基于PD-1/PD-L1信號通路的肝棘球蚴病免疫逃逸研究

楊康潔， 蘆永良， 鄂維建

1 青海大學 醫學院， 西寧 810000； 2 青海大學附屬醫院 檢驗科， 西寧 810000

肝棘球蚴病是由棘球蚴感染并侵犯哺乳動物肝臟所致的一種嚴重的肝臟寄生蟲疾病[1]，已被世界衛生組織(WHO)列為17種被忽視疾病之一，主要分為兩種，分別是由細粒棘球蚴感染肝臟所致的肝囊型棘球蚴病(hepatic cystic echinococcosis，HCE)和由多房棘球蚴感染肝臟所致的肝泡型棘球蚴病(hepatic alveolar echinococcosis，HAE)。肝棘球蚴病呈全球性分布，在我國主要分布于我國青藏高原及其周邊地區，如新疆、西藏和青海等[2]，其早期癥狀不明顯且潛伏期較長，致使檢出和采取治療措施為時已晚。據調查，全球患病率為8.1%，HCE病死率為2%～4%，HAE發病率為0.03/10萬～1.2/10萬，病死率>90%[3]，在我國患病率為0.5%～5.0%[4]，檢出率為0.71%[5]，這在一定程度上，加重了當地人們的疾病負擔，嚴重危害了世界公共衛生安全。

在肝棘球蚴病的研究中，發現程序性死亡受體1(programmed death 1，PD-1)和程序性死亡配體1(PD-1 ligand，PD-L1)作為一對免疫負性共刺激分子，其PD-1/PD-L1信號通路可誘導機體組織免疫耐受，負向調控宿主的免疫反應，參與肝棘球蚴病的免疫逃逸。據研究[6]表明，阻斷該通路，可減少T淋巴細胞的凋亡及耗竭，增強機體的免疫功能，提高機體抵抗肝棘球蚴病的能力。本文就PD-1/PD-L1信號通路在肝棘球蚴病免疫逃逸中的作用機制展開綜述。

1 PD-1/PD-L1信號通路概述

1.1 PD-1/PD-L1的分子結構 PD-1是一種廣泛存在于細胞表層的Ⅰ型跨膜單體糖蛋白，屬于CD28免疫球蛋白超家族中一員，也稱為CD279。最早是由Ishida等[7]采用減數雜交技術在小鼠細胞系上分離得到，其基因被證實定位于人類染色體2q37.3和CTLA-4基因上，其氨基酸序列與CTLA4相似度達20%，與CD28相似度達15%，與誘導的T淋巴細胞共刺激因子相似度達13%。PD-1由胞內區、跨膜區和胞外區組成，胞內區包括N端的免疫受體酪氨酸抑制基序 (immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif，ITIM)和C端的免疫受體酪氨酸轉換基序(immunoreceptor tyrosin-based switch motif，ITSM)；胞外區由一個含多個被重度糖基化的糖基化位點的IgV樣結構域組成。其主要分布在活化的T淋巴細胞、B淋巴細胞、NK細胞、單核細胞及樹突細胞等免疫細胞上[8]。

PD-L1(又稱為B7-H1或CD274)屬于B7家族，是一種由胞外區結構域、疏水性跨膜區和胞內區組成的Ⅰ型跨膜蛋白，是PD-L1的配體之一，位于人體9號染色體短臂24區2帶 (9p24.2)[9]，主要表達于靜息T淋巴細胞、B淋巴細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞，可影響CD8+細胞的免疫環境、輔助性T淋巴細胞(Th)1細胞因子和化學因子的產生和干擾素的基因表達特征[10]。

1.2 PD-1/PD-L1信號通路作用機制 信號通路是指接收細胞外分子信號并將其傳入細胞內，引起細胞發揮效應的一系列酶促反應通路，主要通過添加或去除磷酸基團，改變或恢復下游蛋白的構象，實現上游蛋白調節下游蛋白活性的作用。其家族龐大且種類繁多，不同信號通路之間錯綜復雜，相互影響[11]。

針對PD-1/PD-L信號通路機制，現已有廣泛研究。PD-1和PD-L1信號分子均存在可溶性和細胞膜型兩種形式，其中，可溶性PD-1(sPD-1)與可溶性PD-L1(sPD-L1)主要發揮類似細胞因子的作用，與膜型分子共同參與機體免疫調控。膜型PD-1(mPD-1)和膜型PD-L1 (mPD-L1)主要組成PD-1/PD-L1信號通路[12]。

PD-1/PD-L1信號通路在免疫逃逸機制中一直扮演著至關重要的角色[13]。當PD-1與PD-L1結合后，形成信號通路，會在宿主體內經過一系列復雜的調節機制，與多種信號通路相互作用，參與T、B淋巴細胞免疫應答，抑制機體免疫系統的功能，實現免疫逃逸。其主要作用的信號通路如下。

(1)PD-1/PD-L1信號通路與PI3K/Akt通路：PD-1在免疫應答下重新分配并聚集于免疫突觸，與抗原呈遞細胞上PD-L1形成PD-1/PD-L1信號通路，使PD-1胞內段ITIM結構域中的酪氨酸發生磷酸化，進而募集含Src同源域2(Src homology domain 2，SH2)蛋白酪氨酸磷酸酶2(SH2-containg protein tyrosine phosphatase 2，SHP-2)和SHP-1，抑制ZAP70，干擾CD28介導PI3K活化，使PI3K和AKT發生去磷酸化[14]，阻斷了PI3K/AKT通路，達到了抑制免疫細胞增殖分化、促進細胞凋亡、抑制能量生成和抑制信號傳遞的目的[15-16]。

(2)PD-1/PD-L1信號通路與雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路：PD-L1可下調AKT /mTOR，促進磷酸酶及張力蛋白同源物表達，同時，被抑制的PI3K/AKT通路也可影響mTOR，在這兩方面因素下mTOR信號通路被阻斷，失去促進物質代謝、參與細胞凋亡自噬的效應[17]。

(3)PD-1/PD-L信號通路與Raf/MEK/ERK通路：Raf/MEK/ERK通路又稱MAPK信號通路，可調節細胞增殖、轉化、分化和凋亡[18]，PD-1/PD-L1信號通路形成后，PD-1募集的SHP-2和SHP-1負性調節下游絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶磷酸化、抑制RAS和ZAP70及細胞外調節ERK活化，從而抑制MAPK信號通路。

(4)PD-1/PD-L信號通路與JAK-STAT信號通路：JAK-STAT信號通路能夠調節機體免疫細胞的增殖分化與凋亡[19]。PD-1/PD-L1信號通路中免疫受體酪氨酸基序發生磷酸化，酪氨酸磷酸酶在胞內區富集，影響JAK-STAT信號通路[20]。

PD-1/PD-L1信號通路與以上及更多信號通路作用來導致機體出現的主要結果有：

(1)基因蛋白表達異常。在PD-1/PD-L1信號通路下，抗凋亡基因Bcl-xL和轉錄因子如GATA-3、Tbet、和Eomes的表達受到抑制，阻礙相關細胞周期進展，影響相關細胞因子的表達[21]。

(2)細胞因子表達異常。PD-1/PD-L1信號通路有效抑制TNFα、IFNγ分泌，選擇性促進IL-10、TGFβ1分泌。

(3)免疫細胞分布異常。PD-1/PD-L1信號通路促進CD4+T淋巴細胞向Foxp3+調節性T淋巴細胞(Treg)分化，抑制CD4+T淋巴細胞向Th1和Th17細胞分化[22]。在基因蛋白和細胞因子異常的基礎上，PD-1/PD-L1信號通路抑制CD4+和CD8+T淋巴細胞的增殖，使細胞周期停留在G0/G1期，誘導激活T淋巴細胞的凋亡，抑制效應性T淋巴細胞活性。同時，PD-1/PD-L1信號通路還可作用于細胞能量代謝，阻滯T淋巴細胞的增殖與分泌[23]和機體免疫應答。另外，PD-1 /PD-L信號通路還可抑制B淋巴細胞的級聯活化[24]和改變單核細胞功能[25]。

簡言之，PD-1/PD-L1信號通路可負向調控相關基因表達、細胞因子分泌以及T淋巴細胞、B淋巴細胞和單核細胞等免疫細胞的活化(圖1)。

圖1 PD-1/PD-L1信號通路作用機制簡圖

2 PD-1/PD-L1信號通路參與肝棘球蚴病的免疫逃逸

2.1 肝棘球蚴病的免疫逃逸 在復雜機理的作用下，機體免疫系統受到抑制并長期處于低水平免疫狀態，導致病原體可以逃脫機體免疫系統的識別和攻擊而在機體內正常生長和轉移的現象，被稱為免疫逃逸[26]。

當人們誤食被棘球蚴污染的食物和水源時，其蟲卵即有機會孵化為幼蟲，幼蟲穿透腸黏膜到達肝臟。通過內臟動靜脈或淋巴管循環，病變可直接侵犯或轉移擴散到其他器官，不經治療的肝棘球蚴病其結局必然是致命的。研究其免疫逃逸機制能夠在一定程度對其診斷、治療產生積極作用， 在棘球蚴病中棘球蚴可實現免疫逃逸的機制有[27-28]：物理屏障，自身抗原改變，細胞毒作用，免疫調節和宿主先天免疫及遺傳背景。總的來說，針對肝棘球蚴病的免疫逃逸理論有：宿主Th1/Th2免疫反應系統失衡，Th17/Treg免疫反應系統失衡和能量失衡理論。

2.2 PD-1/PD-L1信號通路與肝棘球蚴病的免疫逃逸(表1)

表1 目前PD-1/PD-L1信號通路參與肝棘球蚴病的免疫逃逸理論

2.2.1 Th1/Th2失衡理論 棘球蚴侵襲肝臟后，可激活宿主Th1反應和Th2反應，其中，Th1反應分泌IFNγ、IL-12等細胞因子，發揮激活巨噬細胞，殺傷胞內病原寄生物，阻止幼蟲增殖和保護自身組織的作用。Th2反應分泌IL-4、5、6、10等細胞因子，抑制宿主免疫，促進蟲體在宿主體內寄生，機體免疫系統的正常運轉是處于免疫效應與免疫抑制的動態平衡。

在肝棘球蚴病中，宿主體內PD-1/PD-L1信號通路被激活，聯合多種信號通路，使Th1細胞生長周期阻滯在G0/G1期，加速其細胞凋亡，抑制CD4+T淋巴細胞向Th1分化。Speiser等[29]指出若阻斷PD-L1/PD-1信號通路可加速T淋巴細胞增殖，使T淋巴細胞恢復分泌功能。辛燕等[30]表明T淋巴細胞免疫球蛋白黏蛋白分子作為Th1型輔助細胞膜表面蛋白分子在肝棘球蚴病中表達較多。

在肝棘球蚴病發生發展時，宿主體內Th1反應逐漸轉變為混合性Th1/Th2反應，進而導致Th1/Th2免疫反應失衡[31]。Newport等[32]用62例臨床病例說明感染細粒棘球蚴患者體內Th2反應的細胞因子占主導地位。Mourglia等[33]采用PCR技術檢測出患者體內Th2細胞因子表達遠高于Th1細胞因子。同時，基質金屬蛋白酶剪切出的sPD-L1，可與mPD-1相互結合產生負性調節信號[34]，阻斷損傷信息的傳遞，加速機體分泌IL-10和TGFβ[35-36]，產生大量的“功能失調”或“耗竭”狀態的CD8+T淋巴細胞亞群，打破機體免疫Th1/Th2平衡[37]。另外，也有研究[38]表明，患者體內T淋巴細胞在囊性包蟲特異性抗原B的趨化下可表達大量Th2細胞，使機體適應性免疫應答向Th2反應偏移，造成Th1/Th2免疫反應系統失衡。

2.2.2 Th17/Treg失衡理論 在機體免疫系統中，Th17分泌IL-17、IL-26、IL-6等促炎因子與多種細胞表面受體結合，促進機體炎癥反應，導致組織損傷；調節性T淋巴細胞(Treg)分泌IL-35和TGFβ等抗炎因子，抑制炎癥細胞因子釋放，拮抗Th17的促炎效應。兩者共同維持著機體內環境穩態[39]。

棘球蚴侵襲肝臟后，宿主免疫細胞膜上表達PD-1，感染細胞膜上表達PD-L1，體內PD-1/PD-L1信號通路被激活，使PD-1胞質區ITSM和ITIM結構域中蛋白酪氨酸發生磷酸化，引起下游一系列蛋白酶改變，阻斷宿主體內PI3K/AKT通路，mTOR信號通路和Raf/MEK/ERK通路，協同JAK-STAT信號通路，產生拮抗CD28/B7作用，共同抑制抗凋亡基因Bcl-xL、轉錄因子RORγt和IFNγ的表達，促進轉錄因子Foxp3的表達，使轉錄因子RORγ的入核減少，Th17細胞的分化受到抑制，被Foxp3調節的Treg細胞分化增加[40]，使宿主體內Th17和Treg比例失衡。其中，PD-1/PD-L1信號通路相關聯的PI3K/AKT通路起主要作用[41]。

在研究肝棘球蚴病時，Tuxun等[42]發現患者體內細胞因子IL-17和IL-23濃度較低，IL-10和TGFβ1濃度較高，出現IL-17/IL-10和RORγt/Foxp3比值明顯降低現象。另外，PD-1/PD-L1信號通路能夠產生拮抗CD28/B7的效應，促進CD4+T淋巴細胞向Foxp3+Treg分化，誘發Treg產生，造成Th17/Treg免疫反應系統失衡。

2.2.3 能量失衡理論 機體免疫細胞在受到棘球蚴刺激時會以能量作為支撐，通過滿足效應T淋巴細胞增殖和分化所需能量發揮功效。而PD-1/PD-L1信號通路可調節初始T淋巴細胞激活代謝重編程，抑制宿主體內AMP-activated protein kinase (AMPK)、PPARy co-activator-1α (PGC-1α)信號通路、PI3K/AKT通路[43]和mTOR信號通路，影響免疫細胞吸收利用營養，阻礙免疫細胞能量補給。同時，T淋巴細胞激活也與線粒體的氧化磷酸化及糖酵解變化密切相關。CD4+Th有糖酵解反應和線粒體氧化磷酸化反應兩種，CD4+Treg有氧化磷酸化反應、糖酵解反應和脂質氧化反應三種[44]，機體在PD-1/PD-L1信號通路下，不斷向Treg發展，引起的Th1/Th2免疫反應系統失衡也會導致能量補給不足，導致肝棘球蚴病出現免疫逃逸現象。

另外，PD-1/PD-L1信號通路還可直接影響T淋巴細胞的正常免疫功能或直接導致T淋巴細胞的程序性凋亡。總之，PD-1/PD-L1信號通路在肝棘球蚴病的免疫逃逸機制研究主要針對于負向調節宿主免疫反應，PD-1/PD-L1信號通路是否對宿主基因等方面造成影響，還有待進一步研究。

3 PD-1/PD-L1信號通路與肝棘球蚴病的治療

近些年來，PD-1/PD-L1信號通路逐漸應用于腫瘤免疫治療，有糖基化修飾PD-1/PD-L1或直接使用PD-1/PD-L1抑制劑及PD-1/PD-L1抗體進行免疫治療等手段[45]。目前，針對肝棘球蚴病的臨床治療主要有服用藥物、手術切除和肝移植三種[46]。PD-1/PD-L1信號通路可通過上述三種理論協助肝棘球蚴病免疫逃逸，阻斷PD-1/PD-L1信號通路，維持Th1/Th2和Th17/Treg相對平衡，增強免疫效應的方法有望成為抗肝棘球蚴病免疫逃逸的一個重要治療手段。

肝移植作為一種具有挑戰性的肝臟外科技術，能夠在一定程度上延長患者壽命。而肝移植后，移植排斥反應也是一個不可避免的問題[47]。研究[48]發現，激活PD-1/PD-L1信號通路可降低小鼠肝移植術后免疫移植排斥，保護機體肝臟免受免疫損傷。在未來，PD-1/PD-L1信號通路可作為一項評估肝移植術后排斥反應的免疫學指標。如今，PD-1/PD-L1信號通路在肝移植方面還有待研究。

綜上所述，PD-1/PD-L1信號通路在肝棘球蚴病免疫逃逸中發揮著至關重要的作用，將PD-1/PD-L1信號通路作為免疫檢查點治療靶點，采用阻斷PD-1/PD-L1信號通路的方式，激活患者自身免疫系統從而殺滅體內寄生的免疫療法，將成為一種非常有前景的治療肝棘球蚴病的手段[49]。

4 總結與展望

PD-1/PD-L1信號通路在肝棘球蚴病免疫逃逸中發揮的作用不容忽視。其可通過宿主Th1/Th2免疫反應系統失衡，Th17/Treg免疫反應系統失衡和能量失衡三個方面促進棘球蚴的免疫逃逸。

如今，雖然許多學者已對PD-1/PD-L1信號通路調控肝棘球蚴病免疫逃逸展開了相應的研究，發現該通路可負向調節T淋巴細胞活化，抑制淋巴細胞增殖及細胞因子產生，下調細胞毒性T淋巴細胞介導的殺傷作用，廣泛參與免疫應答，是維持外周免疫耐受的重要機制。但對于PD-1/PD-L1信號通路的些許環節還存有疑問，對肝棘球蚴病如何具體實現免疫逃逸的具體機制暫不清楚， PD-1/PD-L1信號通路可影響多條信號通路，是否影響BCR信號通路，還有待深入研究。今后需要進一步研究PD-1/PD-L1信號通路參與肝棘球蚴病的致病機理和PD-1/PD-L1抑制劑參與肝棘球蚴病的治療，為保障和提高患者生活質量繼續探索。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：楊康潔負責資料分析和撰寫論文；鄂維建參與收集資料和修改論文；蘆永良負責指導撰寫文章并最后定稿。