抗菌藥物聯(lián)合用藥體外研究方法的現(xiàn)狀及進展

方會慧 ， 許元寶 張 菁 ， 劉笑芬

多重耐藥、廣泛耐藥細菌的出現(xiàn)和迅速傳播已成為一個重大的公共衛(wèi)生問題，臨床可用的抗菌藥物有限。為有效控制多重耐藥、廣泛耐藥菌所致嚴重感染，防止耐藥性的進一步產(chǎn)生，抗菌藥物聯(lián)合用藥成為一個重要的治療手段。抗菌藥物聯(lián)合用藥對多重耐藥菌的抗菌活性及協(xié)同作用可通過E試驗，棋盤法、時間殺菌曲線等體外研究方法評估[1]，薈萃分析顯示以體外協(xié)同作用為導(dǎo)向的抗菌藥物聯(lián)合治療與生存率顯著相關(guān)[2]，體外研究發(fā)現(xiàn)具有協(xié)同作用的聯(lián)合用藥可進一步用于臨床研究。因此，本文對抗菌藥物聯(lián)合用藥體外研究方法的現(xiàn)狀及進展進行綜述，以期為多重耐藥、廣泛耐藥菌感染的聯(lián)合治療體外研究提供參考。

1 瓊脂擴散法

瓊脂擴散法包括紙片擴散法和濃度梯度紙條擴散法，又稱E試驗。紙片擴散法是將2種或2種以上含抗菌藥物紙片貼于均勻涂布菌液的平板表面，觀察抑菌圈的變化，示意如圖1。紙片擴散法簡單、易操作，但僅為定性研究。Stein等[3]采用紙片擴散法研究美羅培南、替加環(huán)素及多黏菌素E之間的協(xié)同作用，篩選出具有增效作用的7株菌株和無增效作用的2株菌株。

圖1 紙片擴散法

E試驗一般用于微生物藥敏試驗，用于測定兩藥的協(xié)同作用時，有兩種方法：①將2種E試驗紙條組合交叉放在涂布細菌的瓊脂平板表面，根據(jù)相交紙條抑菌圈的最低抑菌濃度（MIC）來計算部分抑菌濃度指數(shù)（FICI），F(xiàn)ICI=MICA藥聯(lián)合/MICA藥單用+MICB藥聯(lián)合/MICB藥單用。試驗結(jié)果判斷 ：FICI≤0.5，兩藥有協(xié)同作用；0.5＜FICI＜1為相加作用；1≤FICI＜4為無關(guān)作用；FICI≥4為拮抗作用[4]，示意見圖2。②利用E試驗法測定抗菌藥物A在含或不含抗菌藥物B（固定濃度）的細菌瓊脂平板中的MIC值變化。結(jié)果的判定：聯(lián)合用藥時A藥的MIC值降低1個稀釋度為無關(guān)，降低2個稀釋度為相加，降低3個稀釋度為協(xié)同[5]。E試驗的缺點是成本較貴。

圖2 E試驗交叉法

2 棋盤法

棋盤法（checkerboard assays）是研究體外協(xié)同作用最廣泛使用的方法之一，主要采用肉湯微量稀釋法測定單藥MIC，根據(jù)測定的MIC值上推2～4個和下推4～8個濃度梯度設(shè)定棋盤法中抗菌藥物的濃度范圍，兩種抗菌藥物按棋盤法設(shè)計的濃度梯度組合加入96孔微孔板中，24 h后觀察微孔中細菌的生長，以微孔中培養(yǎng)基澄清的最低濃度為兩藥聯(lián)合MIC，計算FICI判斷協(xié)同作用，計算方法及結(jié)果解讀同E試驗交叉法。棋盤法示意見圖3。近年來，“三相”及“四相”棋盤法可探討3種、4種藥物之間的劑量反應(yīng)關(guān)系[6-7]，Santos等[7]利用該方法考察了利奈唑胺、左氧氟沙星與異煙肼/利福平三藥聯(lián)合對10株耐藥結(jié)核分枝桿菌的協(xié)同作用，F(xiàn)ICI=(MICA藥聯(lián)合/MICA藥) + (MICB藥聯(lián)合/MICB藥) + (MICC藥聯(lián)合/MICC藥)，F(xiàn)ICI的最低值用于結(jié)果的判斷，F(xiàn)ICI≤0.75為協(xié)同作用；0.75＜FICI＜4為無關(guān)作用；FICI≥4為拮抗作用。但Stein等[3]在“三相”棋盤法中計算FICI時采用的是中位值而非最低值，結(jié)果的判斷認為FICI≤0.8為協(xié)同作用。不同研究中3種抗菌藥物聯(lián)合應(yīng)用判斷協(xié)同作用的FICI標準不同，可能影響協(xié)同作用的判斷，因此，有必要統(tǒng)一協(xié)同作用的判斷標準。

圖3 棋盤法示意圖

E試驗和棋盤法的優(yōu)點是研究方法簡單，容易操作，但也存在很多的問題：①MIC測定方法不同。E試驗和棋盤法協(xié)同作用的判斷依賴于MIC值的變化。肉湯微量稀釋法是測定抗菌藥物MIC的金標準，但不同體外研究中MIC的測定有瓊脂稀釋法、E試驗等不同方法[3-4,8]，MIC可能存在誤差，因此不同體外研究中協(xié)同作用的結(jié)果可比性差；②抗菌藥物聯(lián)合用藥的殺菌活性被忽視，因此Gomara等[9]建議檢測抗菌藥物的最低殺菌濃度（MBC），計算部分殺菌濃度指數(shù)（fractional bactericidal concentration index，F(xiàn)BCI）代替 FICI作為抗菌協(xié)同作用的主要指標，對于心內(nèi)膜炎、腦膜炎等嚴重感染具有重要意義。

3 時間殺菌曲線

時間殺菌曲線（time-kill assays）在新抗菌藥物體外藥效學(xué)評價研究中應(yīng)用廣泛，將處于對數(shù)生長期的菌液（通常5×105CFU/mL）暴露于固定濃度的抗菌藥物中，考察一段時間內(nèi)菌落數(shù)的變化，當24 h后菌落數(shù)下降≥ 3log10CFU/mL認為有殺菌作用，下降≥2log10CFU/mL則認為有抑菌作用。協(xié)同作用通常定義為與最有效的成分相比聯(lián)合用藥24 h內(nèi)菌落數(shù)下降≥2log10CFU/mL；當菌落數(shù)下降＜2log10CFU/mL時為無關(guān)作用；當菌落數(shù)升高≥2log10CFU/mL時考慮拮抗作用，時間殺菌曲線示意見圖4。有部分研究應(yīng)用殺菌曲線 下 面 積（area under the bacterial killing curve，AUBC）來判斷抗菌藥物聯(lián)合用藥的協(xié)同作用，AUBC通過梯形法計算時間殺菌曲線下0～24 h菌落數(shù)的變化，如果聯(lián)合用藥的AUBC低于殺菌活性最強的單一藥物（兩藥中AUBC較小的），則認為該組合是有效的[10-11]。多項研究顯示時間殺菌曲線比E試驗、棋盤法能檢測出更多的協(xié)同作用[12-14]。Pankey等[14]利用兩種不同的方法檢測多黏菌素B聯(lián)合利福平對14株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌（CRKP）的協(xié)同作用，E試驗僅檢測出對3株細菌有協(xié)同作用，而時間殺菌曲線顯示利福平（藥物濃度為1MIC）聯(lián)合多黏菌素B（藥物濃度為1MIC、1/2MIC、1/4MIC）對100%菌株均有協(xié)同作用。

圖4 時間殺菌曲線示意圖

時間殺菌曲線還可探討抗菌藥物聯(lián)合用藥對生物膜的作用。Geladari等[15]建立了4株CRKP生物膜模型，測定多黏菌素E、利福平、美羅培南、慶大霉素、替加環(huán)素對生物膜的最低抑制濃 度（minimum biofilm inhibitory concentration，MBIC50，定義為至少破壞50%生物膜的最低抗菌藥物濃度）分別為64、8、＞256、12、8 mg/L，采用Bliss獨立模型分析顯示16～64 mg/L的多黏菌素E與利福平、美羅培南或替加環(huán)素聯(lián)合均可觀察到對生物膜的協(xié)同作用，協(xié)同作用最強的是多黏菌素E聯(lián)合利福平。這對存在生物膜感染（如假體關(guān)節(jié)感染、囊性肺纖維化、感染性心內(nèi)膜炎等）的治療具有重要意義。

時間殺菌曲線研究存在的主要問題有：①大多數(shù)體外研究都是在相對較短的時間內(nèi)進行的（多數(shù)為24 h），但臨床治療持續(xù)時間通常要長得多，在此期間細菌密度可能會異常升高（＞108CFU/mL)；②時間殺菌曲線的細菌接種量多為105～106CFU/mL，僅有少數(shù)時間殺菌曲線進行了高接種量下殺菌作用的研究。有研究比較了常規(guī)接種量（105CFU/mL）和高接種量（107CFU/mL）下多黏菌素E聯(lián)合方案協(xié)同作用的區(qū)別，結(jié)果發(fā)現(xiàn)多黏菌素與亞胺培南、替加環(huán)素有協(xié)同作用，但均存在接種效應(yīng)[16-17]；③時間殺菌曲線結(jié)果難以向臨床轉(zhuǎn)化。時間殺菌曲線因細菌的接種菌量、藥物暴露時間的差異以及無法模擬體內(nèi)動態(tài)抗菌藥物濃度，導(dǎo)致體外抗菌藥物協(xié)同作用很難直接向臨床轉(zhuǎn)化。Oliva等[18]回顧性分析32例產(chǎn)KPC酶的CRKP感染患者（包括血流感染、肺部及泌尿道感染等）應(yīng)用雙碳青霉烯類（18例）和雙碳青霉烯類聯(lián)合多黏菌素E（14例）兩種治療方案的臨床早期反應(yīng)和60 d的病死率，并對兩組治療方案中采集的病原菌進行體外研究（時間殺菌曲線），體外研究結(jié)果顯示雙碳青霉烯類聯(lián)合多黏菌素具有更高的協(xié)同率，但臨床結(jié)局表明兩組在治療的早期反應(yīng)和60 d死亡率方面差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，雙碳青霉烯類聯(lián)合多黏菌素E三聯(lián)療法的患者僅臨床反應(yīng)常比雙碳青霉烯類二聯(lián)療法更早。

4 體外藥動學(xué)/藥效學(xué)（PK/PD）模型

體外PK/PD模型是指一類借助體外裝置來模擬藥物在體內(nèi)的藥動學(xué)過程和藥效學(xué)的研究方法，可反映體內(nèi)抗菌藥物濃度變化情況下的殺菌作用[19]。體外PK/PD模型獲得的研究數(shù)據(jù)與人類和動物有良好的相關(guān)性，在抗菌藥物體外研究與臨床應(yīng)用之間的銜接上發(fā)揮了重要作用。與動物體內(nèi)感染模型相比，抗菌藥物體外PK/PD模型表現(xiàn)出以下優(yōu)點：①避免了人與動物或動物間種屬差異；②便于多點采樣及高劑量接種；③避免了菌種不易在動物體內(nèi)生長的情況；④便于耐藥性研究等[20]。體外PK/PD模型包括一室模型和兩室模型，一室模型通常包括一個中央室、一個培養(yǎng)基池和一個廢液池，蠕動泵將培養(yǎng)基泵入含有細菌和抗菌藥物的中央室來消除藥物，模擬體內(nèi)抗菌藥物藥動學(xué)過程。該模型同時也引入透析膜能防止細菌濾出中央室，但細菌易堵塞過濾孔，影響抗菌藥物濃度變化[21]。二室模型的代表是中空纖維系統(tǒng)（hollow fiber infection model，HFIM）。HFIM主要由含有中空纖維的套筒組成，細菌被限制在作為感染部位的中空纖維筒中，模擬體內(nèi)感染，藥物和培養(yǎng)基可以自由通過，藥物暴露量根據(jù)藥動學(xué)特征參數(shù)來模擬，該系統(tǒng)可以模擬具有相同或不同半衰期的一種或多種藥物的任何藥物濃度時間過程[22]。見圖5。

圖5 體外PK/PD模型示意圖

近年來，體外PK/PD模型已越來越多應(yīng)用于抗菌藥物聯(lián)合用藥研究，探討聯(lián)合用藥方案對耐藥突變菌感染的抑制作用或協(xié)同殺菌作用。體外PK/PD模型顯示多黏菌素E聯(lián)合美羅培南[23-24]、多立培南聯(lián)合多黏菌素E[25]、多黏菌素E聯(lián)合替加環(huán)素[24]、多黏菌素B/E聯(lián)合磷霉素[26-30]及三藥多黏菌素B、美羅培南、利福平聯(lián)合[23,31]等對CRKP感染均有協(xié)同作用，并可消除多黏菌素耐藥亞群的出現(xiàn)。此外，基于生物膜的體外PK/PD模型可用于研究聯(lián)合用藥對細菌殺滅作用。Ribera等[32]利用“生物膜發(fā)生器”建立2株產(chǎn)ESBL肺炎克雷伯菌的生物膜，研究美羅培南、多黏菌素E和兩藥聯(lián)合對已產(chǎn)生物膜的細菌殺滅作用，美羅培南單藥（Cmax=90 mg/L，t1/2=1 h，每8小時1次給藥）對2株形成生物膜的肺炎克雷伯菌仍有明顯的殺菌作用 [下降（3.5±0.8） log10CFU/mL]，聯(lián)合多黏菌素E并未增加殺菌活性[下降（3.2±0.4）log10CFU/mL]。

體外PK/PD模型在評估細菌耐藥性中發(fā)揮了重要作用。HFIM允許使用高接種量，這對耐藥性發(fā)展的研究尤其重要，因為高細菌載量（例如108CFU/mL）更容易檢測到耐藥突變體。HFIM可以在患者嚴重細菌感染的抗生素治療期間（5～14 d）評估聯(lián)合用藥對耐藥性預(yù)防作用。Bulman等[31]在體外PK/PD模型（HFIM）中評估大劑量多黏菌素B（劑量5.53 mg/kg，Cmax=6 mg/L）與利福平聯(lián)合治療時多黏菌素B耐藥亞群的生長水平，10 d后發(fā)現(xiàn)菌株仍對多黏菌素B保持高度敏感（ MIC240h=0.5 mg/L）。

體外PK/PD研究中需要注意的問題：①菌株的選擇：研究過程中一般應(yīng)包含適當?shù)膮⒖季辏ㄈ鏏TCC菌株或敏感菌株）來證明可重復(fù)性。需評估細菌的耐藥機制，可以提供某一特定耐藥機制的影響；②藥動學(xué)參數(shù)，盡量選擇感染患者的藥動學(xué)數(shù)據(jù)應(yīng)用于模擬，因為健康受試者與患者或重癥患者之間的藥動學(xué)過程差異非常大；③解釋體外PK/PD結(jié)果，考慮抗菌藥物是否快速殺菌以及判斷終點（如細菌不再生長或減少2log10CFU/mL）與臨床最相關(guān)，如對于嚴重感染菌落降低2log10CFU/mL的時間點可能更重要。

5 其他方法

Mezzatesta等[33]報道了一種快速測定多種抗菌藥物組合殺菌作用的多重組合殺菌試驗（multiple-combination bactericidal test，MCBT），在96孔板中加入抗菌藥物30 μL及菌液70 μL（0.5麥氏濁度），24 h后檢測小孔中的菌落數(shù)變化。21株多重耐藥的肺炎克雷伯菌（其中11株產(chǎn)KPC-3酶，6株 產(chǎn)KPC-2酶，2株 產(chǎn)VIM-1酶，2株產(chǎn)OXA-48酶）的聯(lián)合用藥：①美羅培南（120 mg/L）聯(lián)合厄他培南（70 mg/L）和/或多黏菌素E（20 mg/L）；②利福平（6 mg/L）聯(lián)合替加環(huán)素（0.9 mg/L）和/或多黏菌素E（20 mg/L）；③利福平（6 mg/L）聯(lián)合多黏菌素E（20 mg/L）。研究發(fā)現(xiàn)含有多黏菌素E的組合對所有細菌均有殺菌作用，與時間-殺菌曲線結(jié)果一致。MCBT是一種快速測試多種抗菌藥物組合對多重耐藥菌作用的方法，參照藥物能達到的血清藥物濃度設(shè)計藥物濃度，能同時進行多達4種抗菌藥物的聯(lián)合。一項新加坡總醫(yī)院291例住院患者的回顧性研究證實，MCBT體外驗證有殺菌作用的抗菌藥物聯(lián)合用藥（多黏菌素B聯(lián)合碳青霉烯類或氟喹諾酮類）治療廣泛耐藥革蘭陰性菌的感染相關(guān)死亡率為6.0%，而經(jīng)驗性聯(lián)合用藥的死亡率為74.6%，死亡風(fēng)險OR=5.75（95%CI=1.25-25.73）[34]。

個性化的藥物組合篩選可以鑒別出用于治療的分離株特異性組合。Sun等[35]開發(fā)了自動超高通量篩選技術(shù)結(jié)合細菌生長檢測，對5 170種已批準的藥物和其他化合物的快速篩選，篩選出25種具有抗肺炎克雷伯菌的活性（1 536孔板高通量篩選）化合物。研究進一步結(jié)合抗菌藥物的臨床敏感性折點、可達到的血漿濃度、臨床不良反應(yīng)和作用機制來確定最佳的聯(lián)合用藥方法，鑒定出3組3種藥物組合（多黏菌素E +金諾芬+頭孢他啶、多黏菌素E +金諾芬+利福平、利福平+多黏菌素E +亞胺培南）對10株多重耐藥臨床分離株具有廣譜抗菌活性。該方法在臨床應(yīng)用中也得到進一步證實，1例重癥感染患者血液中分離出3株多重耐藥的革蘭陰性菌，對8種藥物組成的14種兩藥、三藥和四藥聯(lián)合用藥方案進行高通量篩選，慶大霉素+多黏菌素E+利福平體外抑菌率＞90%，其他方案多黏菌素E+亞胺培南+利福平，多黏菌素E+美羅培南+替加環(huán)素抑菌率54%～90%，多黏菌素E+美羅培南+替加環(huán)素+頭孢他啶，多黏菌素E+美羅培南+替加環(huán)素+利福平抑菌率22%～83%，選擇協(xié)同作用最佳的聯(lián)合方案（慶大霉素+多黏菌素E+利福平），調(diào)整治療后取得了良好的臨床療效[36]。因此，高通量藥物組合篩選有助于臨床醫(yī)師在有限的時間內(nèi)從大量的藥物組合中尋找合適的聯(lián)合方案控制嚴重感染。

多重耐藥菌感染的聯(lián)合治療目前已引起廣泛關(guān)注，但體外抗菌藥物聯(lián)合用藥協(xié)同作用的研究方法存在一定的復(fù)雜性、技術(shù)問題及結(jié)果解釋的差異性，體外研究與臨床治療有效率有一定的差異。因此，建議利用體外聯(lián)合用藥的協(xié)同作用數(shù)據(jù)進行前瞻性臨床試驗來提高多重耐藥菌感染臨床治療效果。