MALDI-TOF技術在重癥肺炎痰液樣本病原菌檢測和鑒定中的應用

劉亞榮 羅軍 李冰瑤

（1. 電子科技大學醫學院附屬綿陽醫院，四川 綿陽 621000；2. 綿陽市中心醫院醫學檢驗科，四川 綿陽621000）

重癥肺炎作為一種常見的急危重癥，具有發病率高、病情進展迅速等特點，易危及患者生命安全[1]。重癥肺炎多由毒力極強的革蘭陽性或陰性菌感染所致，病情嚴重，進展迅速，常發生各種嚴重并發癥，如不及時救治，可危及生命。因此，快速檢測鑒定重癥肺炎患者病原菌類型，以采取針對性抗生素治療成為臨床備受關注的問題[2]。傳統的病原菌鑒定通常采用菌落形態、染色、顯微鏡檢查、趨向性試驗以及自動化鑒定儀等鑒定方法，但其操作過程繁瑣、鑒定時間過長、主觀性較強，不能及時提供病原學診斷結果。因此，尋找一種快速、可靠的病原菌鑒定方法對臨床病原學診斷具有重要意義。基質輔助激光解吸電離飛行時間（Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight，MALDI-TOF）技術是近年來飛速發展起來的一種新型軟電離質譜技術，主要用于微生物鑒定，MALDI-TOF技術主要原理是利用不同菌種核糖體蛋白大小存在差異，通過檢測病原菌保守且獨特的蛋白峰特征性質圖譜，將檢測所得圖譜與已知菌種數據庫參考圖譜作對比，以得到病原菌鑒定結果[3,4]。該技術具有方便、快速、高通量、特征性強且實驗成本較低等優點，已在微生物領域尤其是細菌鑒定中得到廣泛運用[5]。然而目前該技術在肺炎痰液樣本病原菌臨床檢測中應用研究較少，對此，本研究通過將MALDI-TOF技術與VITEK-2 Compact全自動微生物鑒定系統（VITEK 2 Compact automatic microbial analyze，VITEK-2）鑒定技術進行比較，以觀察MALDI-TOF技術在重癥肺炎痰液樣本病原菌檢測和鑒定中的實際應用效果，旨在為臨床及時進行抗感染治療提供有利參考，現將其過程整理報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取我院2021年7月至2021年12月收治的214例重癥肺炎患者為研究對象，其中男126例，女88例；平均年齡44.17±11.62 歲；平均病程4.81±0.74 d。

納入標準：診斷為重癥肺炎患者[6]；患者均進行痰液樣本培養、檢測；患者了解并愿參與此次研究。排除標準：惡性腫瘤患者；合并血液系統性疾病者；感染病患者。本研究經醫學倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 基因測序

提取晨起時患者痰液樣本病原菌菌株，使用DNA提取試劑盒（賽默飛世爾科技(中國)有限公司）提取病原菌菌株DNA，將提取的DNA使用核酸溶度測定儀進行測序，操作方法嚴格按試劑盒以及儀器說明書進行，結果與基因庫NCBI GenBank已知序列同源性比較，確定病原菌種類。

1.2.2 全自動微生物鑒定VITEK-2技術鑒定

將痰液樣本病原菌菌株接種至瓊脂平板上，37℃培養24 h，選取單一菌落進行革蘭染色，根據其病原菌生長特征和染色性，由梅里埃VITEK-2 Compact全自動微生物鑒定系統進行檢測，檢測結果與配套的GN鑒定板進行對比，確定病原菌種類，鑒定方法選擇嚴格按照實驗室操作說明書進行。

1.2.3 MALDI-TOF技術鑒定

挑取痰液樣本病原菌菌落，不要帶有任何瓊脂，靶板涂抹，涂一個點位或兩個點位后立刻加入 1 μLα-氰 基-4-羥 基 肉 桂 酸（α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid，CHCA）基質，同時涂點樣校準菌株大腸埃希菌 ATCC 8739，待樣本干燥后，使用梅里埃MALDI-TOF生物質譜儀進行檢測，操作方法參考儀器說明書。檢測結果與MALDI Biotyper 3.0數據庫進行比對，樣本圖譜與數據庫中的相應菌株圖譜高度相似時確定病原菌種類。其他注意事項：所有操作過程均應遵守實驗室生物安全要求以及相應無菌操作；涂菌時注意涂菌量，過多或過少均會影響鑒定結果；每個靶板有48個點位，16個點位為一組，可分3次使用，每組中心的小點位用于涂校準菌株。

1.3 觀察指標

①以基因測序法為“金標準”，比較兩種檢測方法對病原菌的鑒定結果。②對比其他兩種檢測技術對病原菌的鑒定率。③對比其他兩種檢測技術對病原菌的鑒定結果的差異性，包括對病原菌的鑒定準確率、漏診率、誤診率，其中鑒定準確率=已鑒定出的正確菌群數量/菌群總數量×100%，漏診率=未鑒定出的菌群數量/菌群總數量×100%，誤診率=鑒定錯誤菌群數量/菌群總數量×100%。

1.4 數據分析

采用SPSS21.0軟件進行數據分析，計數資料使用例（n）或百分數（%）表示，采用χ2檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三種檢測方法對病原菌的鑒定結果

三種檢測方法對金黃葡萄球菌、表皮葡萄球菌、頭部葡萄球菌、孔氏葡萄球菌、糞腸球菌、銅綠假單胞桿菌、肺炎克雷伯桿菌、不動桿菌、大腸埃希菌、陰溝腸桿菌、嗜麥芽桿菌、其他類型病菌等病原菌的鑒定結果見表1。

表1 三種檢測方法對病原菌的鑒定結果（n（%））

2.2 兩種檢測技術對病原菌的鑒定率比較

兩種檢測技術對病原菌各類菌種的鑒定率比較見表2。

表2 兩種檢測技術對病原菌的鑒定率比較（n（%））

表3 兩種檢測技術對病原菌的鑒定結果差異比較（n（%））

2.3 兩種檢測技術對病原菌的鑒定結果差異比較

MALDI-TOF技術對重癥肺炎痰液樣本病原菌的總鑒定率明顯高于VITEK-2技術，差異有統計學意義（P＜0.05），兩組檢測技術漏診率比較差異無統計學意義（P＞0.05），MALDI-TOF技術對重癥肺炎痰液樣本病原菌誤診率明顯低于VITEK-2技術，差異有統計學意義（P＜0.05）。

3 討論

臨床研究指出MALDI-TOF技術能快速、準確地鑒定出病原菌病原學信息，且實驗成本較低，在臨床檢測和鑒定中存在一定優勢[7]。在本次研究中，MALDI-TOF技術對重癥肺炎患者痰液樣本病原菌鑒定準確率明顯高于VITEK-2技術，這與孟令緣等[8]研究結論相類似。分析其原因，MALDI-TOF技術通過將痰液病原菌樣本和CHCA基質混合，利用激光作為能量來源，輻射病原菌標本與基質共結晶，基質吸收激光能量傳遞給病原菌蛋白質，使其發生電離；因離子飛行時間與質量呈正比，經過飛行時間檢測期，到達檢測器后，根據不同離子飛行時間的不同而形成質量圖譜，再將其與質譜圖數據庫的已知特征質譜圖作對比，篩選并確定特異性圖譜，從而實現對病原菌的區分和鑒定[9,10]。

MALDI-TOF技術以病原菌表面蛋白為檢測對象，受培養基、培養時間以及其他培養條件等外部因素影響較小，具有較好的穩定性和可重復性；還能對未經純化的樣本進行檢測鑒定，節省了培養時間，使得臨床醫師可根據鑒定結果，及時為患者提供抗生素治療[11]。本研究結果顯示，兩組檢測技術漏診率比較差異無統計學意義，但MALDI-TOF技術對重癥肺炎痰液樣本病原菌鑒定誤診率明顯低于VITEK-2技術，這與李曲文等[12]研究結果相類似。這可能是因為在重癥肺炎痰液樣本中，病原菌復雜，且存在其他大量干擾物質，使得廣譜采集不準確，進而影響MALDI-TOF技術檢測敏感度。實際檢測可通過樣本通過濃縮、微量化等步驟在提高其敏感度，但卻會以增加樣本處理時間和成本為代價。并且在實際臨床檢測過程中，VITEK-2技術還可進行相應藥敏測試分析，以檢測病原菌對相應抗菌藥物的耐藥情況，而MALDI-TOF技術無法分析病原菌對抗菌藥物的敏感情況，無法為臨床急性靶向抗感染治療提供準確的藥物使用方案。綜上所述，在重癥肺炎痰液樣本病原菌檢測和鑒定中，MALDI-TOF技術能快速為臨床提供高度可信的病原菌鑒定結果。然而該檢測技術還存在一定不足之處，因無法代替經典的抗菌藥物敏感性試驗，僅能為臨床做出一定的抗感染指導，無法為臨床醫生急性靶向抗感染治療提供準確依據。