大白菜枯萎病生防木霉菌的篩選及其防治效果

宋雨萌，劉文杰，戶喜朝，袁忠林，羅 蘭

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)植物醫(yī)學(xué)學(xué)院·山東省植物病蟲害綠色防控工程研究中心 山東青島 266109）

大白菜（Brassica rapavar.pekinensis）是我國重要的大眾蔬菜，味道鮮美、營養(yǎng)豐富，在我國廣泛種植，其栽培面積和產(chǎn)量居世界首位[1-2]。大白菜因其含有各種維生素、礦物質(zhì)和纖維素，而具有保健作用[3]。然而，大白菜在生產(chǎn)過程中易受植物病原菌的侵染造成嚴(yán)重的產(chǎn)量和經(jīng)濟損失[4-5]，其中，大白菜枯萎病是由鐮刀菌侵染引起的維管束病害，因其病原菌種類多且寄主廣泛而危害嚴(yán)重，全國各地均有發(fā)生，嚴(yán)重時發(fā)病率在80%以上，造成植株大量死亡[6-8]，因此對大白菜枯萎病防治技術(shù)的研究尤為重要。

目前大白菜枯萎病的防治，以化學(xué)殺菌劑防治為主，采用抗耐病品種和田間輪作的農(nóng)業(yè)措施為輔。化學(xué)殺菌劑雖然可以有效控制枯萎病的發(fā)生，但長期大量應(yīng)用易造成農(nóng)藥殘留、食品安全以及環(huán)境安全等問題[9-10]。開發(fā)對環(huán)境友好和誘導(dǎo)植株產(chǎn)生抗病性的生物防治方法具有廣闊的應(yīng)用前景。其中木霉菌（Trichoderma）廣泛分布于土壤和根際生態(tài)系統(tǒng)，對環(huán)境適應(yīng)能力強[11]。前人研究發(fā)現(xiàn)，木霉菌對黃瓜根結(jié)線蟲[12]、水稻紋枯病[13]、苦瓜枯萎病[14]、番茄枯萎病[15]和草莓灰霉病[16]具有良好的防治效果，同時還具有促進(jìn)番茄和黃瓜生長的作用[17-19]。然而未見木霉菌對大白菜枯萎病的防效報道。筆者從山東省青島市膠州市大白菜田中分離獲得木霉菌株，采用離體和盆栽方法測定木霉菌對大白菜枯萎病的拮抗作用與防治效果，以期為該病害的生物防治提供更多優(yōu)質(zhì)的菌種資源，為開展綠色防控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：大白菜枯萎病菌（Fusarium oxysporum），編號分別為BCFG1 和BCFG2。木霉菌株的編號分別為2019-1、2020-2、2020-5、2020-6、2020-7、2021-1、2021-2、2021-3 和2021-4，共9 株，分離于大白菜根際。以上菌株由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)植物醫(yī)學(xué)學(xué)院農(nóng)藥學(xué)實驗室保存?zhèn)溆谩９┰囁巹?×108CFU·g-1哈茨木霉可濕性粉劑，為美國拜沃股份有限公司產(chǎn)品。

供試大白菜品種：精品膠白一號，由青島市膠州市大白菜研究所育成，為中晚熟一代雜種，抗病、豐產(chǎn)、整齊、球形好，風(fēng)味品質(zhì)優(yōu)、口感好、可密植、耐貯運。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉15～20 g、蒸餾水1000 mL，用于拮抗木霉菌的篩選。麥粒培養(yǎng)基：麥粒50 g、蒸餾水100 mL 浸泡24 h 后滅菌，用于枯萎病菌和木霉菌孢子的培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 木霉菌對大白菜枯萎病的離體抑菌活性測定 試驗于2021 年5-9 月在青島農(nóng)業(yè)大學(xué)植物醫(yī)學(xué)學(xué)院農(nóng)藥毒理學(xué)實驗室進(jìn)行。采用平板對峙法測定木霉菌對大白菜枯萎病菌的拮抗作用[20]。將直徑5 mm 的木霉菌菌餅放置于PDA 平板中距離中心點2.5 cm 的一端，在另一側(cè)距離中心點2.5 cm處放置相同大小的大白菜枯萎病菌菌餅，以無菌空白PDA 菌餅作為對照，3 次重復(fù)，放于28 ℃恒溫培養(yǎng)7 d 后，采用十字交叉法測量對照組和處理組大白菜枯萎病菌菌落半徑并計算抑菌率。

采用平板倒扣法測定木霉菌對大白菜枯萎病菌的熏蒸作用[21]。將直徑5 mm 木霉菌菌餅接于PDA 平板中央，另一平板中央接相同大小的大白菜枯萎病菌菌餅，將兩平板對扣，木霉平板在下方，封口膜密封。以接種大白菜枯萎菌而不接木霉菌的平板倒扣作空白對照。3 次重復(fù)，28 ℃恒溫培養(yǎng)5 d 后，采用十字交叉測量各處理的大白菜枯萎病菌菌落直徑，計算抑菌率。

1.2.2 拮抗木霉菌株的鑒定 形態(tài)學(xué)鑒定：將拮抗作用較好的菌株分別接種到PDA 培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)，觀察各菌株菌落形態(tài)特征。待產(chǎn)生孢子后，在顯微鏡下觀察其形態(tài)特征，參照相關(guān)文獻(xiàn)資料[22]進(jìn)行分類學(xué)鑒定，初步明確病原菌的分類地位。

分子生物學(xué)鑒定：分別提取木霉菌株的DNA，采用真菌的通用引物（ITS1 和ITS4）進(jìn)行PCR 擴增[23]。采用25 μL PCR 反應(yīng)體系：ddH2O 17.25 μL、10×EasyTaqBuffer 2.5 μL、dNTPs（2.5 mmol·L-1）2 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、DNA 1 μL、EasyTaqDNA Polymerase 0.25 μL。反 應(yīng) 程 序：94 ℃3 min；94 ℃45 s，58 ℃45 s，72 ℃40 s，34 個循環(huán)；72 ℃10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，由上海生工生物工程有限公司測序，以測得序列為索引，在NCBI 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast 比對分析。選擇同源性較高的序列用MEGA 軟件的UPGMA 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定菌株的分類地位。

1.2.3 拮抗木霉菌對大白菜枯萎病的盆栽防效

采用灌根的盆栽法測定木霉菌發(fā)酵液對大白菜枯萎病的防治效果[24]。試驗于2021 年8—11 月在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行，溫度（25±1）℃，相對濕度60%～70%，光照周期為16 h 光照/8 h 黑暗。用250 mL錐形瓶麥粒培養(yǎng)基分別培養(yǎng)病原菌BCGF1、BCGF2 和木霉菌株2019-1 和2021-2。待其產(chǎn)孢后，用滅菌水配成孢子懸浮液。采用灌根法按每杯接入10 mL 濃度105CFU·g-1土孢子液（BCGF1 和BCGF2 各5 mL）培育1 d 后，選取大小一致，健康正常的具有2 片真葉的白菜幼苗按1 株/杯移栽至接種致病菌的直徑7.0 cm 高度7.5 cm 太空杯中，用孢子濃度為108CFU·mL-1的菌株2019-1 和2021-2 發(fā)酵液按每杯10 mL 灌根，以微生物殺菌劑哈茨木霉WP200 倍液為藥劑對照，同時設(shè)不接枯萎病菌和只接枯萎病菌為陰性對照和陽性對照。太空杯均放入長45 cm、寬30 cm 的塑料托盤中，每處理10 株，3 次重復(fù)，隨機區(qū)組排列。常規(guī)管理，20 d 后調(diào)查各處理白菜幼苗的株高、根長和鮮質(zhì)量及發(fā)病情況并計算病情指數(shù)和防治效果[25-26]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

抑菌率/%=（對照組菌落直徑-處理組菌落直徑）/（對照組菌落直徑-菌餅直徑）×100。

病情指數(shù)=Σ（各級病株數(shù)×相對級數(shù)值）/（調(diào)查總株數(shù)×最高病級）×100。

防治效果/%=[（空白對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/空白對照病情指數(shù)]×100。

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用Duncan’s 新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 木霉菌對大白菜枯萎病的離體抑菌活性

供試的9 株木霉菌對2 株大白菜枯萎病菌均有一定抑制作用（表1）。9 株木霉菌對大白菜枯萎病菌BCGF1 和BCGF2 的抑制率分別在51.49%～81.42%和41.54%～87.18%，其中以菌株2021-2 和2019-1 的拮抗作用較強（圖1）。9 株木霉菌對大白菜枯萎病菌BCGF1 和BCGF2 的熏蒸抑制率分別在5.98%～22.97%和9.16%～21.91%，以菌株2020-6和2021-1 的熏蒸作用最強（圖2）。

圖1 木霉菌對大白菜枯萎病菌的抑制效果（7 d）

圖2 木霉菌對大白菜枯萎病菌的熏蒸效果（5 d）

表1 木霉菌對大白菜枯萎病菌的離體抑菌活性 %

2.2 拮抗木霉菌的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定 由圖3 可以看出，菌株2019-1菌落由白色至淺黃色至綠色，平鋪在培養(yǎng)基上，呈同心輪紋狀排列，具有清新的芳香氣味。分生孢子梗垂直對生或互生，分生孢子綠色、近球形、大小3.2～4.5 μm（n=20）；菌株2021-2 菌落黃綠色，菌絲不太豐富，平鋪在培養(yǎng)基上，孢子粉很多呈球狀。分生孢子梗分支不規(guī)則，單生或?qū)ι^少單生，呈帚狀瓶頸形，淺綠色至綠色，分生孢子橢圓形，大小

圖3 菌株2019-1 和2021-2 的菌落形態(tài)、分生孢子梗和分生孢子特征

2.5～4.0 μm（n=20）。

2.2.2 分子鑒定 以ITS1、ITS4 為引物對菌株2019-1 和2021-2 的基因組ITS 區(qū)段序列進(jìn)行PCR擴增，測序結(jié)果顯示其擴增片段分別為610 bp 和646 bp。經(jīng)Blast 比對分析，發(fā)現(xiàn)屬于木霉屬（Trichoderma）。構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示（圖4），菌株2019-1 與深綠木霉（Trichoderma atroviride）位于同一進(jìn)化分支；菌株2021-2 與哈茨木霉（T. harzianum）位于同一進(jìn)化分支。

圖4 木霉菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 拮抗木霉菌對大白菜枯萎病的盆栽防效

盆栽試驗結(jié)果表明（表2），木霉菌發(fā)酵液采用灌根處理20 d 后，菌株2019-1、2021-2 和對照藥劑哈茨木霉處理的白菜苗明顯比枯萎病菌對照處理的白菜幼苗發(fā)病輕，其病情指數(shù)分別為31.67%、33.96%和32.56%，均顯著低于只接種病原菌的對照處理，防治效果分別為67.24%、64.87%和66.32%，菌株2019-1 和菌株2021-2 的病情指數(shù)差異不顯著，且與對照藥劑哈茨木霉的病情指數(shù)差異不顯著，三者均與接菌對照差異顯著。由此表明，上述2株木霉菌對大白菜枯萎病具有較好的防治效果。另外，經(jīng)木霉發(fā)酵液處理的白菜幼苗的鮮質(zhì)量、株高和根長顯著大于接種枯萎病菌的白菜幼苗，菌株2019-1、2021-2 和哈茨木霉處理的白菜幼苗的鮮質(zhì)量、株高和根長差異不顯著，但均與接菌對照和空白清水對照差異顯著，以空白清水處理的幼苗生長最好，其次為菌株2019-1、2021-2 和哈茨木霉，接菌對照幼苗生長最差，表明菌株2019 和2021-2 及哈茨木霉對白菜生長有一定的促生作用。

表2 木霉菌對大白菜枯萎病的盆栽防治效果

3 討論與結(jié)論

木霉菌是一種重要的生防菌，大量的研究結(jié)果表明，其對多種植物病害具有良好的防治效果和促生作用[12-19]。魯海菊等[28]試驗表明，內(nèi)生木霉菌對枇杷根腐病的防效在80%以上；趙玳琳等[29]發(fā)現(xiàn)微生物菌劑與木霉菌混合使用對甘藍(lán)黑腐病的防效可達(dá)79.16%，且具有促生作用。Cong 等[30]發(fā)現(xiàn)擬康氏木霉（T.pseudokoningii）與黑根霉（Rhizopus nigricans)混合發(fā)酵液對黃瓜枯萎病的田間防效達(dá)76.5%。盧德鵬等[31]試驗表明，木霉菌可濕性粉劑對番茄枯萎病防效在70%以上，與對照藥劑防效相當(dāng)，且具有促生作用。陳凱等[32]篩選到2 株木霉菌對黃瓜枯萎病田間防效為64.19%～66.89%，而混合使用防治效果可提高到73.65%。雖然木霉菌對其他植物病害防治效果的研究較多，但目前未見其防控大白菜枯萎病的相關(guān)報道。

近年來，由于栽培方式的改變，大白菜枯萎病發(fā)生嚴(yán)重，對其產(chǎn)量造成巨大的威脅[8]。化學(xué)防治是大白菜枯萎病的主要防治手段，但已出現(xiàn)污染環(huán)境等問題，綠色防控在未來顯得尤為重要[8，27]。筆者的研究從大白菜根際分離木霉菌株，以枯萎病菌為靶標(biāo)菌，篩選到對大白菜枯萎病菌具有良好拮抗作用的深綠木霉2019-1 和哈茨木霉2021-2，其抑菌率均為70%以上，熏蒸抑制率10%左右，盆栽防效為64.87%～67.24%。因此，開發(fā)深綠木霉2019-1 和哈茨木霉2021-2 生防制劑防治大白菜枯萎病具有廣闊的應(yīng)用前景。

綜上所述，深綠木霉2019-1 和哈茨木霉2021-2對大白菜枯萎病菌的抑菌活性較高，可有效防治大白菜枯萎病，促進(jìn)植物生長，有較好的應(yīng)用潛力。木霉菌的防病促生機制是多方面的，是生防菌推廣應(yīng)用的基礎(chǔ)。下一步需要深入研究2019-1 和2021-2 菌株的抑菌物質(zhì)、作用機制和加工工藝，并進(jìn)一步探究其高效利用技術(shù)，為大白菜枯萎病的綠色防控提供重要的理論和技術(shù)支撐。