基于甜味受體整合中藥“效味”和“滋味”探索玉竹甘味藥性物質(zhì)基礎(chǔ)

李 婷，鄧碧蓮，歐陽征海，柳 婷，吳 璐，楊華生

江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江西 南昌 330004

甘味又稱“甜味”，是中藥五味之一。中藥的甘味可能是基于“效味”，也可能是基于“滋味”。因此，確定甘味藥性物質(zhì)基礎(chǔ)，可基于“效味”，也可基于“滋味”。基于“效味”確定甘味藥性物質(zhì)，即中藥含有的成分/部位具有“甘補(bǔ)、甘緩、甘和”3 種效應(yīng)中的1 種，即可確定該成分為“甘味”藥性物質(zhì)；基于“滋味”確定甘味藥性物質(zhì)，即中藥含有的成分/部位的“滋味”是“甜”的，即可確定該成分為“甘味”藥性物質(zhì)。可以預(yù)見，基于“效味”和“滋味”確定的甘味藥性物質(zhì)可能不同；換句話說，基于“效味”確定的甘味藥性物質(zhì)其滋味不一定“甜”，而基于“滋味”確定的甘味藥性物質(zhì)其效應(yīng)不一定“補(bǔ)”。事實(shí)上，甘味只是大腦對客觀物質(zhì)的一種感覺。研究表明，甜味受體介導(dǎo)甘味感覺的形成，因此中藥的甘味可能與甜味受體有關(guān)。甜味受體主要存在于味蕾細(xì)胞[1]，葡萄糖、蔗糖等與之結(jié)合后，激活甜味信號通路，向中樞傳遞甜味感覺，是為“滋味”。研究還發(fā)現(xiàn)，甜味受體在消化系統(tǒng)中也有表達(dá)，雖不傳遞甜味感覺，但能促進(jìn)胰高血糖素樣肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）等胃腸激素的釋放，發(fā)揮藥理效應(yīng)[2]，是為“效味”。可見，甜味受體不僅與“滋味”有關(guān)，還與“效味”也有聯(lián)系。因此，可基于甜味受體整合“效味”和“滋味”，即同時(shí)關(guān)注“效味”和“滋味”，探索中藥的甘味藥性物質(zhì)基礎(chǔ)。

玉竹是為百合科植物玉竹Polygonatum odoratum(Mill.) Druce 的干燥根莖，主要含有多糖、皂苷、黃酮等成分。玉竹屬于典型的補(bǔ)陰藥，主要用于治療“陰虛”證。研究表明，陰虛可出現(xiàn)體質(zhì)量下降、體溫升高、少食、多飲、大便干結(jié)、皮膚干燥等癥狀[3]；同時(shí)，針對陰虛“陽亢內(nèi)熱”“陰液虧損”的病機(jī)，現(xiàn)代也從Na+,K+-ATP 酶等能量代謝酶、調(diào)節(jié)水液代謝的水通道蛋白（aquaporins，AQPs）等方面來研究陰虛[4]。因此，本研究以玉竹為研究對象，首先采用陰虛動(dòng)物模型，研究玉竹多糖、皂苷、黃酮對陰虛小鼠體質(zhì)量、體溫、攝食量、攝水量、糞便含水率、皮膚含水率及Na+,K+-ATP酶、Ca2+,Mg2+-ATP 酶活性和AQP1、AQP3mRNA表達(dá)量的影響，從“效味”的角度探索玉竹的甘味藥性物質(zhì)；再利用電子舌識別玉竹多糖、皂苷、黃酮的“滋味”，從“滋味”的角度探索玉竹的甘味藥性物質(zhì)；最后，選擇基于“效味”和“滋味”相同的甘味藥性物質(zhì)，確定為玉竹甘味藥性物質(zhì)。在此基礎(chǔ)上，采用整體動(dòng)物考察確定的甘味藥性物質(zhì)對GLP-1 分泌的影響，分子對接考察確定的甘味藥性物質(zhì)與甜味受體的結(jié)合性，以此揭示效味、滋味與甜味受體的關(guān)聯(lián)性。

1 儀器與材料

1.1 儀器

SmarTongue 型電子舌（上海瑞玢國際貿(mào)易有限公司）；A100 PCR 基因擴(kuò)增儀（杭州朗基科學(xué)儀器有限公司）；Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；ELSD 6000 檢測器（美國Alltech公司）；全波長掃描式多功能讀數(shù)儀（美國Thermo公司）；核酸蛋白測定儀、伯樂PCR 儀（美國賽默飛公司）；752 紫外可見分光光度計(jì)（上海欣茂儀器有限公司）；紅外額式體溫計(jì)（昆山熱映光電有限公司）。

1.2 試劑與藥材

小鼠GLP-1 試劑盒（批號H2106Y28）購自上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司；Na+,K+-ATP 酶（批號20221208）、Ca2+,Mg2+-ATP 酶試劑盒（批號20221208）購自南京建成生物公司；總RNA 提取試劑盒（批號20220424）購自北京索萊寶科技有限公司；M5 First Strand cDNA Synthesis Kit（批號22CB2308）、2X M5 UltraSYBR Mixture（批號21HA0201）購自北京聚合美生物科技有限公司；無水葡萄糖（批號130407）、蘆丁（批號wkq21020402）、重樓皂苷（批號wkq21031603）對照品均購自四川省維克奇生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為98%；葡萄糖（批號120926）、酒石酸（批號151008）購自西隴化工股份有限公司；氯化鉀（批號20140108）購自天津市福晨化學(xué)試劑廠；谷氨酸鈉（批號20210711）購自江西省祥櫥實(shí)業(yè)有限公司；蔗糖（批號D1527058）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；鹽酸小檗堿片（批號2200127）購自東北制藥集團(tuán)沈陽第一制藥有限公司；玉竹藥材（批號200901）購自安徽道源堂中藥飲片有限公司，附子（批號20180405）、肉桂（批號20180521）、干姜（批號20180301）藥材購自江西吁江生態(tài)科技有限公司，甘草、黨參、黃芪、黃連、黃芩、大黃、白芷、川芎、山楂、烏梅、山茱萸、芒硝、玄明粉等藥材均購自南昌市北京同仁堂藥店，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)付小梅教授鑒定，分別為百合科植物玉竹P.odoratum(Mill.) Druce 的干燥根莖、毛茛科植物烏頭Aconitum carmichaeliiDebx.的干燥子根、樟科植物肉桂Cinnamomum cassiaPresl 的干燥樹皮及姜科植物姜Zingiber officinaleRosc.的干燥根莖、豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的干燥根莖、桔梗科植物黨參Codonopsis pilosula(Franch.) Nannf.的干燥根莖、豆科植物黃芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bunge 的干燥根莖、毛茛科植物黃連Coptis chinensisFranch.的干燥根莖、唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensisGeorgi的干燥根莖、蓼科植物大黃Rheum palmatumL.的干燥根莖、傘形科植物白芷Angelica dahurica(Fisch.ex Hoffm.) Benth.et Hook.f.的干燥根莖、傘形科植物川芎Ligusticum chuanxiongHort.的干燥根莖、薔薇科植物山楂Crataegus pinnatifidaBunge 的干燥成熟果實(shí)、薔薇科植物梅Prunus mume(Sieh.) Sieb.et Zucc.的干燥成熟果實(shí)、山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalisSieb.et Zucc.的干燥成熟果實(shí)、硫酸鹽類礦物芒硝Natrii Sulfas經(jīng)加工精制而成的結(jié)晶體、硫酸鹽類礦物芒硝Natrii Sulfas風(fēng)化干燥的產(chǎn)物。

1.3 動(dòng)物

雄性昆明種小鼠，30 只，清潔級，6～7 周齡，體質(zhì)量（24±2）g，由江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號SCXK（贛）2018-0003。動(dòng)物飼養(yǎng)于溫度為22～25 ℃，相對濕度為40%～60%，12 h 明暗交替的環(huán)境中。所有實(shí)驗(yàn)操作均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用指導(dǎo)原則，實(shí)驗(yàn)方案取得江西中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號 JZSYDWLL-20201215）。

2 方法

2.1 玉竹有效部位的制備及表征[5]

取玉竹藥材適量，粉碎，用水提取3 次，每次2 h，合并提取液，濃縮蒸干，得到總提取物；總提取物水溶、醇沉，得醇沉物及上清液；將醇沉物透析，即得玉竹多糖（9.8%）。將上清液濃縮蒸干，即得醇溶物；將醇溶物水溶，用醋酸乙酯萃取，收集醋酸乙酯層蒸干，用水溶解，上AB-8 大孔樹脂柱；過夜吸附后，依次用水、10%乙醇除雜，再用40%乙醇、60%乙醇洗脫；40%乙醇洗脫液蒸干后水溶，用乙醚按1∶1 比例萃取，收集乙醚層，蒸干，即得玉竹黃酮（0.06%）。收集60%乙醇洗脫液，蒸干，得玉竹皂苷（0.1%）。利用紫外分光光度計(jì)及高效液相色譜對玉竹多糖、皂苷、黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)及游離糖成分進(jìn)行檢測[6-8]。

2.2 基于“效味”探索玉竹甘味藥性物質(zhì)

2.2.1 陰虛模型建立、分組及給藥 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d 后，隨機(jī)分為5 組，即正常組、模型組、多糖組、皂苷組、黃酮組，每組6 只。除正常組外，其余各組小鼠ig 給予等比例的附子、肉桂、干姜熱性中藥提取物（取附子適量，用水提取1 h，再加入肉桂、干姜提取1 h，濾過，藥渣再提取1 h，合并2 次提取液，濃縮至生藥質(zhì)量濃度1 g/mL，即得熱性中藥提取液，4 ℃儲存），持續(xù)給藥28 d，制備陰虛小鼠模型[9]。第29 天開始，各給藥組小鼠分別ig給予玉竹多糖（1784 mg/kg）、皂苷（18.2 mg/kg）、黃酮（10.9 mg/kg），其劑量均相當(dāng)于人臨床等效劑量的10 倍；正常組、模型組給予等體積蒸餾水，持續(xù)28 d。

2.2.2 “陰虛”指標(biāo)的測定及玉竹“甘味”藥性物質(zhì)的初步確定 給藥期間，每7 天測量1 次體質(zhì)量、心前區(qū)溫度，用代謝籠測定24 h 攝食量、24 h 攝水量，收集24 h 糞便，精密稱定濕質(zhì)量，放烘箱105 ℃烘干24 h，稱干質(zhì)量，計(jì)算糞便含水率[糞便含水率=(濕質(zhì)量-干質(zhì)量)/濕質(zhì)量]。末次給藥后，動(dòng)物麻醉，取背部皮膚及肺、胃、肝、腎等組織，保存于-80 ℃?zhèn)溆茫蝗∑つw適量，精密稱定，再放入烘箱中于80 ℃烘干12 h，稱干質(zhì)量，計(jì)算皮膚含水率[皮膚含水率=(濕質(zhì)量-干質(zhì)量)/濕質(zhì)量]。按照試劑盒說明書測定肝、腎、胃組織中Na+,K+-ATP酶、Ca2+,Mg2+-ATP 酶活力；采用qRT-PCR 法測定肺、胃、腎組織AQP1、AQP3mRNA 表達(dá)量，引物序列：β-actin上游5’-CTGTGCCCATCTACGAGGGCTAT-3’，下游5’-TTTGATGTCACGCACGATTTCC-3’；AQP1上游5’-ACATCATCGCCCAGTGTG-3’，下游5’-CTGCAGAGTGCCAATGATCTC-3’；AQP3上游5’-GCCAAGGTAGGATAGCAAATAA-3’，下游5’-TTGAAAACTTGGTCCCTTGC-3’。擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性45 s，95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸45 s，45 個(gè)循環(huán)。分析玉竹多糖、皂苷、黃酮對上述指標(biāo)的回調(diào)作用，即補(bǔ)陰作用，具有補(bǔ)陰作用的物質(zhì)即可初步認(rèn)定為玉竹“甘味”藥性物質(zhì)。

2.3 基于“滋味”探索玉竹甘味藥性物質(zhì)

2.3.1 電子舌識別“滋味”的可靠性考察 參考電子舌說明書，以葡萄糖、鹽酸小檗堿、酒石酸、氯化鉀、谷氨酸鈉5 種化合物為甘、苦、酸、咸、辛“五味”標(biāo)準(zhǔn)品，以蔗糖為受試品。將“五味”標(biāo)準(zhǔn)品及蔗糖受試品配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL 的溶液，利用電子舌的6 個(gè)電極在1、10、100 Hz 的頻率段下采集信號數(shù)據(jù)。將“五味”標(biāo)準(zhǔn)品及蔗糖受試品的數(shù)據(jù)進(jìn)行傳感器優(yōu)化，選擇區(qū)分指數(shù)（discrimination index，DI）值最大的電極及頻率段組合，進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA），基于PCA 計(jì)算“五味”標(biāo)準(zhǔn)品與蔗糖之間的歐式距離[10]，如葡萄糖與蔗糖之間的距離最近，則認(rèn)為基于PCA 的歐式距離可準(zhǔn)確識別“滋味”。去除蔗糖受試品，將“五味”標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)據(jù)進(jìn)行傳感器優(yōu)化，選擇最大DI 值的電極及頻率段組合，在 PCA 的基礎(chǔ)上，利用判別因子分析（discriminant factor analysis，DFA）建立“五味”分區(qū)模型；再將蔗糖數(shù)據(jù)投射入模型中，如蔗糖投射于葡萄糖區(qū)域，則認(rèn)為基于PCA 的DFA 可準(zhǔn)確識別“滋味”。

2.3.2 “滋味”的測定及玉竹“甘味”藥性物質(zhì)的初步確定 以甘草、黨參、黃芪為“甘味”基準(zhǔn)，黃連、黃芩、大黃為“苦味”基準(zhǔn)，干姜、白芷、川芎為“辛味”基準(zhǔn)，山楂、烏梅、山茱萸為“酸味”基準(zhǔn)，芒硝、玄明粉、食鹽為“咸味”基準(zhǔn)，建立甘、苦、辛、酸、咸的中藥“五味”標(biāo)準(zhǔn)，以玉竹多糖、皂苷、黃酮為檢測樣品，利用電子舌采集信號數(shù)據(jù)。按“2.3.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行分析，計(jì)算甘、苦、辛、酸、咸味中藥與玉竹多糖、皂苷、黃酮樣品之間的歐式距離，分析玉竹多糖、皂苷、黃酮在中藥五味分區(qū)模型上所投射的區(qū)域。最后綜合分析歐式距離以及樣品投射的區(qū)域，初步確定玉竹“甘味”藥性物質(zhì)。

2.4 玉竹“甘味”藥性物質(zhì)與甜味受體的關(guān)聯(lián)性

2.4.1 “甘味”藥性物質(zhì)對GLP-1 分泌的影響 “甘味”藥性物質(zhì)結(jié)合并激動(dòng)甜味受體，啟動(dòng)甜味信號通路，促進(jìn)GLP-1 的分泌。可見，GLP-1 在一定程度上可表征甜味物質(zhì)與甜味受體之間的結(jié)合。因此，采用整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)考察“甘味”藥性物質(zhì)與甜味受體的結(jié)合性。陰虛模型建立、分組及給藥同“2.2.1”項(xiàng)，末次給藥后1 h，將小鼠麻醉，摘眼球取血，血液靜置2 h 后，4 ℃，3500 r/min 離心10 min，分離血清，用ELISA 法檢測血清GLP-1 含量。

2.4.2 “甘味”藥性物質(zhì)與甜味受體結(jié)合性研究 分子對接是研究分子與蛋白之間結(jié)合性的常用方法。小鼠、人甜味受體的三級結(jié)構(gòu)不明確，因此本研究首先以青鳉魚甜味受體的三級結(jié)構(gòu)5X2M_B 為模板[11]，以小鼠、人甜味受體的一級序列為基礎(chǔ)，利用SWISS-MODELL 構(gòu)建小鼠（mT1R2/mT1R3）及人（hT1R2/hT1R3）甜味受體三級結(jié)構(gòu)，并利用在線同源模型評估軟件 ERRAT、VERIFY3D 和PROCHECK 對其進(jìn)行評估；如評估結(jié)果顯示所構(gòu)建的甜味受體結(jié)構(gòu)合理，則可用于分子對接分析。然后在 TCMSP 上下載玉竹皂苷分子（MOL010393），分子及甜味蛋白用AutoDockTools-1.5.6進(jìn)行處理，用AutoDock Vina 進(jìn)行分子對接，再利用PyMOL 生成分子與蛋白結(jié)合的文件，利用Discovery Studio 4.5 Client 繪制對接結(jié)合圖。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 玉竹有效部位表征分析

玉竹經(jīng)提取、純化后，得玉竹多糖、皂苷、黃酮，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為85.1%、63.5%、51.0%；同時(shí)，經(jīng)ELSD-HPLC 分析（圖1），玉竹總提取物、醇沉物、醇溶物等粗提取物中含有木糖、果糖、蔗糖等糖成分，而分離純化后的多糖、皂苷、黃酮中均不含玉竹中常見的鼠李糖、木糖、果糖、葡萄糖、蔗糖，這也消除了多糖、皂苷、黃酮含有的小分子糖類成分對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。

圖1 玉竹提取物中小分子糖類成分分析Fig.1 Analysis of small molecular sugars in extracts of P.odoratum

3.2 基于“效味”的玉竹甘味藥性物質(zhì)的初步確定

3.2.1 玉竹對陰虛模型小鼠體質(zhì)量、體溫、攝食量、攝水量、糞便含水率、皮膚含水率的影響 玉竹對陰虛模型小鼠體質(zhì)量的影響見圖2-A。結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組小鼠體質(zhì)量明顯下降（P＜0.05）；給藥21 d 后，與模型組相比，皂苷組小鼠體質(zhì)量顯著增加（P＜0.05）；給藥28 d 后，與模型組相比，多糖組和皂苷組小鼠體質(zhì)量顯著增加（P＜0.05）；在整個(gè)治療期間，與模型組比較，黃酮組小鼠體質(zhì)量未見明顯差異。玉竹對小鼠體溫的影響見圖2-B。結(jié)果顯示，在造模及治療期間，小鼠體溫未見明顯差異。玉竹對陰虛小鼠攝食量的影響見圖2-C。與正常組相比，模型組小鼠攝食量明顯降低（P＜0.05）；給藥21 d 后，與模型組相比，皂苷組小鼠攝食量明顯增加（P＜0.05）；給藥28 d 后，與模型組相比，多糖組和皂苷組小鼠攝食量明顯增加（P＜0.05）。玉竹對陰虛小鼠攝水量的影響見圖2-D。結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組小鼠攝水量明顯升高（P＜0.05）；給藥21、28 d 后，與模型組相比，多糖組和皂苷組小鼠攝水量顯著下降（P＜0.05）。玉竹對陰虛小鼠糞便含水率的影響見圖2-E。結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組小鼠糞便含水率明顯降低（P＜0.05）；給藥28 d 后，多糖、皂苷組小鼠糞便含水率顯著升高（P＜0.05）。玉竹對陰虛小鼠皮膚含水率的影響見圖2-F。與正常組相比，模型組小鼠皮膚含水率顯著下降（P＜0.05）；與模型組相比，多糖組及皂苷組小鼠皮膚含水率顯著增高（P＜0.05）。

圖2 玉竹對陰虛小鼠體質(zhì)量 (A)、體溫 (B)、攝食量 (C)、攝水量 (D)、糞便含水率 (E)、皮膚含水率 (F) 的影響 (,n=6)Fig.2 Effects of P.odoratum on body weight (A),body temperature (B),food intake (C),water intake (D),fecal moisture content (E),and skin moisture content (F) of mice with yin deficiency (,n=6)

3.2.2 玉竹對Na+,K+-ATP 酶、Ca2+,Mg2+-ATP 酶活性的影響 玉竹對Na+,K+-ATP 酶、Ca2+,Mg2+-ATP 酶活性的影響見圖3。結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組小鼠胃、肝、腎組織Na+,K+-ATP 酶、Ca2+,Mg2+-ATP 酶活性顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，多糖組和皂苷組小鼠胃、肝、腎組織中的Na+,K+-ATP 酶、Ca2+,Mg2+-ATP 酶活性顯著下降（P＜0.05）。黃酮組小鼠胃、肝、腎組織Na+,K+-ATP酶、Ca2+,Mg2+-ATP 酶活性未見明顯變化。

圖3 玉竹對陰虛小鼠Na+,K+-ATP 酶、Ca2+,Mg2+-ATP 酶活性的影響 (,n=6)Fig.3 Effects of P.odoratum on Na+,K+-ATPase and Ca2+,Mg2+-ATPase activity of mice with yin deficiency (,n=6)

3.2.3 玉竹對AQP1、AQP3mRNA 表達(dá)的影響 玉竹對AQP1、AQP3mRNA 表達(dá)的影響見圖4。與正常組比較，模型組小鼠肺、胃、腎AQP1、AQP3mRNA 表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，多糖組和皂苷組小鼠肺、胃、腎AQP1、AQP3mRNA表達(dá)顯著升高（P＜0.05），黃酮組小鼠肺、胃、腎AQP1、AQP3mRNA 表達(dá)未見明顯變化。

圖4 玉竹對陰虛小鼠AQP1、AQP3 mRNA 表達(dá)的影響 (,n=6)Fig.4 Effects of P.odoratum on expression of AQP1 and AQP3 mRNA of mice with yin deficiency (,n=6)

3.2.4 基于“效味”的玉竹甘味藥性物質(zhì)的初步確定 綜合分析玉竹多糖、皂苷、黃酮對陰虛小鼠體質(zhì)量、攝食量、攝水量、糞便含水率、皮膚含水率，Na+,K+-ATP 酶、Ca2+,Mg2+-ATP 酶活性及AQP1、AQP3mRNA 表達(dá)的影響，其中，玉竹多糖、皂苷對以上指標(biāo)有顯著的回調(diào)作用，表明玉竹多糖、皂苷對陰虛小鼠有治療作用。因此，基于“效味”，可初步確定玉竹的甘味藥性物質(zhì)為多糖、皂苷類成分。

3.3 基于“滋味”的玉竹甘味藥性物質(zhì)的初步確定

3.3.1 電子舌識別“滋味”的可靠性分析 葡萄糖、鹽酸小檗堿、酒石酸、氯化鉀、谷氨酸鈉五味標(biāo)準(zhǔn)品及蔗糖受試品的PCA 結(jié)果見圖5-A，五味標(biāo)準(zhǔn)品與蔗糖的歐式距離見圖5-B。可以看出，葡萄糖與蔗糖距離最近，說明葡萄糖與蔗糖“滋味”相近或相同，即均為甘味。去除蔗糖受試品，葡萄糖、鹽酸小檗堿、酒石酸、氯化鉀、谷氨酸鈉五味標(biāo)準(zhǔn)品的PCA 結(jié)果見圖5-C，蔗糖在“五味”分區(qū)模型上的投射見圖5-D。結(jié)果顯示，蔗糖歸屬葡萄糖區(qū)域。以上結(jié)果表明，電子舌可準(zhǔn)確識別物質(zhì)“滋味”。

圖5 電子舌識別滋味可靠性分析Fig.5 Reliability analysis of taste recognition by electronic tongue

3.3.2 基于“滋味”的玉竹甘味藥性物質(zhì)的初步確定 中藥“五味”標(biāo)準(zhǔn)品與玉竹多糖、皂苷、黃酮樣品的PCA 結(jié)果見圖6-A，歐式距離見圖6-B。可以看出，玉竹皂苷與甘味中藥距離最近；多糖與甘味、辛味中藥的距離均較近；黃酮與苦味中藥距離最近。除去樣品，中藥“五味”標(biāo)準(zhǔn)品PCA 結(jié)果見圖6-C，玉竹多糖、皂苷、黃酮在“五味”分區(qū)模型上的投射見圖6-D。結(jié)果顯示，皂苷投射于甘味中藥區(qū)域，多糖投射于辛味、甘味中藥2 個(gè)區(qū)域，黃酮?jiǎng)t投射于苦味中藥區(qū)域。因此，基于“滋味”，可初步確定玉竹的甘味藥性物質(zhì)為皂苷。

圖6 玉竹味“甘”藥性物質(zhì)分析Fig.6 Analysis of material basis of “sweet” medicinal properties of P.odoratum

3.4 玉竹“甘味”藥性物質(zhì)與甜味受體的關(guān)聯(lián)性分析

以上結(jié)果表明，基于“效味”，玉竹的甘味藥性物質(zhì)為多糖、皂苷，而基于“滋味”，玉竹的甘味藥性物質(zhì)為皂苷。綜合基于“效味”和“滋味”的結(jié)果，最終確定皂苷為玉竹甘味藥性物質(zhì)。接下來采用整體動(dòng)物考察玉竹皂苷對GLP-1 的分泌的影響，并與玉竹多糖、黃酮對比；采用分子對接考察玉竹皂苷與甜味受體的結(jié)合性，從以上2 個(gè)方面揭示效味、滋味與甜味受體的關(guān)聯(lián)性。

3.4.1 玉竹皂苷對GLP-1 分泌的影響 結(jié)果見圖7。結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組小鼠血清GLP-1 含量顯著下降（P＜0.05）；與模型組相比，皂苷組和多糖組小鼠血清GLP-1 含量顯著增加（P＜0.05），而黃酮組小鼠血清GLP-1 含量無明顯變化。

圖7 “甘味”藥性物質(zhì)對GLP-1 分泌的影響 (,n=6)Fig.7 Effects of material basis of “sweet” medicinal properties on secretion of GLP-1 (,n=6)

3.4.2 玉竹皂苷與甜味受體結(jié)合性分析 “甘味”藥性物質(zhì)玉竹皂苷分別與鼠源甜味受體mT1R2、mT1R3 及人源甜味受體hT1R2、hT1R3 對接結(jié)合，見圖8。結(jié)果顯示，皂苷分子可與甜味受體多個(gè)氨基酸殘基形成結(jié)合鍵；玉竹皂苷分子與mT1R2、mT1R3之間的結(jié)合能分別為-39.3、-31.8 kJ/mol；與hT1R2、hT1R3 之間的結(jié)合能分別為-40.6、-42.3 kJ/mol。可以看出，玉竹皂苷與甜味受體有較好的結(jié)合性。

圖8 玉竹皂苷與甜味受體分子對接圖Fig.8 Docking diagrams of saponin of P.odoratum and sweet receptors

4 討論

研究表明，電子舌可模擬人類味覺感受機(jī)制，根據(jù)傳感器響應(yīng)信號來識別不同味道的物質(zhì)，結(jié)構(gòu)相似的樣品有相近的傳感器響應(yīng)特征[12]。本研究以甘草、黨參、黃芪為標(biāo)準(zhǔn)甘味中藥，結(jié)果顯示皂苷與標(biāo)準(zhǔn)甘味中藥距離最近，且能投射于標(biāo)準(zhǔn)甘味中藥區(qū)域，因此皂苷與標(biāo)準(zhǔn)甘味中藥含有的成分具有“相似性”；采用分子對接分析還發(fā)現(xiàn)，玉竹皂苷與甜味受體有較好的結(jié)合性，表明玉竹皂苷可能是甜味受體的激動(dòng)劑，而葡萄糖、蔗糖是甜味受體的典型激動(dòng)劑，因此基于“配體-受體”的相關(guān)性質(zhì)，玉竹皂苷與葡萄糖在結(jié)構(gòu)上也應(yīng)具有一定“相似性”。基于以上分析，甘味中藥可能含有結(jié)構(gòu)“相似”的成分，通過激活舌頭味蕾細(xì)胞上的甜味受體，傳遞甜味感覺。這不僅在一定程度上揭示了“滋味”與甜味受體之間存在關(guān)聯(lián)的分子機(jī)制，還闡明了甘味中藥滋味為“甘”的生物學(xué)基礎(chǔ)，即從“滋味”的角度，能激活舌頭味蕾細(xì)胞上的甜味受體的成分，均可確定為甘味藥性物質(zhì)。

本研究采用陰虛小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，玉竹皂苷可促進(jìn)GLP-1 的分泌。GLP-1 可促進(jìn)胰島素的分泌，而胰島素可改變葡萄糖在細(xì)胞內(nèi)外的分布從而改善陰虛證（癥狀）；同時(shí)研究表明，甜味信號通路中的環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）、蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）、Ca2+等信號分子與AQPs 均存在密切聯(lián)系[13]，且Ca2+還能調(diào)節(jié)Na+,K+-ATP 酶的活性[14]。可見，甜味受體還可通過甜味通路上的信號分子作用AQPs、Na+,K+-ATP 酶，發(fā)揮抗“陰虛”作用。這不僅在一定程度上揭示了“效味”與甜味受體之間存在關(guān)聯(lián)的分子機(jī)制，還闡明了甘味中藥效應(yīng)為“補(bǔ)”的生物學(xué)基礎(chǔ)，即從“效味”的角度，能激活胃腸組織上的甜味受體的成分，均可確定為甘味藥性物質(zhì)。需要指出的是，玉竹多糖也可促進(jìn)GLP-1 的分泌，結(jié)合分子對接結(jié)果分析，玉竹多糖可能并不是通過激動(dòng)甜味受體來促進(jìn)GLP-1的分泌，可能存在其他機(jī)制。

玉竹功能養(yǎng)陰潤燥、生津止渴，臨床主要用于胃陰虛、肺陰虛。陰虛證臨床證候表現(xiàn)多樣，但基于陰虛“陰液虧損”“陽亢內(nèi)熱”的病機(jī)，水液代謝、能量代謝是陰虛重點(diǎn)關(guān)注的2 個(gè)方面。一般而言，水液代謝與AQPs 有關(guān)，而能量代謝與Na+,K+-ATP酶、Ca2+,Mg2+-ATP 酶有密切關(guān)聯(lián)。有研究表明，陰虛可導(dǎo)致AQPs 表達(dá)下調(diào)[15]，Na+,K+-ATP 酶、Ca2+,Mg2+-ATP 酶活性升高[16]。水液代謝紊亂進(jìn)一步導(dǎo)致大便干燥、皮膚干澀、口干咽燥、多飲的癥狀[17]，而能量代謝紊亂則可導(dǎo)致體溫升高[18]。但也有研究表明，陰虛動(dòng)物體溫與正常動(dòng)物無明顯差異[19]。本研究發(fā)現(xiàn)玉竹多糖、皂苷對陰虛小鼠的體質(zhì)量、攝食量、攝水量、大便含水率、皮膚含水率，Na+,K+-ATP酶、Ca2+,Mg2+-ATP 酶活性及AQP1、AQP3mRNA的表達(dá)均有明顯的回調(diào)作用，而玉竹黃酮的回調(diào)作用不明顯，據(jù)此初步確定玉竹的甘味藥性物質(zhì)為多糖、皂苷。需要指出的是，陰虛證臨床證候表現(xiàn)多樣，因此評價(jià)藥物的“抗陰虛”作用也有Na+,K+-ATP 酶、Ca2+,Mg2+-ATP 酶活性，AQP1、AQP3mRNA，飲水量、大便含水量、皮膚含水量等多個(gè)指標(biāo)，因此基于各指標(biāo)的權(quán)重構(gòu)建一個(gè)綜合指標(biāo)評價(jià)藥物的“抗陰虛”作用可能更合理。

目前，基于效味探索五味藥性物質(zhì)是藥性物質(zhì)研究的一種主要方法，其可概括為“有效物質(zhì)即為藥性物質(zhì)”。可以看出，這種研究方法與現(xiàn)代藥理學(xué)研究方法類似。然而，中藥不能簡單看成是有效物質(zhì)與無效物質(zhì)的集合體，因?yàn)椤坝行А迸c“無效”并不能截然分開，有時(shí)“有效”與“無效”之間還能相互轉(zhuǎn)化。因此，僅僅基于“效味”探索五味藥性物質(zhì)，可能還存在一定的局限性。事實(shí)上，中藥“味”的確定最初是依據(jù)藥物的真實(shí)“滋味”。《黃帝內(nèi)經(jīng)·素問》記載：“五氣入鼻、五味入口”[20]。因此，中藥五味藥性物質(zhì)基礎(chǔ)研究，不僅要關(guān)注“效味”，還要關(guān)注“滋味”。本研究以玉竹為研究對象，基于甜味受體整合中藥“效味”和“滋味”挖掘玉竹甘味藥性物質(zhì)，研究結(jié)果為中藥五味藥性物質(zhì)的研究提供了新視角，同時(shí)研究結(jié)果對玉竹藥材的質(zhì)量評價(jià)也提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突