甌江彩鯉Scarb1基因敲除自交子一代的體色相關性狀觀察

許沁宇 劉帛嶼 喻楊樂夫 王軍 王成輝

(農業農村部淡水水產種質資源重點實驗室，水產科學國家級實驗教學示范中心，上海水產養殖工程技術研究中心，上海海洋大學，上海 201306)

體色是一個重要的生物學性狀，在動物的偽裝、生存、求偶、繁衍、生殖等生命活動中起著重要的作用[1]。魚類體色是最為豐富的表型性狀和重要的種質特征之一，是研究性狀遺傳規律和決定基礎的良好材料[2]。甌江彩鯉(Cyprinuscarpiovar.color)是一種主要分布于浙江省甌江流域的兼具食用和觀賞價值的魚類[3]，因具有體色豐富、肉質鮮嫩等特點而被推廣至全國多地養殖。上海海洋大學自1999年開展甌江彩鯉的種質研究和人工選育以來，已獲得5種不同的體色純合度較高的選育群體，為研究體色遺傳基礎和機制提供了豐富的素材。

清道夫受體(scavenger receptor，SR)是一種細胞表面糖蛋白，具有廣泛的配體識別譜[4-6]，因其可以與多種配體結合，并參與機體的免疫系統，故而被命名為清道夫受體。其中，B族I型清道夫受體(SR-BI/Scarb1)是第1個在分子水平上得到證實的高密度脂蛋白(HDL)受體，參與并介導膽固醇的逆向轉運，并在動物體中發揮多種重要的生理作用[7]。Du等[8]研究發現，Scarb1基因在甌江彩鯉紅色體色的形成過程中起著重要的調控作用，在敲除全紅體色甌江彩鯉的Scarb1基因后，發現嵌合體(F0)呈現出體表紅色皮膚斷裂、紅色區域大范圍褪色成白色的現象，且白色皮膚組織的類胡蘿卜素含量顯著降低。可見，Scarb1基因是通過介導類胡蘿卜素的含量來影響魚類體色表型的。

近幾年，本實驗室應用CRISPR/Cas9基因編輯技術，對甌江彩鯉的多個體色相關基因進行了敲除，并在敲除基因的F0個體中發現了大量的體色變異個體[9-12]。由于甌江彩鯉的性成熟時間較長，目前尚未對這些敲除體自交子代的體色表型變化開展研究。本研究以敲除Scarb1基因的甌江彩鯉敲除體自交繁育獲得的F1樣本為對象，觀察和比較基因敲除型和野生型全紅和粉玉體色個體的體表色素細胞形態和體內類胡蘿卜素含量變化，以期了解基因敲除體在自交繁育過程中的體色遺傳和變異情況，為研究魚類的體色遺傳基礎和機制提供資料。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

2018年，在上海海洋大學水產動物種質試驗站(上海市浦東新區新場鎮)，取甌江彩鯉“龍申1號”的“全紅”選育系個體，應用CRISPR/Cas9基因編輯技術敲除Scarb1基因，獲得了敲除型F0。2020年對敲除型F0進行自繁，獲得敲除型F1。本研究選用的試驗魚為敲除型F1的2齡全紅和粉玉個體，相應的對照組(野生型)為甌江彩鯉“龍申1號”F10的2齡全紅和粉玉個體。每組試驗魚2種體色各3尾，體質量為200～250 g。

1.2 試驗方法

1.2.1 鱗片色素細胞觀察

將試驗魚體表的黏液擦除干凈后，用干凈鑷子于魚體背鰭之下、側線鱗之上的中間位置取鱗片3～5片，置于磷酸鹽緩沖溶液(PBS溶液)中暫存。觀察時，按照魚鱗正常生長朝向，將其置于經無水乙醇消毒過的載玻片上，用光學顯微鏡觀察色素細胞的分布和形態，并用成像系統拍照。然后，參照馮彩等[13]的試驗方法，用小刀輕輕刮去鱗片表層膜，觀察鱗片上色素細胞的層次分布。

1.2.2 體內類胡蘿卜素含量測定

采用酶聯免疫反應(ELISA)測定試驗魚體內的類胡蘿卜素含量。分別取各試驗魚側線鱗以上的皮膚和肌肉，以及腸道、鰭條、眼睛及血液等組織，加入適量的PBS溶液進行勻漿后，以4 000 r/min的速度離心15 min，取上清液作為檢測樣品。分別準備空白孔、標準孔、待測樣品孔，將類胡蘿卜素標準品和待測樣品分別進行5倍梯度稀釋，加入包被酶標板，封板37 ℃溫育30 min。溫育結束后，棄上清液,加入洗滌液洗滌5次并晾干，再加入酶標試劑50 μL，于37 ℃下反應30 min。再加入顯色液，于37 ℃條件下顯色反應10 min后加入終止液，在15 min內測定450 nm波長下的吸光度(OD值)，然后計算出各組織中的類胡蘿卜素含量。

2 結果

2.1 鱗片色素細胞觀察

在光學顯微鏡下，野生型全紅個體(W-WR)鱗片上存在大量的黃色素細胞和少量紅色素細胞。其中黃色素細胞均勻分布，在10倍鏡下單個視野觀察到的細胞數為56～66個，直徑在30 μm左右，細胞邊緣呈樹突狀，多個細胞的樹突狀結構連接在一起呈網絡狀分布。紅色素細胞呈團狀，直徑在40 μm左右，但數量稀少，呈離散型分布在鱗片上。敲除型F1全紅個體(M-WR)鱗片上黃色素細胞的分布位置、密集程度和形態大小與野生型相似，單個視野內的細胞數為59～71個，但黃色素細胞的顏色較野生型淺，且未觀察到紅色素細胞(見圖1)。

注：圖中Ery為紅色素細胞，Xan為黃色素細胞。圖1 野生型和敲除型全紅體色甌江彩鯉鱗片上的色素細胞(10倍鏡)

進一步觀察發現，野生型全紅體色的甌江彩鯉，鱗片上的黃色素細胞內含有明顯的細胞核和大量直徑1～2 μm的黃色素小泡，色素小泡聚集在細胞主體部分，呈深黃色；紅色素細胞則由許多紅色的色素小泡聚集而成，色素小泡直徑也是1～2 μm，呈團狀分布，但沒有觀察到細胞核。敲除型全紅體色甌江彩鯉，其鱗片上黃色素細胞中的色素小泡在整個細胞中分布較均勻，色素小泡的直徑與野生型的相似，但其分布較野生型稀疏，整體呈現淺黃色(見圖2)。

注：圖中Ery為紅色素細胞，Xan為黃色素細胞；Iri為虹彩細胞。圖2 野生型和敲除型全紅體色甌江彩鯉鱗片上的色素細胞(100倍鏡)

在野生型粉玉個體(W-WW)和敲除型粉玉個體(M-WW)鱗片上均僅觀察到密集排列、呈短棒狀的虹彩細胞，其長度為10 μm左右，在自然光下反射出藍紫色的光澤。野生型和敲除型虹彩細胞的形態和大小無明顯差異(見圖3)。

注： 圖中Iri為虹彩細胞。圖3 野生型和敲除型粉玉體色甌江彩鯉鱗片上的色素細胞(10倍鏡)

2.2 鱗片色素細胞分層觀察

根據觀察，甌江彩鯉鱗片的下層(靠近皮膚組織的一側)均分布著密集排列的虹彩細胞。虹彩細胞中含有反射小板，在自然光下呈現出藍紫色的光澤。虹彩細胞層之上的色素細胞根據不同的體色而有所不同。野生型全紅個體鱗片的虹彩細胞層之上含有紅色素細胞和黃色素細胞。敲除型全紅個體鱗片的虹彩細胞層之上有均勻分布的黃色素細胞，而未見紅色素細胞。敲除型和野生型粉玉個體的鱗片上均只有虹彩細胞，未見黃色素細胞和紅色素細胞分布(見表1)。

表1 野生型和敲除型兩種體色甌江彩鯉的鱗片色素細胞分層情況

2.3 類胡蘿卜素含量測定

注：數據柱上標有不同字母表示組間差異顯著(P<0.05)。圖4 野生型和敲除型兩種體色甌江彩鯉的類胡蘿卜素含量變化

野生型和敲除型全紅、粉玉體色甌江彩鯉體內不同組織的類胡蘿卜素含量存在一定差異。在腸道和肌肉組織中，野生型全紅個體的類胡蘿卜素含量顯著高于敲除型全紅個體(P<0.05)，野生型粉玉個體的類胡蘿卜素含量也顯著高于敲除型粉玉個體(P<0.05)。在皮膚組織中，野生型全紅個體的類胡蘿卜素含量顯著高于敲除型全紅個體(P<0.05)，但野生型粉玉個體的類胡蘿卜素含量與敲除型粉玉個體差異不顯著(P>0.05)。在鰭條組織中，野生型全紅個體的類胡蘿卜素含量與敲除型全紅個體差異不顯著(P>0.05)，而野生型粉玉個體的類胡蘿卜素含量顯著高于敲除型粉玉個體(P<0.05)。在血漿中，野生型全紅個體的類胡蘿卜素含量顯著高于敲除型全紅個體(P<0.05)，但野生型粉玉個體的類胡蘿卜素含量與敲除型粉玉個體差異不顯著(P>0.05)。在眼睛中，野生型全紅和粉玉個體的類胡蘿卜素含量與敲除型全紅和粉玉個體的差異均不顯著(P>0.05)(見圖4)。

整體來看，野生型全紅個體腸道、血漿、肌肉和皮膚中的類胡蘿卜素含量均顯著高于敲除型全紅個體(P<0.05)；野生型粉玉個體腸道、肌肉和鰭條組織中的類胡蘿卜素含量也顯著高于敲除型粉玉個體(P<0.05)。

3 討論

由于Scarb1基因對于甌江彩鯉紅、白體色的形成有一定影響，因此，野生型和敲除型甌江彩鯉的體色存在一定的差異。本研究中，在野生型全紅個體的鱗片上觀察到由紅色素小泡聚集而形成的、呈團狀離散分布的紅色素細胞，以及由黃色素小泡聚集而成的樹突狀黃色素細胞，且因黃色素小泡較密集而呈現深黃色。敲除型全紅個體的鱗片上只有黃色素細胞，且其中色素小泡的分布較野生型的稀疏，黃色素細胞整體呈現出淡黃色。造成這種現象的原因，可能是在Scarb1基因敲除后，甌江彩鯉對類胡蘿卜素的吸收利用效率降低，從而影響了紅色素細胞的形成，并且可能對黃色素細胞中黃色素小泡的數量也產生了一定的影響。

有研究發現，microRNA-430b會抑制錦鯉(Cyprinuscarpiokoi)體內Scarb1基因的表達，從而導致錦鯉體表著色受到影響[14-15]。外源性睪丸酮會抑制斑馬雀體內類胡蘿卜素循環過程，使其紅色喙部發生褪色[16]。Toomey等[17]在金絲雀白色突變體的研究中也發現，Scarb1是鳥類類胡蘿卜素著色表達的重要基因。以上研究結果均表明，Scarb1基因在多種動物體內影響了類胡蘿卜素轉運、代謝和沉積等過程。

類胡蘿卜素是對魚類體色著色影響非常大的一類色素，能夠在動物體表沉積，從而顯示出紅、橙、黃等一系列顏色。但是包括魚類在內的多種生物自身并不能合成類胡蘿卜素，只能通過從外界食物中攝取，且經過吸收、轉運、轉化等一系列過程才能作用于體表著色[18]。本研究發現，腸道和肌肉組織中的類胡蘿卜素含量在野生型和敲除型甌江彩鯉個體之間存在顯著差異(P<0.05)。由于類胡蘿卜素主要在胃腸道中被生物體吸收和利用[18-19]，因此，敲除Scarb1基因對甌江彩鯉攝取類胡蘿卜素產生了較大影響，導致魚體攝入的類胡蘿卜素總量減少，進而造成肌肉中的色素沉積量也有所降低。本實驗室在前期的研究中發現，甌江彩鯉的皮膚也是類胡蘿卜素沉積的重要部位，尤其在全紅和粉玉個體的皮膚中，類胡蘿卜素含量存在顯著差異，這與本研究的結果是一致的。以上研究結果表明，由于Scarb1基因敲除表型向子代遺傳，影響了子代對類胡蘿卜素等的利用，導致其體色也發生了相應的變化。