慢性乙型肝炎患者停用核苷(酸)類似物后循環血清中HBV pgRNA、HBcrAg表達水平與復發的相關性分析

張詩琬， 陳 星， 劉 嬌， 趙 敏， 梅小平

1 川北醫學院附屬醫院 感染科， 四川 南充 637000； 2 南充市中心醫院 感染科， 四川 南充 637000；3 遂寧市中心醫院 感染科， 四川 遂寧 629000

目前我國慢性乙型肝炎(CHB)患者主要使用核苷(酸)類似物(NUC)抗病毒治療[1]，作為目前最重要的抗HBV治療手段，NUC主要以抑制HBV的逆轉錄來降低循環血中的HBV DNA水平。目前的NUC藥物并不能完全清除肝細胞內的HBV共價閉合環狀DNA(cccDNA)[2-3]，cccDNA的存在是CHB患者HBV持續感染的關鍵因素，因此肝內HBV cccDNA的消失是目前國內公認的CHB患者最可能達到病毒學治愈的狀態。HBV cccDNA存在于肝細胞內，其檢測具有創傷性，在臨床難以廣泛開展[4]。目前HBV相關的血清學標志物包括HBV DNA、HBeAg、HBsAg，經NUC治療后HBV DNA陰轉并不代表HBV cccDNA的清除，即使HBV cccDNA轉錄沉默，整合HBV S基因區也可轉錄翻譯成HBsAg[5]，在前C區以及基本cp區變異后可導致HBeAg載量下調甚至消失，但檢測HBV cccDNA仍存在一定的轉錄活性。因此，目前常用的血清學標志物反映肝內HBV cccDNA的轉錄水平存在一定的局限性。

新型生物學標志物HBV前基因組RNA(pgRNA)、乙型肝炎核心相關抗原(HBcrAg)已引起廣泛關注，HBV pgRNA作為cccDNA的直接轉錄產物，HBcAg作為HBV衣殼的主要結構蛋白，表達于完整的HBV Dane顆粒中[6]，其水平與cccDNA的轉錄活性和水平具有良好的相關性[7-8]。本團隊在研究了經NUC治療CHB患者各時間段的HBV pgRNA、HBcrAg水平之后，收集到治療至少5年到達完全應答并滿足2017年版歐洲肝病學會(EASL)指南[9]停藥標準的CHB患者，研究其停藥后各時間段HBV pgRNA、HBcrAg水平，分析pgRNA、HBcrAg水平變化與復發的相關性，探索其在臨床的應用價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象 研究對象來自2019年12月—2022年7月川北醫學院附屬醫院門診中抗HBV治療至少5年到達完全應答并滿足2017年版EASL指南停藥標準的隨訪隊列。所有研究對象年齡均滿18周歲且具有民事行為能力。排除標準：合并其他嗜肝/非嗜肝病毒感染及其他原因所致肝組織炎癥；合并肝硬化、肝癌等其他疾病。完全應答標準：滿足生化學、血清學以及病毒學聯合應答，生化指標ALT、AST正常，e抗原陰轉，HBV DNA檢測不到。復發標準：病毒學復發指的是獲得病毒學應答的患者停藥后，間隔1個月2次檢測HBV DNA均>2×103IU/mL；臨床復發指的是病毒學復發且ALT>2倍正常值上限，但排除其他因素引起的ALT增高。

1.2 標本的采集與處理 收集CHB患者停藥時、停藥4周、12周以及24周時的空腹靜脈血樣本3 mL于肝素抗凝管內，在6 h內以1000 r/min離心15 min并獲取上清液，置于-80 ℃冰箱保存。

1.3 檢測方法

1.3.1 HBV pgRNA檢測 采用湖南圣湘公司HBV pgRNA定量測定試劑盒檢測血清中HBV RNA含量。

1.3.2 HBcrAg檢測 采用ELISA酶聯免疫分析試劑盒，運用CObase601全自動免疫分析系統檢測。

1.3.3 HBV DNA水平檢測 運用實時熒光定量法高精度檢測樣品中HBV DNA載量，標準值>20 IU/mL，如低于檢測值下限按20 IU/mL進行統計學計算，嚴格按照說明書專人操作。

2 結果

2.1 CHB患者停藥后隨訪24周內病毒學復發人數及累積復發率 本研究收集CHB患者108例，其中失訪者26例，82例隨訪者在4周、12周、24周的復發情況見表1，累積復發率達到29.3%(24/82)。復發者均為病毒學復發，無臨床復發者，病毒學復發的患者從復發時結束隨訪觀察。

表1 CHB患者停藥后隨訪24周內病毒學復發人數及累積復發率

2.2 CHB患者停藥后各時段循環血清中HBV pgRNA、HBcrAg、HBV DNA的表達水平 停藥24周時，CHB患者循環血清中HBV pgRNA、HBcrAg、HBV DNA表達水平較停藥時及停藥4周表達明顯升高(P值均<0.05)；停藥后各時段組間CHB患者循環血清中HBV pgRNA、HBcrAg、HBV DNA表達水平差異均有統計學意義(P值均<0.05)(表2)。

表2 CHB患者停藥后各時段循環血清中HBV pgRNA、HBcrAg、HBV DNA表達水平比較

2.3 CHB患者停藥后復發組與未復發組循環血清中HBV pgRNA、HBcrAg、HBV DNA水平比較 對CHB患者停藥后復發組選擇復發當時循環血清中各指標水平狀態，未復發組選擇隨訪24周后循環血清中各指標的水平狀態，復發組循環血清中HBV pgRNA、HBcrAg、HBV DNA水平較未復發組顯著高表達(P值均<0.05)(表3)。對復發組進一步分析發現，在12～24周時復發患者循環血清中HBV pgRNA[(1.59±0.16)log10拷貝/mL vs (1.42±0.14)log10拷貝/mL，t=2.903，P<0.05]、HBcrAg[(2.43±0.12)log10U/L vs (1.73±0.06)log10U/L，t=18.163，P<0.05]以及HBV DNA[(3.97±0.44)log10IU/mL vs (3.57±0.31)log10IU/mL，t=2.640，P<0.05]水平較4～12周時高表達。

表3 CHB患者停藥后復發組與未復發組循環血清中HBV pgRNA、HBcrAg、HBV DNA、HBsAg水平比較

2.4 CHB患者停藥后復發組與未復發組在停藥時循環血清中HBV pgRNA、HBcrAg表達水平比較 復發組時循環血清中HBV pgRNA、HBcrAg的表達水平較未復發組顯著升高(P值均<0.05)(表4)。

表4 停藥時復發組與未復發組CHB患者循環血清中HBV pgRNA、HBcrAg表達水平比較

2.5 CHB患者復發組和未復發組循環血清中HBV pgRNA、HBcrAg與HBV DNA的相關性分析 CHB患者停藥后復發組循環血清中HBV pgRNA、HBcrAg與HBV DNA均呈正相關(r值分別為0.81、0.66，P值均<0.001)；未復發組循環血清中HBV pgRNA、HBcrAg與HBV DNA均無相關性(r值分別為0.14、0.04，P值均>0.05)(圖1～4)。

圖1 復發組HBV pgRNA與HBV DNA的關系

3 討論

CHB患者經NUC藥物治療后可以達到HBV DNA陰轉，但CHB患者體內仍存在一定量的HBV cccDNA，HBV cccDNA的持續低表達是HBV不斷復制的根源，目前只有HBV cccDNA徹底清除才是CHB等肝病患者根治的核心指標[5]。已有研究[10]表明，CHB患者循環血清中HBV pgRNA水平檢測可以反映肝細胞內cccDNA水平；也有研究[11-12]發現，HBcrAg表達水平與HBV cccDNA水平呈正相關。因此，本研究通過檢測CHB患者停藥后各時段循環血清中HBV pgRNA、HBcrAg的表達水平以及復發組與未復發組循環血清中HBV pgRNA、HBcrAg的表達差異，分析HBV pgRNA、HBcrAg停藥時水平與復發的相關性以及其水平能否作為停藥的參考臨界值指標，HBV pgRNA、HBcrAg的檢測可能為后續選擇停藥時機、評估藥物療效等提供臨床價值基礎。

圖2 復發組HBcrAg與HBV DNA的關系

圖3 未復發組HBV pgRNA與HBV DNA的關系

圖4 未復發組HBcrAg與HBV DNA的關系

本研究顯示，CHB患者停藥后隨訪4～12周時復發率17.1%，隨訪24周時累積復發率達到29.3%。其中單獨HBV DNA復陽者各占64.3%、60.0%，所有復發者均為病毒學復發，未發現臨床復發患者。目前CHB患者抗病毒治療主要依賴于NUC藥物。NUC藥物主要是抑制HBV逆轉錄酶來抑制HBV DNA的轉錄，降低CHB患者循環血清中HBV DNA的表達水平，對肝細胞內的HBV cccDNA清除能力較低，HBV pgRNA作為HBV cccDNA的直接轉錄產物即可長期以低水平存在于CHB患者體內。本研究的CHB患者經過至少5年的NUC抗病毒治療，滿足2017年版EASL指南停藥標準后停藥，由結果可見，盡管CHB患者經治療后HBV DNA陰轉，e抗原發生轉換，在停藥后隨訪中發現，仍有一部分患者發生HBV DNA和/或HBeAg復陽，其中HBV DNA單獨復陽者占多數，這可能是由于CHB患者循環血清中的HBV DNA來源于HBV pgRNA，pgRNA再經過逆轉錄形成HBV rcDNA，被病毒蛋白包裹后釋放到肝細胞外成為新的HBV DNA，HBV DNA形成與HBV pgRNA關系密切，在后續研究結果中發現低水平的HBV pgRNA是HBV DNA復陽的關鍵，既往也有研究[13]證實，停止NUC治療后，血清pgRNA水平與病毒復發風險有密切關系。

本研究在CHB患者停藥24周內的隨訪中發現，隨著停藥時間的延長，CHB患者循環血清中HBV pgRNA、HBcrAg、HBV DNA表達水平成上升趨勢，差異具有統計學意義；進一步對復發組進行分析，復發組CHB患者循環血清中HBV pgRNA、HBcrAg、HBV DNA表達水平較未復發組高表達，且12～14周復發組患者循環血清中HBV pgRNA、HBcrAg、HBV DNA表達水平較4～12周復發組高表達；停藥24周后未復發組患者循環血中HBV pgRNA、HBcrAg、HBV DNA的表達水平相比較于最初停藥時有所上升，但未達到復發組患者水平。由于本研究觀察時間較短，在后續的停藥過程中，未復發組患者循環血中各指標水平是否會進一步上升甚至達到復發組患者水平還需要進一步觀察；根據未復發組患者24周時循環血中各指標的表達水平能否預測其未來復發的可能性還需要進一步研究證明。本研究的CHB患者停藥時HBV DNA陰轉，但檢測結果提示其循環血清中HBV pgRNA、HBcrAg仍微量存在，在停藥后CHB患者循環血清中各指標水平逐漸升高，以HBV DNA水平上升為著，這可能是由于CHB患者體內HBV pgRNA、HBcrAg的持續存在，在失去NUC藥物的抑制后，HBV pgRNA經過逆轉錄酶重新生成HBV DNA，導致循環血清中HBV DNA表達水平上升明顯。也有研究[14]顯示，在CHB患者達到2017年版EASL指南停藥標準后，仍有約半數的患者循環血清中pgRNA未陰轉，這表明肝細胞內HBV cccDNA仍有一定的轉錄活性，在停藥后其復制活躍程度增高，導致患者發生病毒學復發。

進一步分析復發組和未復發組在停藥時其循環血清中HBV pgRNA、HBcrAg的水平差異，研究結果提示復發組在停藥時其循環血清中HBV pgRNA、HBcrAg表達水平較未復發組高表達。這表明，相比較于未復發患者，復發患者在停藥時，其循環血清中存在較高水平的HBV pgRNA、HBcrAg，這可能是導致復發組患者體內HBV再活躍的關鍵指標，因本研究停藥后觀察時間較短，未復發組循環血清中HBV pgRNA、HBcrAg停藥時水平是否能作為停藥的臨界指標尚需進一步觀察研究。免疫系統的激活與應答對乙型肝炎的進展和臨床結局起著關鍵作用，清除CHB患者體內HBV需要固有免疫以及獲得性免疫的協同作用。在大多數CHB患者體內免疫細胞處于“無應答”狀態，經NUC治療后，部分免疫細胞激活，免疫系統重新構建。近期研究[15-16]表明，經長期NUC治療后停藥復發與患者體內各種細胞因子激活等也有一定關系。

復發組以及未復發組循環血清中HBV pgRNA、HBcrAg與HBV DNA之間的相關性分析發現，復發組循環血清中HBV pgRNA、HBcrAg與HBV DNA呈正相關，未復發組循環血清中HBV pgRNA、HBcrAg與HBV DNA無相關性，這與部分學者[17-18]研究結果一致。作者認為在CHB患者經NUC藥物治療至HBV DNA陰轉后，其HBV pgRNA、HBcrAg水平下降滯后于HBV DNA，此時CHB患者體內HBV pgRNA、HBcrAg水平不能反映HBV DNA活性，而更能準確反映HBV cccDNA的轉錄活性與藥物治療療效；在復發組患者循環血清中存在較高水平的HBV pgRNA、HBcrAg，HBV cccDNA的轉錄活性更強，經逆轉錄酶生成HBV DNA能力提高，HBV DNA載量越高，HBV cccDNA活性越強，因此HBV DNA與HBV pgRNA、HBcrAg呈正相關。

綜上所述，目前CHB患者治療主要依賴NUC藥物，根據2017年版EASL指南停藥標準，即使HBV DNA陰轉，循環血清中仍存在一定量的HBV pgRNA、HBcrAg，本研究發現復發組與未復發組停藥時循環血清中HBV pgRNA、HBcrAg水平存在差異，但由于隨訪時間較短，未復發組患者在停藥時HBV pgRNA、HBcrAg水平是否能代表安全停藥的臨界值指標尚需進一步觀察研究。本研究僅納入了HBV DNA陰轉檢測HBV pgRNA仍呈陽性的患者，未檢測出HBV pgRNA陰性的患者，兩者未予以比較，對于停藥時HBV pgRNA陰性的患者停藥后其水平是否會進一步升高、是否發生病毒學復發、其水平是否更能代表安全停藥的臨界值指標等諸多問題需要進一步擴大樣本，延長隨訪時間進行研究觀察。

倫理學聲明：本研究方案于2022年3月8日經由川北醫學院附屬醫院倫理委員會審批，批號：2022ER127-1，所納入患者均簽署知情同意書。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：張詩琬負責資料分析，撰寫論文；陳星、劉嬌、趙敏參與標本收集，數據整理；梅小平負責指導撰寫文章并最后定稿。