(chǎn)物穩(wěn)定性考察

取樣品溶液0.6 mL海南霉素10 ug/mL（另取乙醇為空白對(duì)照），置于10 mL具塞試管內(nèi)，加入0.4 mL一定濃度的香草醛4%–鹽酸20%乙醇溶液（現(xiàn)用現(xiàn)配），渦旋震蕩 1 min混勻，放入90 ℃恒溫水浴中避光反應(yīng)5 min后在590 nm處測(cè)得其吸光度值，分別在0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、12 h時(shí)間段監(jiān)測(cè)其紫外吸收變化情況，考察其衍生反應(yīng)物的穩(wěn)定性。

1.5 飼料中海南霉素的檢測(cè)

在空白雞飼料中加海南霉素，制得含有5、10、50 mg/kg海南霉素水平的樣品飼。稱取2 g雞飼料，置于50 mL離心管內(nèi)，加入8 mL乙酸乙酯，震蕩提取2 min，放入超聲清洗機(jī)中，超聲提取5 min后，用離心機(jī)5 000 r/min離心5 min后取上清，轉(zhuǎn)移至燒瓶中，于45 ℃旋轉(zhuǎn)加熱蒸發(fā)至近干，然后加入2 mL乙腈復(fù)溶，取出至離心管中，再加入2 mL乙腈飽和正己烷溶液震蕩1 min，用離心機(jī)在5 000 r/min下離心5 min，去除正己烷層溶液，將下層溶液用氮?dú)獯抵两桑尤?0.6 mL 90%乙醇溶液復(fù)溶，轉(zhuǎn)移至10 mL具塞量筒中，按照方法3.2.5進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)得590 nm處吸光度值，用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算回收率。

因?yàn)轱暳匣|(zhì)在與香草醛衍生化時(shí)會(huì)有基質(zhì)干擾，需要用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。空白飼料提取凈化后，用0.6 mL 5～50 μg/mL海南霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液復(fù)溶，按照方法 1.3.2進(jìn)行測(cè)定繪制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 預(yù)混劑中海南霉素的檢測(cè)

對(duì)海南霉素鈉預(yù)混劑提取溶劑進(jìn)行優(yōu)化，在2 g海南霉素鈉預(yù)混劑，分別加入10 mL甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、異辛烷，震蕩 2 min，超聲提取5 min，取0.5 mL定容至100 mL，取100 μL按照方法1.3.2進(jìn)行檢測(cè)。

1.7 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)至少進(jìn)行三次，用SPSS 25.0和EXCEL 2021對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析，Origin 2021b軟件進(jìn)行作圖處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 對(duì)二甲氨基苯甲醛法

對(duì)二甲氨基苯甲醛對(duì)海南霉素衍生后，最大吸收波長(zhǎng)在 600 nm處，對(duì)二甲氨基苯甲醛衍生條件進(jìn)行優(yōu)化，包括衍生劑濃度、衍生反應(yīng)溫度、酸的種類及濃度等。在優(yōu)化條件下結(jié)果見圖2所示，其最低檢測(cè)濃度為20 μg/mL，海南霉素濃度在 20～200 μg/mL與吸光度值線性擬合良好，R2＞0.99，但由于該方法檢測(cè)限高，不能滿足檢測(cè)飼料中低濃度的要求，因此此方法僅能適用于檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品溶液和預(yù)混劑中高濃度海南霉素檢測(cè)。

圖2 對(duì)二甲氨基苯甲醛衍生海南霉素紫外分光圖和線性回歸擬合圖Fig. 2 UV spectra and linear regression fitting of Hainanmycin derivatived by p-methylaminobenzaldehyde

2.2 香草醛法

香草醛對(duì)海南霉素衍生后，最大吸收波長(zhǎng)在590 nm處，對(duì)香草醛衍生條件進(jìn)行優(yōu)化，衍生劑濃度、溫度，使用酸濃度等，如圖3所示其最低檢測(cè)濃度為5 μg/mL，海南霉素濃度與吸光度值線性擬合均良好，R2大于0.99，能滿足檢測(cè)飼料中低濃度的要求，此方法能適用于檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品溶液、飼料中常量級(jí)海南霉素檢測(cè)、預(yù)混劑中高濃度海南霉素檢測(cè)。

圖3 香草醛衍生海南霉素紫外分光圖和線性回歸擬合圖Fig. 3 UV spectra and linear regression fitting of vanillin-derived hainanmycin

2.3 酸種類與濃度對(duì)香草醛衍生吸光度值的影響

如圖4所示，使用不同濃度硫酸、鹽酸配置香草醛衍生劑，在相同的反應(yīng)條件下，香草醛衍生劑使用硫酸、鹽酸的最佳濃度分別為10%、20%時(shí)效果最好，使用20%鹽酸時(shí)效果優(yōu)于10%硫酸，因此，決定使用20%鹽酸作為香草醛衍生劑的使用酸及濃度。

圖4 不同酸及使用濃度對(duì)海南霉素衍生化效果Fig. 4 Effect of different acids and concentrations on derivative hainanmycin

2.4 香草醛濃度對(duì)香草醛衍生吸光度值的影響

在相同反應(yīng)條件下，75 ℃水浴加熱35 min，以鹽酸濃度為20%，香草醛濃度分別為1、2、4、6 g/100 mL配置不同香草醛含量的衍生劑，結(jié)果如圖5所示，隨著香草醛濃度的升高，衍生效果越好，當(dāng)香草醛含量為 4%時(shí)，在海南霉素相同濃度下衍生產(chǎn)物吸光度值最高，當(dāng)再增加香草醛的含量時(shí)，衍生效果反而變差、吸光度值下降，因此選擇香草醛含量為4%時(shí)配置衍生劑。

圖5 不同香草醛濃度衍生劑衍生效果Fig. 5 Effects of different vanillin concentration derivatives on derivatization

2.5 反應(yīng)溫度、時(shí)間對(duì)香草醛衍生吸光度值的影響

如圖6所示，在反應(yīng)溫度 65 ℃時(shí)，吸光度值隨著反應(yīng)時(shí)間的增加而呈現(xiàn)緩慢增加的趨勢(shì)；在反應(yīng)溫度 75 ℃時(shí)，吸光度值隨著反應(yīng)時(shí)間先增加后降低的趨勢(shì)，反應(yīng)時(shí)間為35 min時(shí)吸光度值達(dá)到最大；在反應(yīng)溫度85 ℃時(shí)，吸光度值隨著反應(yīng)時(shí)間先增加后降低的趨勢(shì)，反應(yīng)時(shí)間為15 min時(shí)吸光度值最高；反應(yīng)溫度 90 ℃時(shí)，在 5 min時(shí)吸光度值就達(dá)到最高，隨著反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)吸光度值下降，乙醇逐漸蒸干，海南霉素也可能在高溫下分解。因此選擇溫度90 ℃、時(shí)間5 min作為最佳反應(yīng)時(shí)間和溫度。

圖6 不同反應(yīng)溫度和時(shí)間對(duì)香草醛衍生海南霉素的影響Fig. 6 Effect of different reaction temperature and time on vanillin-derived hainanmycin

2.6 衍生劑占反應(yīng)總體積比對(duì)香草醛衍生吸光度值的影響

如下圖7所示，控制反應(yīng)總體積為1 mL，隨著衍生劑占反應(yīng)總體積比增高，吸光度值呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)。衍生化試劑與乙醇溶液反應(yīng)體積比4∶6時(shí)，吸光度值達(dá)到最大；體積占比超過 4∶6后，吸光度值逐漸降低，可能衍生化試劑濃度過高影響其與香草醛發(fā)生縮合，導(dǎo)致海南霉素反應(yīng)不充分，因此選擇最適宜的衍生化體積比為4∶6。

圖7 衍生劑體積與乙醇反應(yīng)體積比對(duì)海南霉素衍生化影響Fig. 7 Effect of the ratio of derivative volume to ethanol reaction volume on the derivatization of hainanmycin

2.7 香草醛衍生反應(yīng)后產(chǎn)物穩(wěn)定性考察

如圖8所示，此顯色反應(yīng)很穩(wěn)定，反應(yīng)后產(chǎn)物在1 h內(nèi)吸光度下降不足5%，且在12 h內(nèi)顯色度都無明顯變化。因此，此衍生反應(yīng)生產(chǎn)的衍生物很穩(wěn)定，能夠滿足檢測(cè)需求。

圖8 顯色反應(yīng)穩(wěn)定性Fig. 8 Color reaction stability

2.8 香草醛其他聚醚類抗生素衍生反應(yīng)

用香草醛同樣對(duì)馬杜霉素、莫能菌素[12]、鹽霉素進(jìn)行衍生反應(yīng)（20 μg/mL），在400～800 nm波長(zhǎng)掃描下，如下圖9所示，其各自最大吸收波長(zhǎng)分別為464、517、522 nm，與海南霉素590 nm能夠明顯區(qū)分開來，說明香草醛衍生海南霉素的衍生產(chǎn)物具有可分辨的獨(dú)特性。

圖9 香草醛衍生不同聚醚類藥物的紫外光譜圖Fig. 9 UV spectrum of vanillaldehyde derived different polyether drugs

2.9 飼料中海南霉素的提取溶劑選擇

稱取2 g雞飼料，分別使用不同的提取試劑乙酸乙酯、乙腈、甲醇、異辛烷、90%乙腈水按照1.5方法進(jìn)行提取凈化，并用香草醛衍生劑按照方法1.3.2進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)得590 nm處吸光度值，用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算回收率。如圖10所示，乙酸乙酯的回收率較高，因此使用乙酸乙酯作為飼料中海南霉素的提取溶劑。

圖10 不同溶劑提取飼料中海南霉素回收率（n=3）Fig. 10 Recovery rate of hainanmycin from feed by different solvents (n=3)

2.10 預(yù)混劑中海南霉素的提取溶劑選擇

對(duì)比甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、異辛烷提取海南霉素鈉預(yù)混劑（1%海南霉素）的回收率，結(jié)果圖11所示，相同的條件下，甲醇的回收率最高，理論回收率高達(dá)93.3%～100.0%，乙醇、甲醇、乙酸乙酯次之，甲醇更適用于海南霉素鈉預(yù)混劑的提取，回收率最高。

圖11 不同溶劑提取海南霉素鈉預(yù)混劑回收率（n=3）Fig. 11 Recovery rates of hainanmycin sodium premix extracted with different solvents

2.11 方法學(xué)考察

2.11.1 飼料中海南霉素的檢測(cè)

前處理按照方法 1.3.2進(jìn)行，海南霉素 5～50 μg/mL濃度范圍內(nèi)，計(jì)算出飼料基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線為 y = 0.021 9x + 0.044 4，R2＞0.99，由 3σ/K計(jì)算出LOD為1.6 μg/g，定量限為4.8 μg/g。雞飼料在5、10、50 μg/g海南霉素加標(biāo)水平下，每個(gè)加標(biāo)水平三個(gè)平行，回收率如表1所示，在75%～94%，通過分析這些加標(biāo)樣品，計(jì)算日內(nèi)精密度，一天重復(fù)3次。日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.1%～11.2%，小于 15%，能夠滿足飼料中海南霉素檢測(cè)需求。

2.11.2 市場(chǎng)產(chǎn)品的實(shí)際檢測(cè)結(jié)果

由山東勝利公司提供的海南霉素鈉預(yù)混劑（1%海南霉素），按照方法 1.6進(jìn)行提取，按照1.3.2香草醛衍生法方法進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算預(yù)混劑中海南霉素含量，每個(gè)樣品三個(gè)平行，一天重復(fù)三次計(jì)算日內(nèi)相對(duì)精密度。結(jié)果如表2所示，本方法的回收率在 83%～101%，日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏為4.7%～5.7%，均小于15%，滿足檢測(cè)需求。

表2 市場(chǎng)產(chǎn)品的實(shí)際檢測(cè)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 2 Recovery rate and relative standard deviation of hainanmycin %

3 結(jié)論

本文通過對(duì)二甲氨基苯甲醛法、茴香醛法對(duì)海南霉素進(jìn)行衍生，能夠?qū)︼暳稀㈩A(yù)混劑中海南霉素檢測(cè)。同時(shí)優(yōu)化了飼料和預(yù)混劑中海南霉素的提取條件，乙酸乙酯用于飼料中提取、甲醇用于海南霉素鈉預(yù)混劑提取效果較好，香草醛衍生法在飼料和預(yù)混劑中回收率分別 75%～94%、83%～101%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為 2.7%～8.4%、5.2%～7.3%，方法靈敏度高、特異性強(qiáng)、簡(jiǎn)單快速，且能夠與其他聚醚類抗生素與香草醛衍生后的產(chǎn)物區(qū)分開來（最高吸收波長(zhǎng)不同），香草醛衍生后海南霉素590 nm，鹽霉素522 nm，馬杜霉素464 nm，可以作為測(cè)定飼料和海南霉素鈉預(yù)混劑中海南霉素含量的一種有效手段。