不同混合鹽堿下藜麥幼苗的抗性研究

許浩宇，趙穎，阮倩，朱曉林，王寶強，魏小紅*

（1.甘肅農業大學生命科學技術學院，甘肅 蘭州 730070；2.省部共建干旱生境作物學重點實驗室，甘肅農業大學，甘肅 蘭州 730070）

藜麥（Chenopodium quinoa）是藜亞科藜屬植物，在南美洲的安地列斯地區已經有數千年的種植歷史［1］。因其富含多種人體所需的營養物質，如礦質元素、維生素、膳食纖維、蛋白質和必需氨基酸等，享有“營養黃金”的美稱［2-4］。在預防糖尿病、呼吸系統疾病、心血管疾病和癌癥方面也有很好的效果［5］，因此被智利、美國和許多歐洲國家引進。我國從2014年起相繼在西藏、甘肅、河北、寧夏等地推廣種植［6-7］。近年來，由于降水量小而蒸發量大等多種原因［8］，土地鹽堿化問題日益加重，特別是我國西北地區的農作物飽受鹽堿脅迫的影響［9-10］，嚴重降低了農作物產量。白藜麥在不同鹽堿組分的土壤環境中適應性不同，因此研究不同混合鹽堿下白藜麥幼苗的抗性機制，對克服鹽堿脅迫對藜麥栽培的制約、擴大其種植范圍、發揮我國藜麥產業的巨大潛力至關重要，并且在我國荒漠區生態環境的恢復重建、鹽漬化土壤的改良與利用等方面也具有舉足輕重的意義。

植物在長期與鹽堿脅迫的適應過程中，進化出了一系列的適應機制，其中包括避鹽和耐鹽途徑，耐鹽途徑主要是植物通過抗氧化和滲透調節系統的增強及抗鹽堿相關基因的過量表達以緩解進入植物體內的鹽分帶來的危害［11］。關于藜麥對鹽堿脅迫的適應性研究，前人已經從種子萌發、抗氧化系統、滲透調節和光系統等諸多方面進行研究。袁飛敏等［12］的研究發現，低濃度的鹽堿脅迫會增加藜麥種子的發芽率，促進藜麥的生長發育，高濃度則會抑制藜麥的生長；邱璐［13］的研究表明，在一定鹽堿脅迫下，藜麥可通過抗氧化酶活性的提高清除體內多余的活性氧，并通過從外界吸收和自身合成包括無機離子和有機小分子物質在內的滲透調節物質維持細胞內的穩定，使植物能夠正常生長發育；Cai等［14］發現藜麥植株中有機物質（蛋白質、糖和脯氨酸）和無機物質（K+、Na+）的活躍合成可能會使藜麥從鹽堿脅迫中緩解過來，但由于這些物質不能再用于細胞壁和蛋白質的合成，因此大量的能量消耗造成了藜麥生長發育遲緩；Ruiz-Carrasco等［15］指出NHX1基因編碼的Na+（K+）/H+轉運蛋白，可將Na+區隔化在液泡中使細胞內保持較低的Na+濃度，從而減少鹽堿脅迫對植物造成的損害。但以上研究主要集中在單一鹽處理或兩種混合鹽處理，我國的鹽堿土地構成極其復雜［16-17］，大部分屬于復合型鹽堿地，其中引起土地鹽堿化的離子主要有Na+、Mg2+、Ca2+、SO42-、Cl-、CO32-等［18-19］，這些離子會降低植物根系周圍土壤中水勢，造成植物吸水困難，并通過滲透作用進入細胞造成代謝紊亂、酶活性降低甚至喪失等多種不良后果［20］。關于不同混合鹽堿脅迫下藜麥的響應機制，本課題組前期研究發現鹽堿濃度是影響藜麥種子萌發的主要因素，鹽堿組分影響次之［21］，但植物幼苗期產生的營養和調節物質同樣對植物的后續生長和耐鹽性起著至關重要的作用。因此，本研究將兩種中性鹽NaCl、Na2SO4和兩種堿性鹽Na2CO3、NaHCO3按照不同比例混合來模擬不同鹽堿地的土壤情況，從幼苗的生長特性、滲透調節物質、抗氧化系統及Na+區隔化基因等方面來探究不同混合鹽堿下藜麥幼苗的抗性機制，旨在為藜麥抗鹽堿品種的選育及在鹽堿地中進行規模化種植提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

1.1.1 試驗材料 供試品種為白藜麥，該品種生長環境為中度鹽堿地區，由寧夏農林科學院科泰種業有限公司培育并提供，千粒重0.329 g。

1.1.2 鹽堿條件的模擬 參照趙穎等［21］的方法，選 取 中 性 鹽（NaCl、Na2SO4）和 堿 性 鹽（Na2CO3、NaHCO3）共4種按照不同的比例混合來模擬不同鹽堿組成的土壤，根據其中堿性鹽所占組分遞增的順序設置5個處理組，依次為A、B、C、D、E（表1），處理所用的混合鹽堿濃度為200 mmol·L-1，蒸餾水處理作為對照組（CK）。

表1 各處理鹽分組成，摩爾比及pHTable 1 Salts composition，molar ratio and pH of solutions for mixed salt-alkali treatment

1.1.3 幼苗生長試驗 試驗于2021年3-7月在甘肅農業大學生命科學技術學院實驗室進行。選擇成熟飽滿且無病害的藜麥種子，在5%的NaClO溶液中消毒15 min，然后用蒸餾水沖洗確保沒有NaClO殘留。將種子均勻播種在營養土與蛭石比例為3∶1的花盆中（口徑12 cm），每2 d澆灌一次1/2 Hoagland營養液，待幼苗生長至六葉一心時進行定苗（每盆8株），按試驗設計采用澆灌法進行鹽堿處理，每處理重復3次，分別于處理后的第2、4、6、8天取藜麥幼苗葉片，用液氮速凍后保存在-80℃冰箱中用于生理指標的測定和RNA的提取，每個試驗重復3次。

1.2 測定指標及方法

1.2.1 生長指標的測定 株高（cm）的測定：用游標卡尺測量藜麥莖基部到頂端的距離；根長（cm）的測定：用游標卡尺測量藜麥地下部分的長度；根冠比的測定：根冠比（%）=地下部分干重/地上部分干重×100。

1.2.2 滲透調節物質的測定 采用硫代巴比妥酸法［22］測定丙二醛含量；采用考馬斯亮藍法［22］測定可溶性蛋白含量，采用蒽酮法［22］測定可溶性糖含量［22］；采用磺基水楊酸法［23］測定游離脯氨酸含量。

1.2.3 抗氧化酶活性的測定 采用NBT光還原法［24］測定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性；采用愈創木酚氧化法［24］測定過氧化物酶（peroxidase，POD）活性；采用紫外吸收法［24］測定過氧化氫酶（catalase，CAT）活性；采用抗壞血酸（ascorbic acid，ASA）氧化法［25］測定抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活性。

1.2.4 Na+區隔化相關基因表達分析 采用植物總RNA提取試劑盒提取不同處理下的藜麥葉片總RNA，按照反轉錄試劑盒反轉錄合成cDNA第一條鏈作為模板。采用熒光定量試劑盒進行熒光定量PCR擴增，內參基因選用H2A，各基因特異性引物序列（表2）參考時丕彪等［26］的研究。擴增程序為：95℃預變性30 s；95℃變性15 s，60℃退火延伸30 s，40個循環；溶解曲線使用儀器默認設置。采用2-ΔΔCt法［26］計算基因的相對表達量。

表2 Na+區隔化相關基因的qRT-PCR引物Table 2 Primers sequences for Na+compartmentalization related genes of qRT-PCR

1.3 數據分析

利用Excel軟件進行數據的處理并制圖，使用SPSS 20.0軟件進行差異顯著性分析，采用Duncan法進行多重比較（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 混合鹽堿脅迫對藜麥幼苗生長的影響

由圖1Ⅰ可知，隨著處理時間的增加，混合鹽堿對株高的抑制效果愈發明顯，對根長和根冠比則起促進效果；隨著鹽組分中堿性鹽比例的增加，藜麥株高受抑制程度加深，根長和根冠比呈現先升高后下降的趨勢。在第8天時，與CK相比，C、D、E處理下藜麥幼苗的株高顯著下降（P＜0.05），分別下降14.48%、14.67%、15.39%，A、B受抑制程度較低，分別下降5.61%和5.67%，下降幅度由大到小依次為E＞D＞C＞B＞A；由圖1Ⅱ可知，第8天時相較于CK，C處理下藜麥幼苗的根長上升幅度最大（P＜0.05），上升了35.97%，其余鹽組分下上升幅度大小為B＞D＞A＞E，分別上升35.12%、31.69%、24.41%、18.63%，與CK均有顯著差異（P＜0.05）；由圖1Ⅲ可知，對于根冠比而言，第8天時C處理下同樣漲幅最大，相較于CK上升了53.10%（P＜0.05），其余鹽組分下上升幅度大小 為D＞B＞E＞A，分 別 上 升43.16%、40.49%、33.42%、21.55%，均有顯著差異（P＜0.05）。

圖1 混合鹽堿對藜麥幼苗生長參數的影響Fig.1 Effects of mixed salt-alkali on growth parameters of quinoa seedlings

2.2 混合鹽堿對藜麥幼苗膜損傷以及滲透調節物質的影響

由圖2Ⅰ可知，隨著處理時間的增加，各處理下藜麥幼苗葉片中丙二醛（malondialdehyde，MDA）的含量均呈現先升后降的趨勢。各處理下MDA含量均在第4天時達到最大值，與CK相比，A、B、C、D、E處理下MDA分別上升67.03%、87.85%、77.90%、90.39%、66.38%，均差異顯著（P＜0.05），且葉片內MDA含量在第4天D處理 下最高；E處理下MDA含量在第6天時、第8天時與CK相比，顯著上升37.07%、45.69%（P＜0.05）。

由圖2Ⅱ可知，隨著處理時間的增加，A處理下可溶性糖含量呈現下降趨勢，其他處理下呈現遞增趨勢。在第2天時，與CK相比，A處理下可溶性糖含量顯著上升33.52%（P＜0.05）；在第8天時，A、B、C、D、E處理下分別上升12.32%、14.99%、22.02%、26.98%、12.98%，均差異顯著（P＜0.05），且葉片內可溶性糖含量在D處理下最高。

由圖2Ⅲ可知，A、B、C處理下藜麥幼苗中可溶性蛋白的含量隨著處理時間的增加，呈現先升高后下降的趨勢，在第6天達到最大值，與CK相比顯著升高（P＜0.05），分別上升47.88%、75.73%、65.23%；D、E處理下可溶性蛋白含量隨著處理時間的增加，呈現一直上升的趨勢，在第8天時可溶性蛋白的含量分別與CK相比上升了95.98%、122.37%，均差異顯著（P＜0.05），且葉片內可溶性蛋白含量在第8天E處理下最高。

由圖2Ⅳ所示，在處理第2天時，A、B、C處理下藜麥幼苗中脯氨酸含量顯著上升（P＜0.05），與CK相比，分別上升78.29%、62.59%、101.38%，且顯著高于D、E處理。隨著處理時間的增加，A、B、C處理下脯氨酸含量大致呈現先上升后降低的趨勢，于第6天達到最大值，顯著高于CK（P＜0.05），分別上升156.07%、118.91%、198.34%（P＜0.05），且葉片內脯氨酸含量在第6天C處理下最高；D、E處理下脯氨酸含量持續升高，在第8天時分別上升102.19%、97.34%（P＜0.05），與CK相比均顯著升高（P＜0.05）。

圖2 混合鹽堿對藜麥幼苗滲透調節物質的影響Fig.2 Effects of mixed salt-alkali on osmotic regulatory substances in quinoa seedlings

2.3 混合鹽堿對藜麥幼苗抗氧化酶活性的影響

由圖3Ⅰ可知，各鹽組分處理下，藜麥幼苗葉片中SOD活性隨著處理時間的增加呈現先升高后下降的趨勢（除C處理外），B處理下在第4天達到最大值，A、D、E處理下在第6天達到最大值。在第4天時，B處理下SOD活性與CK相比顯著上升33.57%（P＜0.05）。在第6天時，A、D、E處理下SOD活性與CK相比顯著上升21.92%、17.81%、13.65%（P＜0.05）。葉片內SOD活性在第8天C處理下最高，與CK相比顯著上升了27.46%（P＜0.05）。

圖3 混合鹽堿對藜麥幼苗抗氧化酶活性的影響Fig.3 Effects of mixed salt-alkali on antioxidant enzyme activity in quinoa seedlings

由圖3Ⅱ可知，隨著處理時間的增加，各處理下藜麥幼苗中POD活性均不斷下降。在第2天時，C、D處理下POD活性與CK相比分別顯著上升22.99%、37.97%（P＜0.05），且在第2天D處理下最高。在第4天時，E處理下POD活性與CK相比受到顯著抑制（P＜0.05），下降8.59%。到第8天時，各處理下POD活性與CK相比均受到顯著抑制（P＜0.05）。

由圖3Ⅲ可知，在第2天時，A、B、C、D、E處理下藜麥幼苗葉片中CAT活性與CK相比分別上升35.40%、31.68%、41.61%、40.36%、57.76%，均差異顯著（P＜0.05）。隨著處理時間的增加，CAT活性無顯著變化，且同一天內各鹽組分處理下CAT活性無顯著差異（P＞0.05）。葉片內CAT活性在第4天E處理下最高，與CK相比顯著上升78.23%（P＜0.05）。

由圖3Ⅳ可知，藜麥幼苗中APX活性隨著處理時間的增加呈現先升高后下降的趨勢（除D處理外）。與CK相比，B處理下APX一直保持較高活性，分別于第2、4、6、8天提高82.10%、61.95%、47.22%、32.37%，且葉片內APX活性在第2天B處理下最高。在第8天時，C、D、E處理下藜麥葉片中APX活性與CK相比分別顯著上升37.25%、42.00%、22.25%（P＜0.05）。

2.4 混合鹽堿對藜麥幼苗Na+區隔化相關基因表達量的影響

由圖4Ⅰ可知，隨著處理時間的增加藜麥幼苗中CqNHX1a基因的相對表達量呈現先下降后上升的趨勢。在第2天時A、B、C、D、E處理下藜麥幼苗中CqNHX1a基因相對表達量顯著上升（P＜0.05），分別為CK的4.30、4.53、4.22、2.04、1.60倍，且葉片內CqNHX1a基因相對表達量在第2天B處理下達到最大；在第4天時則起抑制效 果，E處 理 下抑制效果最 為 顯 著（P＜0.05），CqNHX1a基 因 相 對 表 達 量為CK的0.60倍；在 第8天 時，CqNHX1a基因相對表達量從大到小依次為E＞D＞B＞C＞A。

由圖4Ⅱ可知，在混合鹽堿脅迫下藜麥幼苗中CqNHX1b基因的相對表達量與CqNHX1a基因的相對表達量變化趨勢相同，在第2天時，A、B、C、D、E處理下藜麥幼苗中CqNHX1b基因相對表達量顯著上升（P＜0.05），分別為CK的3.24、4.08、4.08、1.57、1.76倍，且葉片內CqNHX1b基因相對表達量在第2天B處理下達到最大；在第4天時，A、D處理顯著抑制藜麥幼苗中CqNHX1b基因的表達（P＜0.05），分別為CK的0.81和0.68倍；在第8天時，CqNHX1b基因相對表達量從大到小依次為E＞D＞B＞C＞A，與CqNHX1a基因相同。

圖4 混合鹽堿對藜麥幼苗Na+區隔化相關基因表達量的影響Fig.4 Effects of mixed salt-alkali on expression of Na+compartmentalization related genes in quinoa seedlings

3 討論

植物在幼苗期對鹽堿脅迫尤為敏感且易受到損傷，是植物適應鹽堿環境的基礎階段［27］。植物的生長特性是植物在逆境下生存能力的重要體現。本研究表明，藜麥幼苗的株高隨著鹽堿脅迫時間和處理鹽溶液堿性的增加受抑制效果逐漸增強，賈茵等［28］對小報春（Primula forbesii）的脅迫研究也得到了相同結論。此外，藜麥幼苗的根長、根冠比隨著處理時間的增加呈上升趨勢，相同處理時長下隨著處理鹽溶液堿性鹽比例增加呈先上升后下降的趨勢，這與譚舒心［29］的研究結果一致，這可能是因為鹽堿脅迫使植物需要更大的根表面積從土壤中獲取水分和營養物質，但過高的鹽濃度會降低土壤中的水勢，造成生理干旱從而使植物體吸水困難，而過高的pH則使得土壤中的礦質營養成為不溶解狀態不利于根系的吸收，因此抑制了根系的發育和根冠比。

為了緩解鹽堿脅迫，植物可以通過合成滲透調節物質如可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸等，維持植物體內的滲透勢，防止植物吸水困難或失水過多［30］。本研究表明，隨著處理時間的增加，可溶性糖含量大致呈現上升趨勢；可溶性蛋白和脯氨酸含量隨鹽堿溶液pH增加上升時間延長。這可能是因為高pH環境對藜麥幼苗造成了更強的逆境脅迫，藜麥幼苗需要不斷地合成更多的滲透調節物質來緩解，這一點可以從各鹽堿處理下丙二醛的含量變化得到很好的印證。此外，處理初期D、E處理下脯氨酸的含量幾乎不變，這可能是高pH環境抑制了脯氨酸相關合成酶的活性，與本課題組在萌發期的研究結果相一致［31］。

其次，鹽堿脅迫下，植物體內活性氧（reactive oxygen species，ROS）大量積累，導致膜脂過氧化、蛋白質和核酸損傷，引起細胞功能紊亂［32］。植物細胞膜脂受損傷程度常用體內MDA含量來衡量，ROS首先會使膜脂過氧化產生MDA［33］。本研究結果表明，E組分下MDA含量一直維持在較低水平，這可能是因為過強的鹽堿脅迫超出了藜麥的承受范圍，其余鹽組分下MDA含量在第4天最高時呈D＞B＞C＞A的順序排列，說明隨著鹽組分中堿性鹽比例的增加，幼苗受損傷程度不斷加深，這與陳雅琦等［34］的研究結果一致。為了減少ROS帶來的損害，植物體內存在著一套活性氧清除系統如SOD、CAT、POD、APX，可以將體內過多的ROS轉變成低毒的H2O2進而轉變為無毒物質［35］。本試驗中，隨著堿性鹽比例的增加和處理時間的延長，藜麥葉片內CAT仍能保持較高活性，說明鹽堿程度較高時，CAT可能是主要的抗氧化酶；隨著脅迫時間的增加，APX活性先升高后下降，這表明藜麥幼苗可通過增強抗氧化酶活性減輕ROS帶來的損傷［36］；E鹽組分下SOD活性略有降低，POD活性一直呈現較低水平，且隨著處理時間的增加，各鹽組分下POD活性呈下降趨勢，姚玉濤等［37］對草莓（Fragaria ananassa）抗氧化系統的研究得到了類似的結果，這可能是因為過高的pH使得細胞中積累的ROS含量過高，導致抗氧化酶的活性降低。

此外，植物還可通過增強NHX1基因的表達，將細胞內的Na+區隔化在液泡中，保證植物細胞內的高滲環境，促進植物對水分的吸收［38］。本研究結果表明，處理初期各鹽組分下CqNHX1a和CqNHX1b基因表達量顯著上升，但D、E鹽組分下基因的表達量與其他鹽組分下相比明顯受到抑制，且在第4天時表達量受抑制效果最為顯著。與時丕彪等［26］的研究結果一致，雖然鹽堿脅迫可以提高CqNHX1基因的表達，但過高的pH則會產生抑制的效果，導致細胞質中Na+泵入液泡的能力下降，顯著降低藜麥的耐鹽性。此外，第8天時，兩基因表達量均呈E＞D＞B＞C＞A排列，這可能是因為隨著對藜麥鹽堿脅迫的不斷加深需要提高CqNHX1基因的表達量來提高藜麥的耐鹽性。

4 結論

堿性鹽（NaHCO3、Na2CO3）和中性鹽（NaCl、Na2SO4）都會對藜麥造成滲透脅迫與離子毒害，且高pH鹽堿的危害更顯著。藜麥可以通過增加根冠比、增強抗氧化酶活性、積累滲透調節物質和增強抗鹽堿相關基因表達等耐鹽途徑共同抵御鹽堿脅迫帶來的危害，但會以阻礙藜麥的生長發育為代價。