分子印跡固相萃取–高效液相色譜法的優(yōu)化及在測(cè)定植物油中苯并(a)芘含量的應(yīng)用

李文廷，劉 玲,2，夏加恩，董玉英，冉亞莉，趙 麗?

（1. 昆明市疾病預(yù)防控制中心，云南 昆明 650228；2. 昆明醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院, 云南 昆明 650500；3. 昆明市東川區(qū)疾病預(yù)防控制中心, 云南 昆明 654100）

食用植物油是居民膳食的重要組成部分，也是補(bǔ)充人體所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的重要來(lái)源[1-2]。據(jù)報(bào)道中國(guó)居民平均每標(biāo)準(zhǔn)人日食用植物油的攝入量為37.1 g，食用油與人們的生活、健康息息相關(guān)，隨著經(jīng)濟(jì)社會(huì)的發(fā)展及人們營(yíng)養(yǎng)健康意識(shí)的增強(qiáng)，植物油在人體健康與疾病預(yù)防方面的影響受到極大重視，食用油的質(zhì)量和安全性問(wèn)題主要來(lái)自油料作物的種植、收獲、儲(chǔ)存、加工和使用等環(huán)節(jié)，特別是食用油品在加工環(huán)節(jié)的污染狀況引發(fā)人們的廣泛關(guān)注[3-5]。

苯并(a)芘[benzo(a)pyrene]為多環(huán)芳烴類(lèi)化合物，是世界上排名前三的強(qiáng)烈致癌性物質(zhì)。苯并芘是由脂肪、膽固醇、蛋白質(zhì)和碳水化合物等在高溫烘烤、干燥、熏制和烹調(diào)（煎、炸、烤、炒等）加工過(guò)程中，發(fā)生熱裂解、環(huán)化和聚合等反應(yīng)形成，主要通過(guò)飲食進(jìn)入人體，對(duì)人體很多器官例如眼睛，乳腺等造成危害[6-10]。我國(guó)標(biāo)準(zhǔn)GB 2762—2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中污染物限量》[11]規(guī)定了植物油中苯并(a)芘的限量為10 μg/kg。許多植物油如芝麻油、亞麻籽油、菜籽油等加工工藝采用壓榨法需要高溫炒籽，若溫度控制不佳就易導(dǎo)致苯并(a)芘超出國(guó)家限量標(biāo)準(zhǔn)[12-13]。地溝油中苯并芘的檢出率及超標(biāo)率均保持高位值，并且地溝油流入市場(chǎng)的事件也是時(shí)有發(fā)生[14]，因此，對(duì)于食用植物油中苯并(a)芘的檢測(cè)尤為重要，保障居民對(duì)植物油食用的安全性。

目前，苯并芘的檢測(cè)方法主要有熒光分光光度法、高效液相色譜、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等[15-22]，熒光分光光度法的樣品前處理步驟較為復(fù)雜，靈敏度較低，質(zhì)譜法中苯并芘的碎片特征離子峰響應(yīng)值較低，不易進(jìn)行定性定量，而液相方法具有較高的靈敏度及較便捷的樣品處理方法。食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法 GB 5009.27—2016《食品中苯并(a)芘的測(cè)定》[23]推薦的檢測(cè)方法主要是利用中性氧化鋁固相萃取小柱或分子印跡固相萃取小柱對(duì)樣品進(jìn)行凈化。中性氧化鋁固相萃取柱對(duì)于其他種類(lèi)的樣品較為理想，但通過(guò)實(shí)驗(yàn)分析后，對(duì)于食用植物油的處理仍存不足之處，樣品過(guò)柱經(jīng)氮吹或旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮時(shí)，油脂較難去除，耗時(shí)較多，影響后續(xù)上機(jī)測(cè)定分析，對(duì)于批量樣品的監(jiān)測(cè)較難開(kāi)展，而使用分子印跡固相萃取凈化柱進(jìn)行樣品前處理，具有操作便捷，有機(jī)試劑消耗較少，省時(shí)高效，樣品處理后凈化效果相對(duì)比較高，干擾色譜峰較少。有文獻(xiàn)報(bào)道采用分子印跡固相萃取小柱對(duì)植物油苯并芘的萃取凈化效果驗(yàn)證[24]，通過(guò)兩種固相萃取凈化柱比對(duì)植物油中苯并芘的凈化效能[25]，使用串聯(lián)固相萃取凈化小柱去除油脂干擾成分研究[26]，而本文針對(duì)以上方法中存在的問(wèn)題缺點(diǎn)以及結(jié)合實(shí)驗(yàn)分析過(guò)程中檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行了研究，通過(guò)兩種固相萃取凈化效果分析，最佳檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇，多種流動(dòng)相配比分離效果研究以及不同規(guī)格色譜柱選擇的考察，最終確定相關(guān)色譜技術(shù)的優(yōu)化條件，針對(duì)植物油樣品建立具有分析簡(jiǎn)單、高效便捷、準(zhǔn)確性好、回收率高等優(yōu)點(diǎn)測(cè)定苯并(a)芘的方法，使其應(yīng)用于特別是批量的食用植物油樣品中苯并(a)芘的準(zhǔn)確定量，對(duì)相關(guān)基層檢測(cè)部門(mén)具有指導(dǎo)意義，為政府職能部門(mén)提供技術(shù)及數(shù)據(jù)支持，保障居民的食品安全及大眾健康。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣品

本實(shí)驗(yàn)樣品：市售抽查樣品，包括30件菜籽油、5件花生油、4件芝麻油、1件玉米油、1件核桃油，共計(jì) 41件，其中 83%的樣品采集于農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)小作坊制作成品。

1.2 儀器與試劑

超高效液相色譜儀U3000：美國(guó)ThermoFisher公司；分析天平XS205DU：瑞士Mettler Toledo公司；智能臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)3H16RI：湖南赫西儀器裝備有限公司。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)苯并芘：中國(guó)計(jì)量研究院；中性氧化鋁柱和分子印跡柱：普瑞邦（中國(guó)）公司；甲醇和乙腈均為色譜純。

1.3 色譜條件

色譜柱為Agilent Eclipse Plus C18柱（4.6 mm×150 mm, 5.0 μm），柱溫為 35 ℃，激發(fā)波長(zhǎng)：365 nm，發(fā)射波長(zhǎng)410 nm，流動(dòng)相A相：乙腈，B相：水，流動(dòng)相配比為90%乙腈+10%水，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣體積為20 μL，分析運(yùn)行時(shí)間為10.0 min。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

乙腈中苯并(a)芘標(biāo)準(zhǔn)使用液(100 μg/L)：準(zhǔn)確定量量取苯并(a)芘標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于100 mL容量瓶中，用乙腈定容，用于標(biāo)準(zhǔn)曲線制作實(shí)驗(yàn)分析，避光保存在0～5 ℃的冰箱中。

1.4.2 樣品前處理

稱(chēng)取0.400 g植物油樣品，加入5.0 mL正己烷并旋渦混合0.5 min，采用苯并(a)芘分子印跡柱進(jìn)行固相萃取凈化，先依次用5.0 mL二氯甲烷及5.0 mL正己烷將柱子活化，樣品溶液轉(zhuǎn)移到柱子，待液面降至柱床時(shí)，用6.0 mL正己烷淋洗柱子，棄去流出液。用6.0 mL二氯甲烷洗脫并收集，接著在40 ℃下氮?dú)獯蹈桑瑴?zhǔn)確吸取1.0 mL乙腈渦旋復(fù)溶0.5 min，過(guò)0.22 μm濾膜后待測(cè)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采集到的數(shù)據(jù)使用Chromeleon 7.lnk進(jìn)行定性定量分析，樣品分析時(shí)通過(guò)樣品色譜峰保留時(shí)間進(jìn)行定性，通過(guò)峰面積進(jìn)行定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 凈化方法的選擇

進(jìn)行兩種凈化柱凈化效果的考察，樣品經(jīng)正己烷溶解過(guò)中性氧化鋁柱，洗脫后分別采取直接氮吹法和減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法兩種方法進(jìn)行濃縮，經(jīng)1 h長(zhǎng)時(shí)間的濃縮均較難將油脂徹底去除，經(jīng)乙腈復(fù)溶后，提取效果欠佳，整個(gè)前處理步驟所需溶劑及處理時(shí)間均較多，嚴(yán)重影響工作效率，不適宜批量樣品的處理。苯并芘分子印跡柱凈化實(shí)驗(yàn)則較為高效，且凈化效果相對(duì)較為理想，樣品通過(guò)柱子凈化洗脫后，可直接進(jìn)行氮吹濃縮，10 min即可近干，加入乙腈溶解過(guò)濾膜后即可上機(jī)測(cè)定分析，所需試劑及處理時(shí)間均較少，顯著提高了工作效率，特別適用于大批量樣品的處理，因此采取苯并芘分子印跡柱凈化方法進(jìn)行樣品前處理，凈化效果如圖1所示。

圖1 加標(biāo)樣品經(jīng)固相萃取凈化后的色譜圖Fig.1 Chromatograms of spiked samples purified by solid phase extraction

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的考察

根據(jù)文獻(xiàn)查閱，目前苯并芘的檢測(cè)波長(zhǎng)各異，通過(guò)選擇不同的激發(fā)波長(zhǎng)（Excitation wavelength，Ex）和發(fā)射波長(zhǎng)（Emission wavelength，Em），在相同色譜條件對(duì) 10.0 μg/L苯并芘標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣1.0 μL進(jìn)行測(cè)定考察分析，如表1實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，苯并芘的響應(yīng)強(qiáng)度具有較大差異，在Ex / Em 384 nm/406 nm的條件下，雖然具有較大響應(yīng)強(qiáng)度，但也具有較高的噪聲值，進(jìn)而使信噪比降低，綜合信噪比數(shù)據(jù)，選擇Ex / Em 365 nm/410 nm為苯并芘的測(cè)定波長(zhǎng)，具體色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 不同檢測(cè)波長(zhǎng)的色譜圖Fig.2 Chromatogram at different detection wavelengths

表1 不同檢測(cè)波長(zhǎng)的色譜參數(shù)Table 1 Chromatographic parameters for different detection wavelengths

2.3 流動(dòng)相考察

分別對(duì)流動(dòng)相組成和配比進(jìn)行考察，如圖3所示，當(dāng)有機(jī)相為乙腈時(shí)，隨著有機(jī)相比例增加，苯并芘色譜峰保留時(shí)間逐漸變小。當(dāng)有機(jī)相為甲醇時(shí)，苯并芘的分離情況相對(duì)較差，但混合乙腈時(shí)有較大改善，具體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。

圖3 不同流動(dòng)相的色譜圖Fig.3 Chromatogram of different mobile phases

表2 流動(dòng)相考察Table 2 Mobile phase inspection

改變流動(dòng)相配比情況進(jìn)行目標(biāo)化合物分離效果分析，80%甲醇洗脫的色譜峰已經(jīng)出現(xiàn)較大峰寬，峰型出現(xiàn)前沿及不對(duì)稱(chēng)情況，70%甲醇洗脫時(shí)已沒(méi)有明顯的色譜峰顯示，60%乙腈和60%甲醇進(jìn)行沖洗，未檢測(cè)到色譜峰，根據(jù)色譜圖出峰情況分析，從圖中可以看出，乙腈作為流動(dòng)相比較適合苯并芘的洗脫，具有較高的響應(yīng)，甲醇作為洗脫流動(dòng)相未有理想的洗脫效果，因此選擇90%乙腈–10%水作為苯并芘的洗脫流動(dòng)相。具體譜圖情況如圖3所示。

由于樣品基質(zhì)較為復(fù)雜，從樣品加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)的色譜圖圖4可以看出，前期有較大的溶劑雜質(zhì)峰，若再增加有機(jī)相的比例，目標(biāo)峰和雜質(zhì)峰將會(huì)重疊，達(dá)不到目標(biāo)峰的分離效果，所以不適合用純的有機(jī)相進(jìn)行苯并芘的洗脫。

圖4 樣品加標(biāo)回收色譜圖Fig.4 Standard-added recovery chromatogram

2.4 色譜柱選擇

分別考察了采用Phenomenex C18柱（4.6 mm×250 mm, 5.0 μm）250 mm 及 Agilent Eclipse Plus C18柱（4.6 mm×150 mm, 5.0 μm）對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)分析情況，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果分析不同色譜柱柱效，使用相同的流動(dòng)相條件進(jìn)行洗脫時(shí)，短柱子能有效提高工作效率，減少試劑的使用量，經(jīng)濟(jì)環(huán)保。如圖5顯示，色譜峰保留時(shí)間具有較大差異，所以選擇150 mm的柱子進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析。

圖5 不同柱長(zhǎng)的分離色譜圖Fig.5 Separation chromatograms of different column lengths

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系

用乙腈將苯并芘標(biāo)準(zhǔn)使用液稀釋制備成濃度為 0.3、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/L 的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，在上述條件下進(jìn)行測(cè)定，以濃度X為橫坐標(biāo)、峰面積Y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行線性回歸，在0.3～20 μg/L 范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，線性方程為y=6 640.404 4x+0.301 7，相關(guān)系數(shù)r=0.999 9。標(biāo)準(zhǔn)曲線色譜圖重疊圖見(jiàn)圖6所示，保留時(shí)間標(biāo)準(zhǔn)偏差為 0.35%，說(shuō)明重復(fù)性較穩(wěn)定，以 3倍信噪比計(jì)算得方法檢出限0.05 μg/kg，以 10倍信噪比得方法定量限 0.10 μg/kg，滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)定量要求。

圖6 標(biāo)準(zhǔn)曲線色譜重疊圖Fig.6 Standard curve chromatogram overlay

2.5.2 方法回收率

選取苯并芘本底值未檢出的樣品，進(jìn)行分子印跡柱凈化方式的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)使?jié)舛葹?.0、5.0、10.0 ng/mL，按照樣品前處理?xiàng)l件進(jìn)行處理并上機(jī)測(cè)定，每個(gè)添加濃度做6個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，方法的平均回收率為87.6%～95.9%，RSD為1.08%～2.16%，數(shù)據(jù)見(jiàn)表3，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明分子印跡柱凈化方法具有較高的回收率，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差較小，處理植物油中苯并芘較為理想。

表3 苯并芘的加標(biāo)回收率和精密度（n=6）Table 3 Scaling recovery rate and precision of benzopyrene (n=6) %

2.5.3 方法重復(fù)性

選取苯并芘本底值檢出的樣品進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)分析，精確稱(chēng)取樣品6份，按照樣品前處理?xiàng)l件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差作為方法的精密度，精密度為 1.13%，表明實(shí)驗(yàn)方法的重復(fù)性較強(qiáng)。檢測(cè)數(shù)據(jù)見(jiàn)表4。

表4 苯并芘的精密度（n=6）Table 4 Precision of benzopyrene (n=6)

2.6 實(shí)際樣品檢測(cè)

按照上述實(shí)驗(yàn)方法對(duì)市場(chǎng)銷(xiāo)售的 41份樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢出16份，檢出率為39.0%。其中菜籽油檢出為13份，菜籽油檢出率為43.3%，占檢出樣品的 81.2%；花生油、芝麻油和核桃油各檢出1份，分別占檢出樣品的6.2%。散裝樣品檢出9份，散裝樣品檢出率為 47.4%，占檢出樣品的56.2%；預(yù)包裝樣品檢出 7份，預(yù)包裝樣品檢出率為 38.9%，占檢出樣品的 43.8%。根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2762—2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中污染物限量》規(guī)定，植物油中苯并(a)芘的限量為10 μg/kg，共計(jì) 1份樣品超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)限值，超標(biāo)率為2.4%。檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明散裝植物油的檢出率比預(yù)包裝的高，菜籽油的檢出率遠(yuǎn)高于其它類(lèi)型的植物油，超標(biāo)的樣品為榨油小作坊制造的散裝菜籽油。實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果表明，所采集的植物油合格率為97.6%，整體上植物油的食用較為安全。

3 結(jié)論

通過(guò)優(yōu)化的分子印跡固相萃取超高效液相色譜檢測(cè)方法對(duì)植物油中苯并（α）芘含量進(jìn)行檢測(cè)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，分子印跡固相萃取柱更加適合處理植物油樣品，樣品經(jīng)分子印跡柱萃取凈化后干擾基質(zhì)較少，采用優(yōu)化的檢測(cè)波長(zhǎng)及流動(dòng)相條件，苯并芘具有較好的色譜峰響應(yīng)值及信噪比，選擇短程柱子能有效提高工作效率。該方法具有回收率高，精密度好，結(jié)果穩(wěn)定，操作過(guò)程便捷，所需時(shí)間及試劑均較少，對(duì)環(huán)境比較友好，便于提高日常檢測(cè)工作效率，更加滿(mǎn)足于當(dāng)前快節(jié)奏、多任務(wù)和樣品量多的檢測(cè)要求，適用于食用植物油中苯并芘的批量檢測(cè)及污染監(jiān)測(cè)情況分析。但該方法中所使用的固相萃取柱存在成本問(wèn)題，后續(xù)可開(kāi)展液液萃取樣品中苯并芘的研究，減少檢測(cè)成本的投入，更加簡(jiǎn)化樣品的前處理步驟，提高工作效率。