雞血藤總黃酮對(duì)急性缺血性腦卒中大鼠腸道屏障功能、氧化應(yīng)激及ERK基因表達(dá)與DNA甲基化的影響

馬敏兒， 黃浩華， 吳麗霞， 羅琿

（深圳市龍華區(qū)中心醫(yī)院，廣東深圳 518110）

急性缺血性腦卒中（acute ischemic stroke）是臨床最為常見的腦類疾病，發(fā)病率和死亡率均較高，一直是研究的熱點(diǎn)。腦卒中歸屬于中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)病”范疇，痰瘀交阻，氣機(jī)升降逆亂是其主要病機(jī)。中醫(yī)藥及其有效活性成分對(duì)腦血管疾病的防治具有廣泛的應(yīng)用前景。雞血藤，為豆科植物密花豆Spatholobus suberectusDunn的干燥藤莖，味苦、甘，性溫，歸肝、腎經(jīng)，具有活血補(bǔ)血、調(diào)經(jīng)止痛、舒筋活絡(luò)的功效，用于治療月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)、經(jīng)閉、風(fēng)濕痹痛、麻木癱瘓、血虛萎黃等病證。雞血藤總黃酮是雞血藤的重要活性成分之一，具有抗腫瘤、抗氧化、抗腸道病毒、保護(hù)心腦神經(jīng)功能等作用[1-5]。既往研究[6]表明，雞血藤總黃酮對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性腦缺血具有一定的保護(hù)作用。因此，本研究以大腦中動(dòng)脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型大鼠為研究對(duì)象，進(jìn)一步觀察雞血藤總黃酮保護(hù)腦功能的作用及其機(jī)制，旨在為其臨床治療腦卒中提供應(yīng)用基礎(chǔ)，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 65只SFP級(jí)SD大鼠，雌雄各半，4～6月齡，體質(zhì)量150～210 g，購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（魯）20140012。所有操作嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)動(dòng)物管理指南批準(zhǔn)執(zhí)行。

1.2 藥物、試劑與儀器 雞血藤總黃酮（成都科程生物科技開發(fā)有限公司，批號(hào)：603305101）；阿司匹林腸溶片（杭州賽諾菲醫(yī)藥有限公司，批號(hào)：8A433）。蘇木素-伊紅（HE）染色液（北京雷根生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：1009A19）；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）檢測(cè)試劑盒（上海金穗生物科技有限公司）；二胺氧化酶（DAO）酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒、D-乳酸ELISA試劑盒（南京建成科技有限公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）。ASP300型封閉式全自動(dòng)組織脫水機(jī)、EG1140型分體式組織包埋機(jī)、RM2145型半自動(dòng)輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)（德國徠卡微系統(tǒng)股份公司）。

1.3 模型建立 按照文獻(xiàn)方法[7]采用Zea Longa線栓法加以改進(jìn)制作大腦中動(dòng)脈閉塞（MCAO）模型。方法：以10%戊巴比妥鈉35 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠后，切開頸中央分離頸動(dòng)脈，將頸總動(dòng)脈打結(jié)，在頸外動(dòng)脈離心端1 cm處結(jié)扎頸外動(dòng)脈、夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈；頸外動(dòng)脈行小型切口，把線栓插入后將頸外動(dòng)脈阻斷，線栓沿頸內(nèi)動(dòng)脈至顱方向進(jìn)入，距頸總動(dòng)脈分叉處約20 mm遇到阻力時(shí)暫停插入。阻斷2 h后把線栓取出，打開頸總動(dòng)脈結(jié)，使動(dòng)脈貫通。待大鼠蘇醒后提起大鼠尾巴，若大鼠左前肢屈曲、前行時(shí)向左側(cè)劃圈，則表示急性缺血性腦卒中模型成功建立。結(jié)果不符合建模標(biāo)準(zhǔn)的有3只大鼠，因感染死亡2只，剩余50只大鼠均建模成功。

1.4 分組與給藥 按照隨機(jī)數(shù)字表將60只大鼠分為正常組，模型組，中藥低、中、高劑量組和阿司匹林組，每組10只。除正常組，其余各組大鼠構(gòu)建MCAO模型。造模成功后，進(jìn)行給藥。大鼠給藥劑量按成人與大鼠體表面積換算法[7]計(jì)算，設(shè)為中劑量。中藥低、中、高劑量組分別給予雞血藤總黃酮100、200、400 mg·kg-1·d-1灌胃，阿司匹林組給予阿司匹林100 mg·kg-1·d-1灌胃，正常組與模型組給予等體積生理鹽水灌胃，給藥體積均為0.01 mL·g-1。連續(xù)給藥4周。

1.5 觀察指標(biāo)與方法

1.5.1 大鼠行為學(xué)檢測(cè)[8-9]①懸尾實(shí)驗(yàn)（TST）：末次給藥1 h后，將單個(gè)大鼠尾端（在距尾尖部約2 cm處）采用醫(yī)用膠布粘于懸尾箱（30 cm×30 cm×25 cm）上部支架上，使成倒掛狀態(tài)，頭部離箱底約5 cm。懸掛時(shí)間為6 min，記錄后4 min內(nèi)累計(jì)不動(dòng)時(shí)間（不動(dòng)狀態(tài)即大鼠停止掙扎不動(dòng)或無任何活動(dòng)）。②強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)（FST）：將大鼠放入高20 cm、直徑15 cm的玻璃箱內(nèi)，放入約10 cm常溫水，待大鼠入水后計(jì)時(shí)6 min，記錄后4 min內(nèi)大鼠在水中停止掙扎、呈漂浮狀態(tài)或僅微肢體運(yùn)動(dòng)以保持頭部浮于水面不動(dòng)的時(shí)間。③曠野實(shí)驗(yàn)：將大鼠置于直徑40 cm的圓形板內(nèi)30 s，記錄其在圈內(nèi)停留時(shí)間。

1.5.2 ELISA法檢測(cè)血清二胺氧化酶（DAO）、D-乳酸水平 經(jīng)尾靜脈取血，于4℃以3 000 r/min離心（離心半徑10 cm）15 min，取上清。采用ELISA法檢測(cè)血清中DAO、D-乳酸水平，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5.3 黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)血清超氧化物歧化酶（SOD）、硫代巴比妥酸法檢測(cè)丙二醛（MDA）水平 取血清，按照試劑盒說明書，應(yīng)用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)500 nm處檢測(cè)光密度（OD）值，繪制曲線，計(jì)算SOD、MDA值。

1.5.4 HE染色法觀察海馬組織病理學(xué)變化 將大鼠處死后取海馬組織，4%多聚甲醛溶液固定后石蠟包埋，制成5μm切片。二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟各10 min，梯度乙醇脫水各5 min，蘇木素染色5 min，75%鹽酸乙醇分化，自來水沖洗返藍(lán)，伊紅染色2 min，自來水沖洗，梯度乙醇脫水各30 s，二甲苯透明1 min，晾干，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察。

1.5.5 實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）法檢測(cè)大鼠海馬組織ERK mRNA表達(dá) 采用TRIzol提取總RNA，采用分光光度計(jì)（Thermo Scientific NanoDrop 2000）測(cè)定RNA含量、純度及濃度，應(yīng)用2%瓊脂糖凝膠分析總RNA完整性，用Bio-Rad iScriptTMcDNA Synthesis Kit試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成活性穩(wěn)定的cDNA，采用TaKaRa寶生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成的PCR引物進(jìn)行PCR的擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后繪制PCR擴(kuò)增后ERK和β-actin的標(biāo)準(zhǔn)曲線和確定PCR的特異性。最后采用2-△△CT（Livak）方法計(jì)算ERK mRNA相對(duì)表達(dá)量，由Bio-Rad CFX Manager system軟件自動(dòng)分析。ERK上游引物序列為5’-AGAGA AGAATGGTTGGCAGCA-3’，下游引物序列為5’-TTGGGTAGATGGTAAGGTAGAGA-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為171 bp；β-actin上游引物序列為5’-CGCTACC AATAACGCTTGCAAA-3’，下游引物序列為5’-TAGGCCAGGGGATCCAGTAA-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為99 bp。

1.5.6 采用Sequenom Mass Array飛行時(shí)間質(zhì)譜法檢測(cè)海馬細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）DNA甲基化水平 ERK基因序列號(hào)：NM00104356。提取大鼠海馬組織ERK總DNA，-20℃保存。應(yīng)用CpG Island Searcher軟件判斷ERK基因全序列，設(shè)計(jì)引物，ERK上游引物序列為5’-AGGAAGAGAGGTT ATAGGTAGGGGGTATAGGATGA-3’，下游引物序列為5’-CACTTAACCCAGTAATACTACTCTTTAAG ATCAAAACTCAACCCGGGAATTCT-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為1 509 bp；β-actin上游引物序列為5’-CGT AAAGACCTCTATGCCAACA-3’，下游引物序列為5’-TAGGAGCCAGGGCAGTAATC-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為92 bp。用Sequenom Mass Array飛行質(zhì)譜甲基化檢測(cè)平臺(tái)軟件獲取數(shù)據(jù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法 采用GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，符合方差齊及正態(tài)分布，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢測(cè)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠行為學(xué)比較 表1結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠TST不動(dòng)時(shí)間縮短，F(xiàn)ST不動(dòng)時(shí)間和圈內(nèi)保留時(shí)間延長(zhǎng)（P＜0.05）；與模型組比較，中藥中、高劑量組及阿司匹林組大鼠TST不動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng)、FST不動(dòng)時(shí)間和圈內(nèi)保留時(shí)間縮短（P＜0.05）；中藥高劑量組各指標(biāo)與阿司匹林組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠行為學(xué)比較Table 1 Comparison of the behaviors among various groups of rats （±s，s）

表1 各組大鼠行為學(xué)比較Table 1 Comparison of the behaviors among various groups of rats （±s，s）

注：①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與阿司匹林組比較

組別正常組模型組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組阿司匹林組F值P值鼠數(shù)/只10 10 10 10 10 10 TST不動(dòng)時(shí)間/s 126.12±38.59 76.79±16.67①78.12±17.03①③87.85±23.56①②③102.67±29.78①②100.84±28.65①②3.711＜0.001 FST不動(dòng)時(shí)間/s 7.56±0.96 15.92±1.85①15.23±1.79①③12.63±1.50①②③9.58±1.19①②9.62±1.21①②12.680＜0.001圈內(nèi)保留時(shí)間/s 12.56±2.23 27.57±5.96①26.79±5.88①③21.58±4.67①②③17.74±2.96①②18.12±3.02①②7.454＜0.001

2.2 各組大鼠血清中DAO、D-乳酸含量比較 表2結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠血清中DAO、D-乳酸含量較高（P＜0.05）；與模型組比較，中藥中、高劑量組血清中DAO、D-乳酸含量降低（P＜0.05），而阿司匹林組DAO、D-乳酸含量無顯著性差異（P＞0.05）；與阿司匹林組比較，中藥中、高劑量組血清中DAO、D-乳酸含量顯著降低（P＜0.05）。

表2 各組大鼠血清中二胺氧化酶（DAO）、D-乳酸含量比較Table 2 Comparison of serum levels of diamine oxidase（DAO）and D-lactate among various groups of rats （±s）

表2 各組大鼠血清中二胺氧化酶（DAO）、D-乳酸含量比較Table 2 Comparison of serum levels of diamine oxidase（DAO）and D-lactate among various groups of rats （±s）

注：①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與阿司匹林組比較

組別正常組模型組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組阿司匹林組F值P值鼠數(shù)/只10 10 10 10 10 10 DAO/（U·L-1）16.12±2.33 27.79±3.75①26.16±3.68①21.85±3.30①②③18.78±2.69①②③25.85±3.72①8.359＜0.001 D-乳酸/（mg·L-1）7.11±0.75 15.92±1.85①15.76±1.79①12.85±1.25①②③9.87±0.98①②③15.79±1.80①13.960＜0.001

2.3 各組大鼠海馬組織病理學(xué)變化比較 圖1結(jié)果顯示：正常組大鼠腦皮質(zhì)區(qū)域的神經(jīng)細(xì)胞良好且胞體形態(tài)規(guī)則，排列穩(wěn)定有序，神經(jīng)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞及毛細(xì)血管與周圍腦間質(zhì)空間無擴(kuò)增現(xiàn)象；模型組與中藥低劑量組梗死灶皮質(zhì)細(xì)胞排列紊亂，核固縮、核變形顯著，血管及神經(jīng)細(xì)胞與周圍腦間質(zhì)的間隔空隙較大；中藥中劑量組皮質(zhì)區(qū)仍可見神經(jīng)細(xì)胞變性腫脹現(xiàn)象，仍有少量細(xì)胞萎縮和壞死現(xiàn)象；中藥高劑量組與阿司匹林組梗死灶皮質(zhì)細(xì)胞排列趨于整齊，周圍腦間質(zhì)空間縮小，核固縮和核變形顯著改善，神經(jīng)元結(jié)構(gòu)趨于完整。

圖1 各組大鼠海馬組織病理學(xué)變化比較（HE染色，×400）Figure 1 Comparison of histopathological changes in the hippocampus tissue among various groups of rats（HE staining，×400）

2.4 各組大鼠海馬組織中SOD、MDA水平比較表3結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠海馬組織中SOD水平降低、MDA水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，中藥中、高劑量組及阿司匹林組大鼠海馬組織中SOD水平升高、MDA水平降低（P＜0.05）；中藥高劑量組各指標(biāo)與阿司匹林組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 各組大鼠海馬組織中SOD、MDA水平比較Table 3 Comparison of SOD and MDA levels among various groups of rats （±s，μmol·L-1）

表3 各組大鼠海馬組織中SOD、MDA水平比較Table 3 Comparison of SOD and MDA levels among various groups of rats （±s，μmol·L-1）

注：①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與阿司匹林組比較

組別正常組模型組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組阿司匹林組F值P值鼠數(shù)/只10 10 10 10 10 10 SOD 275.45±12.19 175.15±19.85①176.33±18.10①③198.21±16.73①②③212.56±14.55①②210.71±14.28①②13.620＜0.001 MDA 1.19±0.12 3.12±0.31①3.08±0.30①③2.75±0.23①②③1.96±0.19①②2.05±0.20①②18.360＜0.001

2.5 各組大鼠海馬組織ERK mRNA表達(dá)及ERK DNA甲基化水平比較 表4結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠海馬組織中ERK mRNA表達(dá)水平降低、ERK DNA甲基化水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，中藥中、高劑量組及阿司匹林組大鼠海馬組織中ERK mRNA表達(dá)水平升高、ERK DNA甲基化水平降低（P＜0.05）；中藥高劑量組各指標(biāo)與阿司匹林組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

腦卒中時(shí)可引起大腦皮質(zhì)和紋狀體梗死，造成皮質(zhì)額頂部、感覺運(yùn)動(dòng)區(qū)及四肢遠(yuǎn)端運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)功能、精細(xì)運(yùn)動(dòng)功能等產(chǎn)生障礙，而TST不動(dòng)時(shí)間、FST不動(dòng)時(shí)間和圈內(nèi)保留時(shí)間等可在一定條件下反映腦損傷的程度[10-11]。本研究結(jié)果顯示，中藥組大鼠TST不動(dòng)時(shí)間較模型組延長(zhǎng)、FST不動(dòng)時(shí)間和圈內(nèi)保留時(shí)間較模型組縮短，并明顯改善海馬組織病理損傷，與阿司匹林組效果相當(dāng)，表明腦卒中后由于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元受損導(dǎo)致其對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)的掌控能力減退，伴隨出現(xiàn)行為功能障礙、運(yùn)動(dòng)功能損傷，而雞血藤總黃酮干預(yù)可有效改善急性缺血性腦卒中大鼠行為學(xué)癥狀，修復(fù)腦損傷，值得深入研究。

腦卒中患者腸道內(nèi)致病細(xì)菌量升高，且腸道由于缺血缺氧可使炎癥因子過度生成、菌群失調(diào)、腸動(dòng)力及免疫障礙發(fā)生進(jìn)而導(dǎo)致腸道屏障功能損傷[12]。腸道屏障功能與腦卒中預(yù)后密切相關(guān)[13]。DAO和D-乳酸作為腸道關(guān)鍵因子可在一定程度上反映出腸道屏障狀態(tài)[14-15]。相關(guān)研究表明，改善腦卒中大鼠的腸吸收及腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)對(duì)修復(fù)腸黏膜屏障、恢復(fù)受損神經(jīng)功能、增強(qiáng)機(jī)體免疫具有重要的意義[16]。本研究結(jié)果顯示，中藥組血清中DAO、D-乳酸含量較模型組明顯下降，表明雞血藤總黃酮可促進(jìn)急性缺血性腦卒中大鼠腸黏膜損傷的恢復(fù)，提高腸道免疫機(jī)制，有維持腸道內(nèi)環(huán)境的作用。其中，中藥高劑量組降低效果顯著優(yōu)于阿司匹林組。考慮其原因可能是阿司匹林可直接刺激其胃腸功能，雖見效快但胃腸道副作用明顯，相比之下雞血藤總黃酮胃腸道副作用較小。

腦卒中發(fā)生時(shí)，由于腦部血供障礙導(dǎo)致體內(nèi)自由基失衡，同時(shí)自由基的防御系統(tǒng)SOD酶活性的下降、氧化產(chǎn)物MDA的增加導(dǎo)致神經(jīng)元膜以及相關(guān)微血管被攻擊，進(jìn)而引起脂質(zhì)過氧化損傷并破壞血腦屏障，最終引起神經(jīng)元損壞促進(jìn)疾病進(jìn)程[17]。本研究結(jié)果顯示，中藥組大鼠海馬組織中SOD活性較模型組升高，MDA水平較模型組顯著降低，中藥高劑量組與阿司匹林組治療效果相當(dāng)。表明雞血藤總黃酮可減輕急性缺血性腦卒中大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)，起到腦保護(hù)的作用。

表4各組大鼠海馬組織ERK mRNA表達(dá)及ERK DNA甲基化水平比較Table 4 Comparison of mRNA expression of ERK and DNA methylation level of ERK in hippocampal tissue among various groups of rats （±s）

表4各組大鼠海馬組織ERK mRNA表達(dá)及ERK DNA甲基化水平比較Table 4 Comparison of mRNA expression of ERK and DNA methylation level of ERK in hippocampal tissue among various groups of rats （±s）

注：①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與阿司匹林組比較

組別正常組模型組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組阿司匹林組F值P值鼠數(shù)/只10 10 10 10 10 10 ERK mRNA相對(duì)表達(dá)量1.95±0.19 0.15±0.02①0.17±0.03①③0.64±0.08①②③1.21±0.12①②1.15±0.10①②29.790＜0.001 ERK DNA甲基化水平1.19±0.15 3.34±0.36①3.29±0.33①③2.49±0.28①②③1.85±0.21①②1.93±0.22①②17.430＜0.001

ERK通路涉及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育以及神經(jīng)細(xì)胞的增殖、生存、分化過程，該通路的激活對(duì)腦缺血損傷修復(fù)具有重要的作用[18-21]。缺血性損傷后DNA甲基化增加，引起大量基因的轉(zhuǎn)錄抑制，導(dǎo)致腦損傷增加[22]，DNA甲基化抑制藥物已經(jīng)被證實(shí)可以改善大鼠缺血模型的神經(jīng)學(xué)結(jié)果[23]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，中藥高劑量組大鼠海馬組織中ERK mRNA表達(dá)水平升高、ERK甲基化水平降低，并與阿司匹林組治療效果相當(dāng)。結(jié)果表明，雞血藤總黃酮可促進(jìn)急性缺血性腦卒中大鼠海馬組織ERK mRNA表達(dá)、抑制ERK DNA甲基化，從而起到腦保護(hù)作用。

綜上所述，雞血藤總黃酮可改善急性缺血性腦卒中大鼠癥狀、修復(fù)腦損傷，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)腸道屏障功能、減輕海馬組織氧化應(yīng)激及促進(jìn)海馬組織ERK mRNA表達(dá)、抑制ERK甲基化DNA甲基化水平有關(guān)。