甘草酸替代膽固醇構(gòu)建載雷公藤甲素的脂質(zhì)納米粒的適宜性研究

徐資怡，陳佳美，鐘雪梅，吳億晗，章津銘

成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，西南特色中藥資源國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611137

雷公藤甲素（triptolide，Tr）是從衛(wèi)矛科雷公藤屬植物雷公藤Tripterygium wilfordiiHook f.中提取出的環(huán)氧二萜內(nèi)酯化合物，具有廣譜、高效的抗腫瘤作用，其抗腫瘤作用機(jī)制包括誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、干擾細(xì)胞周期、抑制血管生成、抑制端粒酶活性、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬等[1-2]。尤其對(duì)于在我國(guó)具有高發(fā)病率和高死亡率的肝癌，Tr 具有顯著療效，其抗肝癌活性在細(xì)胞模型和動(dòng)物模型上甚至強(qiáng)于阿霉素、索拉非尼等臨床一線(xiàn)藥物，是目前極具潛力的候選藥物[3-4]。然而，Tr 水溶性差、治療窗窄，對(duì)腫瘤組織/細(xì)胞分布缺乏專(zhuān)屬性，容易造成對(duì)肝腎組織、血液系統(tǒng)的毒副作用[5-7]。

納米載體具有較強(qiáng)的載藥能力、體內(nèi)長(zhǎng)循環(huán)、腫瘤組織被動(dòng)/主動(dòng)靶向、減少藥物不良反應(yīng)等優(yōu)勢(shì)[8]。課題組前期構(gòu)建了多種納米載體用于Tr 抗腫瘤的高效遞送[9-11]。脂質(zhì)體是目前應(yīng)用最成熟和廣泛的抗腫瘤藥物遞送載體，膽固醇是其重要組成部分，具有維持脂質(zhì)體磷脂雙分子層膜穩(wěn)定性的作用，但膽固醇易受氧、光、金屬等外界條件的影響，在加工儲(chǔ)存過(guò)程中產(chǎn)生膽固醇氧化產(chǎn)物，具有一定的細(xì)胞毒性、致突變性和潛在致癌性[12-14]；此外，攝入過(guò)量膽固醇可能引起高脂血癥、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病[15-16]。高膽固醇水平與腫瘤發(fā)生發(fā)展也有相關(guān)性，膽固醇還可能誘發(fā)“補(bǔ)體介導(dǎo)的假過(guò)敏反應(yīng)”，導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓等心肺副作用[17-18]。

篩選與膽固醇結(jié)構(gòu)相似，用以構(gòu)建不含膽固醇的脂質(zhì)納米體系是目前研究熱點(diǎn)之一，具有良好的研究和應(yīng)用前景。植物中的甾醇和皂苷，如類(lèi)胡蘿卜素、大豆甾醇、人參皂苷等，已被證明具有類(lèi)似于膽固醇的類(lèi)固醇結(jié)構(gòu)、熱致相行為和抗脂質(zhì)體氧化的作用，將其替代膽固醇構(gòu)建脂質(zhì)納米載體，可以有效改善含膽固醇的磷脂雙層理化性質(zhì)[19]。研究者發(fā)現(xiàn)，部分中藥三萜皂苷成分與膽固醇結(jié)構(gòu)相似，且具有良好藥理活性，用以替換膽固醇，既能保持脂質(zhì)體載藥性能，又賦予脂質(zhì)體新的藥效或靶向性能，體現(xiàn)出“藥輔合一”的特點(diǎn)[14]。復(fù)旦大學(xué)王建新教授團(tuán)隊(duì)[18]將人參皂苷Rh2代替膽固醇作為脂質(zhì)體關(guān)鍵膜材，制備遞送紫杉醇的脂質(zhì)納米粒，藥輔兩用，利用人參皂苷Rh2與葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體結(jié)合提高納米粒腫瘤靶向性，而且發(fā)揮其自身抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用，從而賦予納米載體高穩(wěn)定性、長(zhǎng)循環(huán)、主動(dòng)靶向和免疫調(diào)節(jié)等多種功能。

甘草酸是豆科甘草屬植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的主要活性成分之一，屬于齊墩果烷型五環(huán)三萜皂苷，具有較好的抗腫瘤活性[20]。甘草酸具有兩親性類(lèi)似于表面活性劑的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)[21]，可與細(xì)胞膜上的膽固醇或磷脂相互作用，改變脂質(zhì)流動(dòng)性，增加細(xì)胞膜通透性和藥物跨膜能力[22-23]。此外，研究證實(shí)肝癌細(xì)胞表面存在大量甘草酸特異性結(jié)合位點(diǎn)[24-25]，經(jīng)甘草酸修飾的納米載體具有更強(qiáng)的肝癌靶向能力。

因此，本實(shí)驗(yàn)擬采用甘草酸替代膽固醇作為脂質(zhì)膜材，將其用于Tr 的包載和抗腫瘤遞送，制備一種新型載雷公藤甲素的甘草酸脂質(zhì)納米粒（glycyrrhizic acid lipid nanoparticles loaded with triptolide，Tr@GLN）。通過(guò)對(duì)比考察Tr@GLN 與膽固醇為膜材的載雷公藤甲素脂質(zhì)體（cholesterol lipid nanoparticles loaded with triptolide，Tr@CLN）的理化性質(zhì)、載藥性能、體外細(xì)胞攝取能力、荷瘤肝癌小鼠模型抗腫瘤作用等方面，從而揭示甘草酸替代膽固醇構(gòu)建脂質(zhì)納米粒并作為T(mén)r 遞藥載體的適宜性，為其抗腫瘤遞送提供了新思路。

1 儀器與材料

1.1 儀器

UltiMate 3000 型高效液相色譜（HPLC）儀，美國(guó)Thermo Fisher 公司；DF-101S 型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，上海邦西儀器科技有限公司；Litesizer 500 納米粒度及ζ 電位分析儀，上海安東帕商貿(mào)有限公司；YMNL-1000Y 超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，南京以馬利儀器設(shè)備有限公司；JEM-1230 透射電子顯微鏡，日本JEOL 公司；TSC SP8 STED 激光掃描共聚焦顯微鏡，德國(guó)Leica 公司。

1.2 藥品與試劑

Tr，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號(hào)DSTDL003401，成都德思特生物技術(shù)有限公司；甘草酸，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%，批號(hào)D1213A，天津美倫醫(yī)藥有限公司；蛋黃卵磷脂，批號(hào)AL20002，上海艾偉拓醫(yī)藥科技有限公司；膽固醇，批號(hào)C104028，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；DMEM 培養(yǎng)液、0.25%胰蛋白酶、青-鏈霉素溶液，美國(guó)Gibco 公司；胎牛血清（FBS），杭州四季青公司；激光共聚焦皿，北京碩華佰奧生物科技有限公司；乙腈，色譜純，上海西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司；磷酸，色譜純，成都市諾爾施科技有限責(zé)任公司；水為超純水；其他試劑均為分析純。

1.3 細(xì)胞株及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

人肝癌HepG2 細(xì)胞、小鼠肝癌H22 細(xì)胞均購(gòu)自中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。ICR（institute of cancer research）小鼠，SPF 級(jí)，體質(zhì)量20～25 g，雄性，購(gòu)于北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)SCXK（京）2019-0010。飼養(yǎng)條件：溫度為20～26 ℃，濕度為40%～70%。實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物自由進(jìn)食、飲水，晝夜節(jié)律正常。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)獲得成都中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)2020DL-126。

2 方法與結(jié)果

2.1 Tr@GLN 和Tr@CLN 的制備

采用乙醇注入法分別制備 Tr@GLN、Tr@CLN[26-29]。稱(chēng)取6 mg 甘草酸或膽固醇、30 mg 蛋黃卵磷脂以及1 mg Tr 完全溶解于2 mL 乙醇中，作為有機(jī)相。將有機(jī)相緩慢勻速滴入10 mL 水相（純水）中，邊滴加邊攪拌，滴加完畢后于在磁力攪拌器上37 ℃恒溫400 r/min 攪拌1 h。待有機(jī)溶劑揮盡后，用超聲波細(xì)胞破碎儀冰浴探超5 min，超聲破碎3 s，間歇2 s。最后用0.45 μm 微孔濾膜濾過(guò)，得到白色乳光的Tr@GLN 和Tr@CLN 溶液。

2.2 Tr@GLN 和Tr@CLN 的表征

2.2.1 粒徑、多分散指數(shù)（polydispersity，PDI）與ζ 電位考察 分別取一定體積的樣品溶液于粒徑池和電位池中，利用納米粒度及ζ 電位分析儀測(cè)定其粒徑、PDI 及ζ 電位值。結(jié)果顯示，采用乙醇注入法制備得到Tr@GLN 和Tr@CLN 均為帶乳白色乳光的透明液體，如圖1-IA、IIA 所示；其粒徑相差不大，分別為（115.59±1.23）、（97.28±0.95）nm，PDI 分別為0.18±0.03、0.22±0.02，均小于0.3，制備的Tr@GLN 粒徑均勻度、分散性較好，見(jiàn)圖1-IB、IIB。ζ 電位分別為（-19.63±3.14）、（-7.77±0.12）mV，表明Tr@GLN 各微粒之間帶有一定程度的負(fù)電性，這對(duì)脂質(zhì)納米粒的相互聚集有一定的抑制作用，有助于增強(qiáng)脂質(zhì)體體系的穩(wěn)定性。

2.2.2 形態(tài)學(xué)考察 取10 μL 樣品溶液于碳膜銅網(wǎng)上，靜置1 min 后將多余液體從銅網(wǎng)邊緣除去。再將3%磷鎢酸水溶液滴加1 滴至銅網(wǎng)表面，負(fù)染2 min 后用濾紙吸附多余染料，待液體揮干后在TEM下拍攝其形態(tài)，結(jié)果見(jiàn)圖1-IC、IIC。通過(guò)TEM 拍攝顯示，Tr@CLN 呈類(lèi)橢圓形的多層結(jié)構(gòu)；相比Tr@CLN，Tr@GLN 的形貌呈更加均勻圓整球形，具有多層結(jié)構(gòu)，分散性適中。

圖1 Tr@GLN (I) 和Tr@CLN (II) 的外觀 (A)、粒徑分布 (B)、TEM 形態(tài) (C,比例尺為100 nm)Fig.1 Appearance (A),particle size distribution (B),TEM morphology (C,scale bar is 100 nm) of Tr@GLN (I) and Tr@CLN(II)

2.2.3 儲(chǔ)存穩(wěn)定性考察 將Tr@CLN、Tr@GLN 密封放置于4 ℃冰箱保存，連續(xù)7 d 測(cè)量其粒徑、ζ 電位值變化，結(jié)果如表1 所示，兩者粒徑在低溫儲(chǔ)存條件下具有穩(wěn)定的粒徑和ζ 電位，表明甘草酸代替膽固醇后可以得到穩(wěn)定的脂質(zhì)體。

表1 Tr@GLN 和Tr@CLN 的存儲(chǔ)穩(wěn)定性 (,n=3)Table 1 Storage stability of Tr@GLN and Tr@CLN(,n=3)

表1 Tr@GLN 和Tr@CLN 的存儲(chǔ)穩(wěn)定性 (,n=3)Table 1 Storage stability of Tr@GLN and Tr@CLN(,n=3)

2.3 Tr@GLN 和Tr@CLN 的包封率及載藥量測(cè)定

2.3.1 HPLC 色譜條件

（1）TP 測(cè)定條件[11]：色譜柱為Welch Ultimate XB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為純水-甲醇（54∶46）；檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm；體積流量1.0 mL/min；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

（2）甘草酸測(cè)定條件[30]：色譜柱為 Welch Ultimate XB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為0.1%磷酸水溶液-甲醇（25∶75）；檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm；體積流量1.0 mL/min；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.3.2 供試品溶液和對(duì)照品溶液的制備 取2 mL甲醇于1 mL Tr@CLN 或Tr@GLN 溶液中，渦旋、超聲破乳，使得制備的脂質(zhì)體完全破壞，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜，即得供試品溶液。

分別精密稱(chēng)取Tr 對(duì)照品、甘草酸對(duì)照品于10 mL量瓶中，用甲醇溶液定容，得到1 mg/mL Tr 對(duì)照品母液和2.06 mg/mL 甘草酸對(duì)照品母液。

2.3.3 專(zhuān)屬性考察 取“2.3.2”項(xiàng)供試品溶液和對(duì)照品溶液，分別按照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。結(jié)果如圖2、3 所示，可知Tr 和甘草酸的保留時(shí)間分別為10.77、8.53 min，供試品溶液和對(duì)照品溶液出峰時(shí)間相同，供試品溶液中的溶劑和輔料對(duì)Tr 和甘草酸的測(cè)定無(wú)干擾。

圖2 Tr 對(duì)照品 (A)、Tr@GLN 樣品 (B) 和Tr@CLN 樣品 (C) 的HPLC 圖譜Fig.2 HPLC of triptolide reference substance (A),Tr@GLN sample (B) and Tr@CLN sample (C)

圖3 甘草酸對(duì)照品 (A) 和Tr@GLN 樣品 (B) 的HPLC 圖Fig.3 HPLC of glycyrrhizic acid reference substance (A)and Tr@GLN sample (B)

2.3.4 線(xiàn)性關(guān)系考察 分別取“2.3.2”項(xiàng)Tr、甘草酸對(duì)照品溶液，用甲醇分別稀釋成500、250、125、62.5、31.25、15.625 μg/mL Tr 對(duì)照品溶液和1 030、515、257.5、128.75、64.375、32.187 5 μg/mL 甘草酸對(duì)照品溶液，過(guò)0.22 μm 濾膜，進(jìn)樣。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程分別為T(mén)rY=17 537X+134 487，r=0.999 0，線(xiàn)性范圍500～15.625 μg/mL；甘草酸Y=5 822.6X+79 001，r=0.999 0，線(xiàn)性范圍1 030～32.187 5 μg/mL，表明在定量范圍內(nèi)各質(zhì)量濃度與峰面積線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.3.5 精密度試驗(yàn) 取“2.3.2”項(xiàng)下Tr@GLN 和Tr@CLN 供試品溶液，分別連續(xù)進(jìn)樣6 次，計(jì)算Tr@GLN 樣品中的Tr 和甘草酸峰面積的RSD 分別為0.51%、0.58%，Tr@CLN 樣品中的Tr 和甘草酸峰面積的RSD 分別為0.48%、0.63%，說(shuō)明儀器精密度良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.3.2”項(xiàng)下Tr@GLN 和Tr@CLN 供試品溶液，分別于制備后0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣分析，計(jì)算Tr@GLN 樣品中的Tr 和甘草酸峰面積的RSD 分別為0.23%、0.41%，Tr@CLN 樣品中的Tr 和甘草酸峰面積的RSD 分別為0.59%、0.62%，說(shuō)明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 按照“2.3.2”項(xiàng)方法配制Tr@GLN 和Tr@CLN 供試品溶液，平行6 份，進(jìn)樣，計(jì)算Tr@GLN 樣品中的Tr 和甘草酸質(zhì)量濃度的RSD 分別為1.28%、1.07%，Tr@CLN 樣品中的Tr和甘草酸質(zhì)量濃度的RSD 分別為1.23%、1.04%，說(shuō)明該方法重復(fù)性良好。

2.3.8 加樣回收率試驗(yàn) 取6 份已測(cè)定Tr 和甘草酸含量的Tr@GLN 溶液各500 μL，分別加入Tr 對(duì)照品溶液（1 mg/mL）500 μL，甘草酸對(duì)照品溶液（2.06 mg/mL）500 μL，隨后渦旋、超聲處理，過(guò)0.22 μm 微孔濾膜。平行6 份，進(jìn)樣，計(jì)算Tr 和甘草酸的平均加樣回收率分別為100.07%、99.43%，RSD分別為1.84%、1.50%，表明該方法回收率良好。

另取6 份已測(cè)定Tr 含量的Tr@CLN 溶液各500 μL，分別加入Tr 對(duì)照品溶液（1 mg/mL）500 μL，隨后渦旋、超聲處理，過(guò)0.22 μm 微孔濾膜。平行6 份，進(jìn)樣，計(jì)算得Tr 的平均加樣回收率為99.48%，RSD 為1.83%，表明該方法回收率良好。

2.3.9 包封率和載藥量的測(cè)定 取2 mL 甲醇分別于1 mL Tr@GLN 和Tr@CLN 樣品溶液中，渦旋、超聲破乳，使得制備的脂質(zhì)體完全破壞，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜，用高效液相測(cè)定樣品中甘草酸與Tr 含量，根據(jù)公式分別計(jì)算包封率和載藥量。

W0為脂質(zhì)納米粒或脂質(zhì)體中藥物含量，W1為藥物投加量，W2為脂質(zhì)納米粒或脂質(zhì)體材料量

計(jì)算得到Tr@GLN 和Tr@CLN 中Tr 的包封率分別為（89.70±0.39）%、（87.39±0.37）%，載藥量分別為（2.25±0.01）%、（2.31±0.01）%；Tr@GLN中的甘草酸包封率為（87.46±0.65）%，載藥量為（13.41±0.09）%。

2.4 Tr@GLN 和Tr@CLN 的體外釋放行為考察

分別將3 mL Tr@CLN、Tr@GLN 溶液置于透析袋（截留相對(duì)分子質(zhì)量3500）中，將透析袋浸入到30 mL 含有0.1%聚山梨酯80 的磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）中，放入搖床，37 ℃、100 r/min 條件下振搖。分別于0.5、1、2、3、4、6、8、12、24 h 取1 mL 釋放介質(zhì)，并補(bǔ)充相同體積的新鮮釋放介質(zhì)。加入2 mL 甲醇到所取釋放介質(zhì)中，渦旋、超聲破乳后，過(guò)0.22 μm 有機(jī)濾膜，采用HPLC 測(cè)得Tr含量，并計(jì)算累積釋放率。結(jié)果如圖4 所示，Tr@GLN 和Tr@CLN 都在8 h 內(nèi)達(dá)到飽和，累積釋放率分別為52.92%、73.38%。Tr@GLN 中Tr 在24 h 內(nèi)釋放較Tr@CLN 緩慢，說(shuō)明甘草酸作為膜材料替代膽固醇可以使脂質(zhì)體更加穩(wěn)定，具有一定緩釋作用。

圖4 Tr@CLN 和Tr@GLN 的體外釋藥情況Fig.4 In vitro release of Tr@CLN and Tr@GLN

2.5 Tr@GLN 和Tr@CLN 在HepG2 細(xì)胞攝取能力考察

考慮到Tr 無(wú)熒光，本研究采用帶綠色熒光的香豆素6（coumarin 6，C6）作為表征藥物，按照“2.1”項(xiàng)方法制備得到C6@CLN、C6@GLN。將HepG2細(xì)胞以1×105個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種到激光共聚焦培養(yǎng)皿中并培養(yǎng)過(guò)夜。待細(xì)胞貼壁后，將培養(yǎng)基分別更換為含有等量C6 質(zhì)量濃度（100 ng/mL）的游離C6、C6@CLN、C6@GLN 的低血清新鮮培養(yǎng)基。于37 ℃培養(yǎng)箱孵育4 h 后，棄去培養(yǎng)基，用冷PBS洗滌2 次。加入4%多聚甲醛固定15 min，用冷PBS洗滌2 次，再加入Hoechst 33342 染細(xì)胞核10 min，用PBS 清洗后加入1 滴防熒光猝滅劑，采用激光共聚焦顯微鏡觀察HepG2 細(xì)胞對(duì)C6@GLN 的攝取情況。結(jié)果如圖5 所示，C6 呈綠色熒光，C6/GLLNP的熒光強(qiáng)度顯著高于游離C6 和C6@CLN，表明GLN 可以增加HepG2 細(xì)胞對(duì)游離藥物的攝取，并且HepG2 細(xì)胞對(duì)其攝取優(yōu)于C6@CLN，這可能與肝癌細(xì)胞膜表面具有甘草酸受體相關(guān)[31]。

圖5 游離熒光探針C6、C6@CLN、C6@GLN (C6 質(zhì)量濃度均為100 ng·mL-1) 孵育4 h 后HepG2 細(xì)胞攝取情況 (藍(lán)色熒光為細(xì)胞核染色，綠色熒光為攝取進(jìn)細(xì)胞的C6，比例尺為25 μm)Fig.5 Uptake of HepG2 cells with free fluorescent probes C6,C6@CLN and C6@GLN (mass concentration of C6 was 100 ng·mL-1) after incubation for 4 h (blue fluorescence is nuclear staining,green fluorescence is C6 absorbed into cells,scale bar is 25 μm)

2.6 Tr@GLN 和Tr@CLN 的體內(nèi)抗腫瘤活性研究

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H22 細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化后離心，用PBS 洗滌2 次并重懸后調(diào)整其密度為1×107個(gè)/mL，取100 μL 于小鼠皮下接種。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到100 mm3左右時(shí)，將小鼠隨機(jī)分為6 組，分別給予生理鹽水（對(duì)照）、Tr@GLN、Tr@CLN、游離Tr、游離甘草酸、游離Tr+游離甘草酸，其中Tr 給藥劑量為0.35 mg/kg，甘草酸給藥劑量為2.38 mg/kg。每2 天給藥1 次，給藥當(dāng)天測(cè)量體質(zhì)量和腫瘤體積，第12 天處死小鼠[10,32]。使用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤體積，分別按公式計(jì)算腫瘤體積以及抑制率。

L為腫瘤最長(zhǎng)直徑，D為腫瘤最短直徑，Vt為腫瘤體積，Wc和Wt分別代表對(duì)照組和各治療組的腫瘤質(zhì)量

采用t檢驗(yàn)分析比較各組數(shù)據(jù)，P＜0.05 認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果如表2 所示，與對(duì)照組相比，游離Tr 組、游離甘草酸組、游離Tr+游離甘草酸組的腫瘤體積均有不同程度的減小，抑瘤率分別為18.26%、56.80%、49.70%，說(shuō)明Tr 與甘草酸均具有一定的抗腫瘤活性。游離Tr+游離甘草酸組對(duì)腫瘤的抑制作用甚至強(qiáng)于Tr@CLN 組，這可能是由于甘草酸具有調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞極化以及減少腫瘤新生血管生成作用，使得游離Tr 與甘草酸聯(lián)用抗腫瘤效果優(yōu)于單用Tr 的Tr@CLN 組。

表2 治療期間各組皮下荷瘤肝癌小鼠腫瘤體積變化Table 2 Changes in tumor volume of subcutaneous hepatocellular carcinoma mice in each group during treatment

Tr@GLN 組對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用顯著強(qiáng)于游離Tr 組（P＜0.05），進(jìn)一步證明所制備得到的Tr@GLN 由于滲透滯留效應(yīng)（enhanced permeability and retention effect，EPR）以及主動(dòng)靶向性使得其抗腫瘤作用明顯優(yōu)于游離Tr。此外，Tr@GLN 組與對(duì)照組相比，對(duì)腫瘤生長(zhǎng)有顯著抑制效果（P＜0.05），抑瘤率為78.9%，高于Tr@CLN 組（抑瘤率為42.4%），這可能是由于GLN 本身具有調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞極化作用，將Tr 包載于GLN 中，使得Tr 與甘草酸共達(dá)腫瘤部位對(duì)抗腫瘤。

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，小鼠腫瘤拍照結(jié)果和腫瘤質(zhì)量同樣表明，Tr@GLN 具有最佳抗腫瘤效果（圖6 和表3）。在整個(gè)治療期間，各組小鼠體質(zhì)量均有相應(yīng)增加，表明在Tr 安全給藥劑量下，Tr@GLN 并未表現(xiàn)出毒性，在體內(nèi)安全性良好（表4）。

表3 第12 天各組小鼠離體腫瘤組織質(zhì)量Table 3 Weight of tumor tissue in vitro of mice in each group on day 12

表4 治療期間各組皮下荷瘤肝癌小鼠體質(zhì)量變化Table 4 Body weight changes of subcutaneous tumor-bearing hepatoma mice in each group during treatment

圖6 皮下荷瘤肝癌小鼠的離體腫瘤組織圖Fig.6 In vitro tumor tissue diagram of subcutaneous tumorbearing hepatoma mice

2.7 Tr@GLN 和Tr@CLN 的體內(nèi)抗腫瘤機(jī)制研究

為了進(jìn)一步證實(shí)組織學(xué)水平的抗腫瘤作用，在第12 天治療結(jié)束后，將所有小鼠處死，切取腫瘤組織進(jìn)行蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，HE 染色）、重組Ki-67 蛋白（recombinant Ki-67 protein，Ki-67，腫瘤細(xì)胞增殖標(biāo)志物）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF，腫瘤新生血管標(biāo)志物）免疫組織化學(xué)分析并對(duì)腫瘤組織進(jìn)行分化群86（cluster of differentiation 86，CD86，M1 型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物）、分化群206（cluster of differentiation 206，CD206，M2 型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物）和小鼠含生長(zhǎng)因子樣模體黏液樣激素樣受體（mouse EGF-like module-containing mucin-like hormone receptor-like 1，F(xiàn)4/80，總巨噬細(xì)胞標(biāo)志物）免疫熒光染色。結(jié)果如圖7 所示，對(duì)照組的腫瘤細(xì)胞很少觀察到凋亡或壞死，而其他各治療組均能觀察到腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核呈現(xiàn)不同程度的皺縮和數(shù)量減少。其中Tr@GLN 組的腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)嚴(yán)重的凋亡損傷甚至壞死，說(shuō)明Tr@GLN 具有最強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞殺傷能力，抗腫瘤效果優(yōu)于Tr@CLN，這與上述動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同。

圖7 小鼠腫瘤組織中Ki-67 和VEGF 的HE 染色和免疫組化染色 (比例尺為100 μm)Fig.7 HE staining and immunohistochemical staining of Ki-67 and VEGF in tumor tissues of mice (scale bar is 100 μm)

課題組前期研究已經(jīng)證實(shí)甘草次酸通過(guò)抑制腫瘤血管新生，協(xié)同化療藥物抗腫瘤[33]。甘草酸作為甘草中另一主要成分，研究發(fā)現(xiàn)其同樣具有抗腫瘤血管新生作用[34-36]，為了證實(shí)Tr@GLN 可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡和抗腫瘤血管新生，通過(guò)Ki67 和VEGF的免疫組織化學(xué)進(jìn)行了評(píng)估。

結(jié)果顯示，Tr@GLN 處理組Ki67 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)遠(yuǎn)低于對(duì)照組。游離Tr 組和Tr@CLN 組VEGF 表達(dá)相比于對(duì)照組沒(méi)有明顯減少，而游離甘草酸組、游離Tr+游離甘草酸組與Tr@GLN 組腫瘤新生血管均有相應(yīng)的減少，且Tr@GLN 組VEGF 的表達(dá)水平顯著降低，表明甘草酸具有一定抑制腫瘤新血管形成能力且Tr@GLN 具有更加優(yōu)異的抗腫瘤新血管生成能力，這可能是由于Tr@GLN 具有更加強(qiáng)烈的腫瘤靶向性。研究發(fā)現(xiàn)甘草酸具有多種活性，尤其對(duì)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor associated macrophages，TAM）極化調(diào)節(jié)作用，可能為其抗腫瘤免疫調(diào)節(jié)角度提供思路。采用免疫熒光染色對(duì)小鼠腫瘤組織進(jìn)行CD86、CD206 和F4/80 免疫熒光染色探究Tr@GLN 對(duì)腫瘤微環(huán)境中巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)作用。結(jié)果如圖8 所示，綠色熒光表示總巨噬細(xì)胞，紅色熒光表示M1 型巨噬細(xì)胞（M1 TAM）或M2 型巨噬細(xì)胞（M2 TAM）。結(jié)果顯示，對(duì)照組中標(biāo)記M1 TAM（F4/80+/CD86+）的紅色熒光最少，標(biāo)記M2 TAM（F4/80+/CD206+）的紅色熒光最多，經(jīng)過(guò)治療后，在給予甘草酸治療的組中，M1 TAM 增加和M2 TAM 減少較為明顯，同時(shí)可以明顯觀察到Tr@GLN組的M1 TAM 最多，M2 TAM 最少。上述結(jié)果提示甘草酸可以誘導(dǎo)腫瘤巨噬細(xì)胞向M1 型極化，改善腫瘤免疫抑制，通過(guò)將甘草酸代替膽固醇制備為GLLNP，不僅可以增加甘草酸在腫瘤部位的累積，同時(shí)使得載體自身具有藥效，進(jìn)一步逆轉(zhuǎn)腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）中的免疫抑制環(huán)境。

圖8 小鼠腫瘤組織中CD206 和CD86 的免疫熒光染色 (比例尺為100 μm)Fig.8 Immunofluorescence staining for CD206 and CD86 in tumor tissues of mice (scale bar is 100 μm)

2.8 Tr@GLN 和Tr@CLN 的體內(nèi)生物安全性考察

考慮到Tr 具有嚴(yán)重毒性，治療結(jié)束后，收集各組小鼠主要組織器官（心、肝、脾、肺、腎），經(jīng)多聚甲醛固定后制成石蠟切片，進(jìn)行HE 染色，檢測(cè)器官毒性。結(jié)果如圖9 所示，結(jié)果顯示，游離Tr 組肝臟組織病理學(xué)病變較對(duì)照組更嚴(yán)重，表現(xiàn)為肝細(xì)胞變性，細(xì)胞腫脹，胞質(zhì)疏松淡染，淋巴細(xì)胞呈灶性浸潤(rùn)。然而，Tr@GLN 組的病變較輕，這表明肝損傷是由游離Tr 給藥引起的，所制備的制劑減少了Tr 毒性，體內(nèi)安全性較好。

圖9 各組小鼠心、肝、脾、肺、腎的HE 染色 (比例尺為100 μm)Fig.9 HE staining of heart,liver,spleen,lung,and kidney of mice in each group (scale bar is 100 μm)

3 討論

納米藥物遞送系統(tǒng)近年來(lái)在癌癥治療方面取得了顯著成果。藥物經(jīng)納米粒遞送，可有效改善藥物自身性質(zhì)，增加藥物在腫瘤組織的分布，延長(zhǎng)藥物在生物體內(nèi)的滯留時(shí)間。然而，當(dāng)2 種藥物共遞送時(shí)存在基質(zhì)效應(yīng)和競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，物理包載方式很難實(shí)現(xiàn)2 種藥物高包封率，藥物比例難以穩(wěn)定，而化學(xué)鍵合的方式，制備工藝復(fù)雜，難以實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。因此，亟需探索一種新的藥物共載納米遞藥體系的構(gòu)建方式和思路。

“藥輔合一”是中藥制劑學(xué)中獨(dú)特的用藥理念、制藥經(jīng)驗(yàn)與哲學(xué)智慧。將藥物作為納米材料或替代原有材料的一部分，開(kāi)發(fā)“藥輔合一”的新型納米遞藥系統(tǒng)有望解決這一難題。例如將中藥活性成分白及多糖進(jìn)行改性得到兩親性結(jié)構(gòu)，在水中自組裝形成負(fù)載多西紫杉醇的納米粒，與人工合成的聚合物相比，天然多糖顯示出許多有益的生物特性，包括無(wú)毒、生物降解性和非免疫原性同時(shí)通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞增殖抗腫瘤[37]。除多糖外，生物大分子核酸因其尺寸小、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定而靈活、編碼性強(qiáng)、易于操作等優(yōu)勢(shì)，使其既可以作為納米載體又可以作為核酸藥物來(lái)解決生命科學(xué)中的重要問(wèn)題[38]。

本研究立足于目前研究最深入、產(chǎn)業(yè)化最成熟的納米遞藥載體脂質(zhì)體[39]，利用甘草酸替代傳統(tǒng)脂質(zhì)體的膜穩(wěn)定劑膽固醇，制備“藥輔合一”的新型脂質(zhì)納米粒，解決了傳統(tǒng)脂質(zhì)體靶向效率低、難以完全治療復(fù)雜的TME、膽固醇帶來(lái)的不良反應(yīng)等問(wèn)題[40-42]。然而本研究所制備的GLN 仍然可能存在一些不足：（1）甘草酸作為一種皂苷類(lèi)成分，存在一定溶血性，將其制備為脂質(zhì)體是否能減少其帶來(lái)的溶血性亟需實(shí)驗(yàn)證明。（2）研究發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)體的快速清除與網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)（reticuloendothelial system，RES）的不可逆攝取有關(guān)[43]。脂質(zhì)體進(jìn)入生物介質(zhì)后，脂質(zhì)體迅速與各種蛋白質(zhì)結(jié)合形成蛋白冠，被RES 識(shí)別和捕獲，使得到達(dá)腫瘤部位的藥物減少[44-45]。因此，GLN 相比普通脂質(zhì)體是否能減少蛋白冠的形成，需要進(jìn)一步驗(yàn)證。（3）Tr@GLN 還需要進(jìn)一步研究在體外的抗腫瘤作用及機(jī)制。（4）GLN 能夠增加肝癌HepG2 細(xì)胞對(duì)藥物的攝取，但對(duì)于其體內(nèi)的靶向能力還需后續(xù)實(shí)驗(yàn)證明。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突