轉基因匍匐翦股穎ASR368品系特異性實時熒光PCR檢測方法的建立

劉二龍盧麗付海濱張敏金鑫鑫王興寧

(1.黃埔海關技術中心，廣東 廣州 510730；2.廣州海關技術中心，廣東 廣州 510623；3.沈陽海關技術中心，遼寧 沈陽 110016；4.沈陽農業大學，遼寧 沈陽 110866；5.貴陽海關綜合技術中心，貴州 貴陽 550081)

引言

匍匐翦股穎(Agrostis stolonifera L.)又叫莖翦股穎、本特草，為冷地型草坪草，是禾本科翦股穎屬多年生草本植物，原產于歐亞大陸，20世紀80年代曾引種部分美國俄勒崗州品種進入我國[1,2]。近年來由于各種運動場地、城市綠化的建設，使草坪草的需求量大增。為獲得耐磨、生長快、易于整修和移植的草，相應出現了多種應用轉基因技術的草坪草品種[3]。

ASR368匍匐翦股穎是孟山都公司和斯格茲公司共同研發的一種耐受草銨膦除草劑的轉基因匍匐翦股穎品系。ASR368采用農桿菌介導PV-ASGT08質粒轉入匍匐翦股穎后培育而成，其T-DNA中含有2個拷貝的cp4-epsps(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase from Agrobacterium sp.strain CP4，來自農桿菌CP4的5莽草酸-3磷酸合成酶基因)，使其具有草甘膦除草劑耐受性，ASR368于2003年在美國批準上市[4]，目前尚未獲得我國農業部批準。

隨著各種轉基因草品種的應用，其在生態環境上的安全性成為公眾關注的問題之一，口岸相關監管部門也亟需相應的檢測方法識別相應的未批準轉基因品系。目前國內未見有ASR368品系特異性實時熒光PCR鑒別方法的報道，為完善我國轉基因產品品系識別檢測技術體系，本研究基于轉基因匍匐翦股穎ASR368品系轉入的基因盒鄰接區序列，建立ASR368品系特異性實時熒光PCR檢測方法，適用于其種子及植株的鑒別檢測，可為相關部門監管轉基因匍匐翦股穎ASR368品系提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料

非轉基因剪股穎、轉基因苜蓿J101×J163、高梁、燕麥、高羊芽、天堂草、結縷草、早熟禾、轉基因大豆DAS44406、轉基因玉米MIR162、轉基因油菜MON88302、轉基因甜菜H7-1、小麥、非轉基因水稻和轉基因馬鈴薯EH92-527-1，為本實驗室購置或保存；匍匐剪股穎內源基因1-氨基環丙烷-1-羧酸氧化酶基因(1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase(ACO)gene，ACO基因)(GenBank:KU921687.1)和轉基因ASR368品系特異性片段質粒，為本實驗室構建。

1.1.2 主要試劑

DNA提取試劑盒，北京天根公司；Primex Ex Taq(2×)for qPCR，大連寶生物；引物和探針，閃晶生物公司(終濃度稀釋為10μm的引物和探針工作液)。

1.1.3 主要儀器與設備

控制型研磨機，德國IKA；微量分光光度計nanodrop2000c，美國Thermo公司；實時熒光定量PCR儀ABI7500FAST，美國應用生物系統公司；微滴式數字PCR，系統QX 200，美國伯樂公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品基因組DNA的提取與純化

稱取研磨好的樣品80mg，使用基因組DNA提取試劑盒進行核酸提取，測定提取基因組DNA的濃度，DNA溶液放置于5℃備用。

1.2.2 實時熒光PCR檢測方法的建立

1.2.2.1 引物和探針設計

根據相關基因數據庫所述轉基因ASR368品系轉入的基因盒3’端與匍匐剪股穎基因組鄰接區序列，采用Primer Express設計引物和探針。通過與BLAST數據庫相比對，確定引物和探針的理論特異性；引物和探針的信息，如表1所示。

1.2.2.2 實時熒光PCR反應體系建立

采用不同體積的引物探針進行優化。最后采取的擴增反應體系：25μL，包括Premix Ex TaqTM12.5μL、ROX Reference Dye II 0.2μL、10μmol·L-1檢測引物ASR368-F和ASR368-R各0.5μL、10μmol·L-1ASR368-P 1μL、模板2μL和ddH2O 8.3μL。

反應程序：95℃ 30s后，于95℃ 5s、60℃ 34s進行40個循環，于60℃收集熒光信號。

1.2.3 特異性測試

提取非轉基因剪股穎、轉基因苜蓿J101×J163、高梁、燕麥、高羊芽、天堂草、結縷草、早熟禾、轉基因大豆DAS44406、轉基因玉米MIR162、轉基因油菜MON88302、轉基因甜菜H7-1、小麥、非轉基因水稻和轉基因馬鈴薯EH92-527-1的基因組DNA為模板，陽性對照為ASR368-ACO質粒，陰性對照為非轉基因水稻DNA，對該檢測方法的特異性進行鑒定。

1.2.4 靈敏度測試和建立標準曲線

將提取的ASR368-ACO質粒DNA稀釋后用微滴數字PCR進行定量，然后用TE緩沖液分別稀釋至4000000拷貝·μL-1、200000拷貝·μL-1、10000拷貝·μL-1、500拷貝·μL-1、100拷貝·μL-1、20拷貝·μL-1和10拷貝·μL-1，進行線性范圍測試、可重復性測試和靈敏度檢測。3個平行/濃度。

1.2.5 可重復性測試

對1.2.4中倍比稀釋的DNA溶液，測定本實驗建立方法的可重復性，并統計分析其標準偏差(standard deviation,SD)和相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)。

2 結果與分析

2.1 實時熒光PCR檢測方法的建立

引物和探針設計：通過分析轉基因匍匐剪股穎ASR368品系鄰接區序列，見圖1，然后根據引物與探針的擴增效果，最終篩選ASR368-F、ASR368-R和ASR368-P建立本檢測方法，序列見表1。

注：陰影部分依次為ASR368-F、ASR368-P、ASR368-R。

表1 實時熒光PCR的引物、探針

2.2 特異性測試

采用1.1中農作物基因組DNA進行ASR368品系特異性方法的測試，如圖2所示。由圖2可知，采用ASR368特異性引物ASR368-F/R和探針ASR368-P進行測試時，只有陽性樣品ASR368-ACO呈現典型熒光擴增曲線的特征，表明本文的檢測方法具備良好特異性。

注：1為ASR368-ACO陽性樣品；2～17分別為非轉基因剪股穎、轉基因苜蓿J101×J163、高梁、燕麥、高羊芽、天堂草、結縷草、早熟禾、轉基因大豆DAS44406、轉基因玉米MIR162、轉基因油菜MON88302、轉基因甜菜H7-1、小麥、非轉基因水稻和轉基因馬鈴薯EH92-527-1和空白對照。

2.3 靈敏度測試

將提取的ASR368-ACO質粒DNA溶液分別稀釋至4000000拷貝·μL-1、200000拷貝·μL-1、10000拷貝·μL-1、500拷貝·μL-1、100拷貝·μL-1、20拷貝·μL-1和10拷貝·μL-1進行檢測，結果如圖3所示。7個濃度梯度均能有典型擴增曲線，其最低檢測濃度為10拷貝·μL-1。擴增圖從左至右分別為4000000～10拷貝·μL-1擴增曲線。

圖3 轉基因棉花ASR368品系實時熒光PCR方法靈敏度測試

2.4 制備標準曲線

利用2.3中7個濃度梯度DNA作為模板，進行ASR368品系實時熒光PCR檢測，建立ASR368品系特異性序列標準曲線，以實現對ASR368品系的相對定量分析。測試結果的Ct值如表2所示，根據表2中Ct值數據與在20～800000拷貝(25μL體系中上樣量為2μL)范圍內7個濃度的對數值與所得Ct值建立標準曲線，如圖4所示，線性回歸方程為：y=-3.6096x+40.385，R2=0.987，表明本實驗的ASR368品系特異性實時熒光PCR檢測方法在模板量該拷貝范圍內線性相關性良好，擴增效率較高；RSD介于0.78%～2.90%，表明該方法重復性良好。在線性范圍內最低模板量20拷貝時，其SD和RSD均小于25%，說明本方法定量檢測下限達20拷貝。

表2 實時熒光PCR方法的靈敏度及可重復性測試

圖4 ASR368品系特異性序列擴增曲線及標準曲線

3 討論

目前國內外有多個研究者通過轉基因技術改良匍匐翦股穎性狀[3]。王渭霞等[5]將外源基因導入匍匐翦股穎品種中獲得具耐旱性狀的新品系。胡繁榮[6]將經過改良的抗蟲基因crylAb導入匍匐翦股穎種子胚愈傷組織，得到抗蟲的轉基因植株。Fu等[7]將大麥haval基因導入匍匐翦股穎，研發了耐干旱環境的植株。由于匍匐翦股穎是多年生植物草本植物，可通過形成濃密根系，或通過花粉和種子的有性繁殖進行傳播。其種子生存力強，能夠借助風力等從進行傳播。轉基因匍匐翦股穎轉入相應的性狀基因如耐除草劑、抗旱等，可能導致其難以在種植地區被根除；此外，轉基因匍匐翦股穎草可能存在通過雜交把相應基因傳遞給其他草類的生態風險。

為有效應對轉基因產品生態等相關風險，建立準確的檢測方法對相關品系進行有效鑒別是非常必要的。目前轉基因鑒別方法基本上以聚合酶鏈反應(PCR)的方法為主[8]，如轉基因大米(Bt)[9]、轉基因玉米[10]、轉基因大豆[11,12]、轉基因甜菜[13]、轉基因棉花等[14]。為滿足進出境農產品監管的需求，針對轉基因匍匐剪股穎ASR368品系轉入的基因盒3’端鄰接區建立ASR368品系特異性實時熒光PCR檢測方法，具有良好的特異性、高靈敏度和穩定性的優點，可應用于口岸監管中轉基因匍匐剪股穎ASR368種子及植株的鑒別。