紅芪多糖對糖尿病胃輕癱大鼠氧化應激的影響

郭倩，李雅琪，萬生芳，魏昭暉，楊蕤，李榮科，張磊，舒暢，李亞玲，楊雅麗

1.甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000；2.中國藥科大學，江蘇 南京211298

糖尿病胃輕癱（diabetic gastroparesis，DGP）是糖尿病常見的慢性消化道并發癥之一，隨著糖尿病發病率不斷提高，DGP發病率占比達60%以上[1]。其主要表現是胃動力障礙、胃排空延遲、無機械性阻塞，并伴有餐后飽腹、惡心、嘔吐等癥狀[2]。DGP發病機制復雜多變，與自主神經病變、胃腸激素紊亂、胃組織病變、氧化應激、高血糖等密切相關[3]。目前研究大多關注高血糖、自主神經病變等，從氧化應激方面研究DGP較少。氧化應激失衡是導致DGP的重要機制，多種植物多糖能改善氧化損傷，恢復氧化平衡[4]。紅芪是甘肅道地藥材，其主要活性成分紅芪多糖（hedysarum polybotrys polysacchcaide）具有調節細胞免疫、抗氧化、抗炎、防治糖尿病等作用[5-8]。研究表明，紅芪多糖能清除氧自由基，激活核因子E2相關因子（Nrf2）信號通路，促進抗氧化酶超氧化物歧化酶（SOD）生成，減少誘導型一氧化氮合酶含量[6]。本課題組前期研究發現，紅芪多糖能降低DGP大鼠血糖，提高胃腸動力，修復胃腸黏膜，抑制胃竇組織平滑肌細胞凋亡[6，9]。本實驗觀察紅芪多糖對DGP大鼠胃排空率、小腸推進率的影響，并檢測血清和小腸組織氧化應激相關指標變化，進一步探討紅芪多糖改善DGP的作用機制，為治療DGP提供實驗依據。

1 實驗材料

1.1 動物

72 只SPF 級6 周齡雄性Wistar 大鼠，體質量（180±20）g，北京斯貝福生物科技有限公司提供，動物許可證號SCXK（京）2019-0010。飼養于甘肅中醫藥大學動物房，溫度23 ℃，相對濕度50%。本實驗經甘肅中醫藥大學實驗動物中心動物倫理委員會審批（2020-041）。

1.2 藥物

紅芪多糖，寶雞市方晟生物開發公司，純度72.4%，批號20200315。臨用前用純凈水溶解，制成濃度分別為20、10、5 mg/mL溶液。枸櫞酸莫沙必利分散片，成都康弘藥業集團股份有限公司，5 mg/片，批號190614。將藥品粉碎，用純凈水溶解，制成濃度為0.35 mg/mL溶液。

1.3 主要試劑與儀器

水合氯醛（天津市大茂化學試劑廠，批號20190504），血糖試紙（羅氏血糖健康醫護公司，批號478696），鏈脲佐菌素（STZ，德國VETEC公司，批號WXBD4971V），活性氧（ROS）試劑盒（江蘇酶標生物，批號MB-6608A），SOD、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、8-羥基脫氧鳥苷酸（8-OHdG）、丙二醛（MDA）試劑盒（上海酶聯生物，批號分別為ml059387、ml097316、ml028318、ml077384），PCR試劑盒（武漢賽維爾生物科技有限公司，批號G3321），中性樹膠（北京索萊寶科技有限公司，批號G8590），伊紅（北京索萊寶科技有限公司，批號G1100），蘇木素（北京索萊寶科技有限公司，批號G1080），4%組織細胞固定液（北京索萊寶科技有限公司，批號P1110），谷胱甘肽轉移酶（GST）、醌氧化還原酶1（NQO1）抗體（英國Abcam公司，批號分別為ab13849、ab80588），RIPA裂解液（北京索萊寶科技有限公司，批號R0010-100），Super ECL Plus超敏發光液（北京普利萊基因科技有限公司，批號P10100）。Accu-Chek Performa血糖儀（羅氏卓越金采），XYJ80-2電動離心機（常州市金壇恒豐儀器廠），Infinite M200 Pro多功能酶標儀（瑞士Tecan），Varioskan Lux型實時定量PCR 儀（美國Thermo 公司），RM2016 切片機（德國LEICA），SHA-C 水浴鍋（江蘇榮華公司），IX51顯微鏡（日本OLYMPUS），ML408生物電放大器（上海ADInstruments），PL3508生理信號采集系統（上海ADInstruments），AUW220D 半微量電子天平（日本島津公司），FRESCO 21高速冷凍離心機（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

1.4 造模、分組及給藥

將STZ溶于0.1 mmol/L檸檬酸鈉緩沖液（pH 4.2～4.5），配制成1%STZ溶液。72只大鼠適應性飼養1周后，隨機分為空白組12只和造模組60只，禁食24 h，禁水2 h，造模組按50 mg/kg一次性腹腔注射STZ溶液，空白組注射等體積0.1 mmol/L檸檬酸鈉緩沖液。72 h后尾靜脈采血，測定隨機血糖≥16.7 mmol/L為糖尿病大鼠。造模組大鼠繼續以高糖高脂飼料不規則喂養（單日上午進食，雙日下午進食）4周，測定血糖≥16.7 mmol/L，并伴有飲水量增加、腹部脹大、體質量明顯減輕等表現，隨機抽取空白組與造模組大鼠各2只檢測小腸肌電活動，造模組大鼠小腸自主收縮頻率顯著降低提示DGP大鼠造模成功。根據實際成模大鼠數量并綜合考慮模型大鼠死亡率，最終模型組8只，陽性藥組和紅芪多糖高、中、低劑量組各9只。根據體表面積法及紅芪多糖純度計算等效劑量，陽性藥組灌胃枸櫞酸莫沙必利溶液3.5 mg/kg，紅芪多糖高、中、低劑量組分別按200、100、50 mg/kg灌胃紅芪多糖溶液，空白組和模型組予純凈水灌胃，灌胃體積均為2 mL，每日1次，連續8周。給藥期間空白組予普通飼料喂養，其余各組繼續高糖高脂飼料喂養。

1.5 檢測指標

1.5.1 一般狀況

觀察大鼠精神狀態、活動狀況、毛色等，記錄大鼠每日飲食量、飲水量變化，每2周測量體質量及尾靜脈采血檢測隨機血糖。

1.5.2 胃排空率檢測

檢測前大鼠禁食24 h，禁水2 h，予50 mg/dL酚紅溶液2 mL 灌胃，20 min 后10%水合氯醛腹腔注射（0.33 mL/100 g）麻醉，剖腹，結扎賁門和幽門，取出完整胃體，沿胃大彎剪開，用生理鹽水沖洗胃內容物，定容至20 mL。加入0.5 mol/L氫氧化鈉20 mL攪拌均勻，室溫靜置1 h，取上清液5 mL，加入20%三氯乙酸溶液0.5 mL去除蛋白，3 500 r/min離心15 min，取上清液。另取酚紅溶液2 mL，依次加入生理鹽水18 mL、20%氫氧化鈉20 mL、三氯乙酸溶液4 mL攪拌均勻，作為酚紅標準品。多功能酶標儀波長560 nm 處測定OD值，計算胃排空率。胃排空率（%）=（酚紅標準品OD值-樣品OD值）×100%。

1.5.3 小腸推進率檢測

從幽門處分離小腸，平鋪于冰面，于酚紅染色末端剪一小口，滴加少量氫氧化鈉，若變紫藍色則為酚紅到達部位，并在此區域前后分別滴加氫氧化鈉以判斷酚紅實際到達位置，測量幽門至酚紅到達部位長度及小腸全長（幽門至回盲瓣），計算小腸推進率。小腸推進率（%）=幽門至酚紅到達部位長度÷小腸全長×100%。

1.5.4 ELISA檢測

心臟采血后常溫靜置2 h，4 ℃、4 000 r/min離心15 min，吸取上層血清，采用ELISA 檢測血清ROS、SOD、GSH-Px、MDA、8-OHdG含量。

1.5.5 HE染色

取小腸組織，放入固定液中固定，脫水，透明，常規石蠟包埋，切片（厚度5 μm），二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各15 min 脫蠟，100%乙醇Ⅰ、Ⅱ各5 min，95%、90%、85%、75%乙醇各2 min復水，自來水沖洗，蒸餾水浸泡5 min，蘇木素染色5 min，流水沖洗2 min，1%鹽酸乙醇分化2 s，水洗返藍，0.5%伊紅染色1 min，水洗2 min，75%、85%、90%、95%乙醇各5 s，100%乙醇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各5 s，二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各30 s。中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.5.6 qRT-PCR檢測

稱取大鼠小腸組織0.1 g置于無酶EP管中，加入1 mL Trizol，于冰上勻漿裂解，靜置10 min，4 ℃、12 000 r/min離心8 min，將上清液轉移至新的EP管中，加入0.2 mL 氯仿震蕩搖勻，冰上靜置3 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min；吸取上清液，加入0.5 mL異丙醇，冰上靜置10 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min；棄上清液，沉淀加1 mL 75%乙醇溶解，充分混勻，4 ℃、7 500 r/min離心5 min；棄上清液，沉淀即為總RNA，核酸定量分析儀測定RNA濃度。以RNA為模板反轉錄合成cDNA。RT-PCR 條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性0.05 s，60 ℃退火34 s，共40個循環。95 ℃延伸15 s，60 ℃、1 h，95 ℃、15 s。以β-actin為內參，2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。引物由碧云天生物工程（上海）有限公司合成，引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

1.5.7 Western blot檢測

取小腸組織約100 mg，加入1 mL RIPA 裂解液，冰上充分研磨，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清液，BCA法測定蛋白濃度；加入5×上樣緩沖液充分混勻，100 ℃水浴加熱10 min；蛋白上樣，SDS-PAGE分離蛋白，冰浴、200 mA 轉膜60 min，將蛋白轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST洗滌3次，滴加GST、NQO1一抗（1∶1 000），4 ℃孵育過夜；取出條帶，TBST清洗3次，滴加二抗（1∶5 000），室溫孵育2 h，ECL發光液顯影，凝膠成像分析儀攝取圖像，采用Image J 1.4.8軟件分析蛋白灰度值，以目的蛋白與內參蛋白（β-actin）灰度值比值計算蛋白相對表達量。

1.6 統計學方法

采用GraphPad Prism 5.0軟件進行統計分析。實驗數據以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用t檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 紅芪多糖對模型大鼠一般狀況的影響

空白組大鼠飲食、飲水正常，精神狀態佳，毛色光澤，反應敏捷；模型組大鼠造模初期出現多飲、多食、多尿，隨機血糖升高，繼而出現反應遲緩、毛色黯淡、精神萎靡、多飲多尿、進食量減少、腹部脹大。

與空白組比較，模型組大鼠各時點隨機血糖顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，紅芪多糖各劑量組和陽性藥組大鼠給藥6、8 周隨機血糖顯著降低（P<0.01）。見表2。

表2 各組大鼠隨機血糖比較（，mmol/L）

表2 各組大鼠隨機血糖比較（，mmol/L）

注：與空白組比較，##P<0.01；與模型組比較，**P<0.01

與空白組比較，模型組大鼠各時點體質量顯著降低（P<0.01）；與模型組比較，給藥4周后，紅芪多糖高、中劑量組和陽性藥組大鼠體質量顯著升高（P<0.01），給藥6、8周后，紅芪多糖各劑量組和陽性藥組大鼠體質量顯著升高（P<0.01）。見表3。

表3 各組大鼠體質量比較（，g）

表3 各組大鼠體質量比較（，g）

注：與空白組比較，##P<0.01；與模型組比較，**P<0.01

2.2 紅芪多糖對模型大鼠胃排空率及小腸推進率的影響

與空白組比較，模型組大鼠胃排空率和小腸推進率顯著降低（P<0.01）；與模型組比較，紅芪多糖高、中劑量組和陽性藥組大鼠胃排空率和小腸推進率顯著升高（P<0.01）；與陽性藥組比較，紅芪多糖中、低劑量組大鼠胃排空率和小腸推進率顯著降低（P<0.01）。見表4。

表4 各組大鼠胃排空率及小腸推進率比較（，%）

表4 各組大鼠胃排空率及小腸推進率比較（，%）

注：與空白組比較，##P<0.01；與模型組比較，**P<0.01；與陽性藥組比較，△△P<0.01

2.3 紅芪多糖對模型大鼠血清活性氧、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、丙二醛和8-羥基脫氧鳥苷酸含量影響

與空白組比較，模型組大鼠血清ROS、MDA、8-OHdG含量顯著增加（P<0.05，P<0.01），SOD含量顯著減少（P<0.01）；與模型組比較，紅芪多糖高劑量組和陽性藥組大鼠血清ROS、MDA、8-OHdG含量顯著減少（P<0.05，P<0.01），SOD 含量顯著增加（P<0.05，P<0.01）。各組大鼠血清GSH-Px含量差異無統計學意義（P>0.05）。見表5。

表5 各組大鼠血清ROS、SOD、GSH-Px、MDA、8-OHdG含量比較（）

表5 各組大鼠血清ROS、SOD、GSH-Px、MDA、8-OHdG含量比較（）

注：與空白組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.4 紅芪多糖對模型大鼠小腸組織病理變化的影響

空白組大鼠小腸組織結構完整，腸黏膜正常，腺體結構清晰，無炎性細胞浸潤；模型組大鼠小腸組織結構模糊，腺體結構被破壞，黏膜消失，有大量炎性細胞浸潤；各給藥組大鼠小腸組織損傷情況有所好轉，炎性細胞浸潤減少，以紅芪多糖高劑量組作用更明顯。結果見圖1。

圖1 各組大鼠小腸組織形態（HE染色，標尺=100 μm）

2.5 紅芪多糖對模型大鼠小腸組織Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白-1、核因子E2 相關因子、血紅素加氧酶-1和硫氧還蛋白mRNA表達的影響

與空白組比較，模型組大鼠小腸組織Keap1 mRNA表達顯著升高，Nrf2、HO-1、Trx mRNA表達顯著降低，差異有統計學意義（P<0.01）；與模型組比較，紅芪多糖高劑量組和陽性藥組大鼠小腸組織Keap1 mRNA表達顯著降低，Nrf2、HO-1、Trx mRNA表達顯著升高，差異有統計學意義（P<0.05，P<0.01）。見表6。

表6 各組大鼠小腸組織Keap1、Nrf2、HO-1、Trx mRNA表達比較（）

表6 各組大鼠小腸組織Keap1、Nrf2、HO-1、Trx mRNA表達比較（）

注：與空白組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.6 紅芪多糖模型大鼠小腸組織GST 和NQO1 蛋白表達的影響

與空白組比較，模型組大鼠小腸組織GST 和NQO1蛋白表達顯著降低（P<0.01）；與模型組比較，紅芪多糖高劑量組和陽性藥組大鼠小腸組織GST 和NQO1蛋白表達顯著升高（P<0.01）。見表7、圖2。

圖2 各組大鼠小腸組織GST和NQO1蛋白免疫印跡

表7 各組大鼠小腸組織GST、NQO1蛋白表達比較（）

表7 各組大鼠小腸組織GST、NQO1蛋白表達比較（）

注：與空白組比較，##P<0.01；與模型組比較，**P<0.01

3 討論

Keap1/Nrf2信號通路是抗氧化應激的經典通路，Keap1是氧化還原反應的傳感器，正常情況下，Keap1主要與Nrf2結合，以非活性狀態存在于胞漿中，當受到ROS等刺激后，通過使構象發生改變從而與Nrf2解偶聯，使Nrf2轉入細胞核內與Maf蛋白結合成異質二聚體后與抗氧化反應元件結合，激活Ⅱ相代謝酶、抗氧化酶或藥物轉運體的轉錄活性，發揮抗氧化損傷作用，恢復細胞內穩態[10]。Keap1/Nrf2信號通路被激活后，進一步啟動下游關鍵靶標如HO-1、Trx、NQO1、GST、SOD、GSH-Px、8-OHdG等，增強機體氧化應激反應，維持氧化平衡。

Keap1是氧化應激的關鍵蛋白，能提高機體對心肌微血管內皮細胞的保護作用，協調氧化應激，緩解機體氧化損傷[11]。GST是體內二相代謝酶，能促進氧化應激產物與還原型谷胱甘肽結合，維持氧化還原動態平衡，是抗氧化系統的重要組成部分，參與脂肪蛋白的生物合成，保護細胞免受化學和代謝損傷及氧化應激反應，調節脂質、能量代謝[12-13]。研究表明，GST含量變化是引起氧化應激、胰島素抵抗等內環境紊亂的關鍵因素，更是導致2型糖尿病及其并發癥的關鍵因素[14]。NQO1是細胞質中調節氧化還原反應的蛋白酶，能解除自由基和化合物毒性，是Nrf2下游重要的抗氧化因子，通過清除ROS催化體內還原反應，保護細胞免受氧化應激損傷[15]。研究發現，增強Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達可改善氧化應激，從而達到改善糖尿病并發癥的目的[16]。

本實驗中模型組大鼠小腸組織Keap1 mRNA表達顯著升高，Nrf2、HO-1、Trx mRNA 表達顯著降低，血清ROS、MDA、8-OHdG含量顯著增加，SOD含量顯著減少，胃排空率和小腸推進率顯著降低，提示模型大鼠出現氧化應激損傷。經藥物干預后，陽性藥組和紅芪多糖高、中劑量組大鼠小腸組織Keap1 mRNA表達顯著降低，Nrf2、HO-1、Trx mRNA表達顯著升高，血清ROS、MDA、8-OHdG含量顯著減少，SOD含量顯著增加，胃排空率和小腸推進率顯著升高，提示機體抗氧化應激能力明顯改善。

綜上所述，紅芪多糖干預能改善DGP大鼠一般狀況，提高胃排空率和小腸推進率，調節血清ROS、MDA、8-OHdG、SOD含量，改善小腸組織病理損傷，其機制與下調小腸組織Keap1 mRNA表達，上調Nrf2、HO-1、Trx mRNA及GST、NQO1蛋白表達有關。本研究從抗氧化應激角度揭示了紅芪多糖改善DGP的作用機制，可為相關臨床研究提供實驗依據。