中國草原紅牛不同部位肌纖維特性及類型

關詩宇，谷興亮，沈宏旭，馬玉敏，程 雷，曲 磊，秦立紅,*

（1.吉林省農業科學院（中國農業科技東北創新中心），吉林 長春 130033；2.吉林農業大學動物科學技術學院，吉林 長春 130118；3.洮南市畜牧總站，吉林 白城 137100）

肌纖維組織學的特性決定肉用品質的好壞，肌肉由肌纖維組成，也是骨骼肌的基本單位。隨著生活水平與質量的不斷提高，人們的肉品質選擇標準也不斷升高，因此掌握優良肉牛品種的不同肉質性狀是肉牛養殖應當解決的問題。研究表明，肌纖維半徑與橫截面積可以影響肌肉生長和肉質的優劣[1]。肌外膜、肌內膜和肌束膜共同構成肌內結締組織。在肌肉的外圍被肌外膜所覆蓋；每個相鄰的肌肉纖維間由肌內膜相連，形成肌束[2]；肌束膜緊緊將相鄰的不同肌束連接到一起。肌外膜在屠宰分割的過程中已經剔除[3]，對肌纖維組織學特性的研究沒有影響。肌內膜與肌束膜為緊緊包裹在肌纖維與肌束外的一層結締組織，對肌肉的嫩度有一定影響[4]。蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色法依據蘇木素染色液可以將細胞核染成淡藍色，酸性的伊紅溶液能夠將胞漿呈現為紅色，從組織水平對肌肉組織纖維特性及形態學差異進行研究，最直觀反映肌肉組織結構與功能變化規律，進而達到觀察肌肉組織的目的[5]。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸四唑氧化還原酶（nicotinamide adenine dinucleotide tetrazolium oxidoreductase，NADH-TR）組織化學染色法是區分肌肉中不同肌纖維類型的主要方法之一[6]。肌肉由不同類型的肌纖維組成，依據肌纖維生理生化、形態學特征及組織化學的反應，通過NADH-TR染色將肌肉纖維分為Ⅰ型慢收縮氧化型、ⅡA型和ⅡB型快收縮氧化型肌纖維。中國草原紅牛是經本地牛與英國短角牛雜交培育而成的乳肉兼用的新品種[7]，主要分布于吉林省西部和內蒙古等地區，具有耐粗飼、抗寒、抗逆性強、肉質好等特性。

關于肌纖維組織學特性，在雞、豬、鵝、羊等家畜中研究較為廣泛[8-12]。萬磊等[13]研究發現，寧都黃雞不同部位肌內膜與肌束膜厚度存在差異。侯小偉[14]比較不同地區的烏珠穆沁羊，發現不同部位間的肌束膜與肌內膜的結締組織存在差異。關于牛的肌纖維組織學特性也有報道研究。王金泉等[15]對新疆褐牛與土黃牛間不同部位肌纖維面積進行比較分析，結果顯示，不同品種牛間相同部位肌纖維橫截面積存在差異。桂干北等[16]對去勢公牛的不同部位肉品質進行比較，結果顯示，去勢公牛不同部位的肌肉理化特性存在顯著差異。Morgan等[17]對牛14 個不同部位的肌束膜與嫩度進行比較，結果顯示，肌束膜厚度與肉品質嫩度呈現負相關。Brooks等[18]分割牛不同部位，比較肌束膜與嫩度發現，肌束膜厚度與牛肉嫩度之間有一定的相關性，且分割宰后成熟過程中肌束膜的變化也各有不同。

本研究通過對中國草原紅牛的肌纖維組織進行HE和NADH-TR染色，進而對不同部位間肌肉組織學特性和肌纖維類型組成的占比進行比較分析，旨在探究草原紅牛肌肉發育進程中的組織學差異，為培育肉質品質優良的肉牛品種提供依據，同時也可以為滿足消費者對不同品質牛肉的需求提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選取日齡、體質量及飼養環境均一致的中國草原紅牛6 頭，在相同時間內進行統一屠宰，嚴格參照GB/T 19477ü2004《牛屠宰操作規程》屠宰操作規范進行屠宰。

二甲苯 國藥集團化學試劑有限公司；無水乙醇成都博瑞特化學技術有限公司；曙紅Y（醇溶） 上海生工有限公司；蘇木素、抗熒光衰減封片劑 北京索萊寶科技有限公司；NADH、氯化硝基四氮唑藍 美國Sigma公司；OTC冷凍包埋劑 日本Sakura公司。

1.2 儀器與設備

DW-86L80 -80 ℃超低溫冰箱 浙江捷盛公司；BCD-170WLDPC冰箱（-20 ℃） 海爾公司；Histo Core MULTICUT石蠟切片機、Histo Core Arcadia H組織包埋機、CM1950冷凍切片機 德國Leica公司；DHG-9123A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司；GG-43普通培養箱 賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 肌肉樣本采集

統一屠宰后，迅速采集西冷、大條、米龍、上腦、小條及牛腩不同部位肌肉組織樣本各500 g，采取液氮保存運送方法，快速運送至實驗室，-80 ℃冰箱中進行長期保存。

1.3.2 切片制備與HE染色

從采集的液氮保存肌肉樣本上沿肌纖維紋路分割成約為1 cmh1 cmh1 cm 的冷凍肌肉組織樣品。將處理好的樣品在多聚甲醛溶液中固定24 h；依據常規方法[19]操作進行冰凍切片包埋、切片脫蠟至水；隨后進行HE染色，染色后對切片進行脫水、透明、封片處理，等待玻片室溫晾干后，在玻片掃描影像系統中進行掃描觀察。

1.3.3 冰凍切片與NADH-TR染色

將采集到的冷凍肌肉組織樣本切割修整為約1 cmh1 cmh1 cm的組織樣本。將不同部位組織樣本放入液氮中速冷處理，用甲醛溶液固定，同時進行NADH-TR染色[20]；封片，室溫晾干后放置于全景掃描影像系統中全片掃描。

1.3.4 切片的觀察和數據測量

將HE與NADH-TR染色晾干的玻片放置于全景掃描影像系統中進行全片掃描。同時在HE染色不同部位肌肉樣品切片中各隨機挑選30 個肌纖維橫截面積，用Image J軟件進行肌纖維橫截面積的測量；通過Image Viewer G軟件在100×視野下隨機挑選不同部位各30 個相鄰肌束間測量肌束膜厚度，隨機挑選測量30 個肌束內相鄰的肌纖維間的距離。NADH-TR染色組織切片在相同視野（100×）下，通過Image pro plus軟件進行不同肌纖維類型的計數。

1.4 數據處理

通過Excel進行不同肌纖維類型的占比統計；利用SPSS 20.0軟件對所得實驗數據平均值進行統計學分析，結果顯示為平均值±標準差，采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著，P＞0.05表示差異不顯著。

2 結果與分析

2.1 草原紅牛不同部位肌纖維HE染色切片

圖1所示，經HE染色后的肌肉切片呈現淡藍色、紅色或無色，淡藍色為肌肉纖維細胞核，同時可以清晰看見肌纖維間交錯分布的肌內膜和存在于肌束間寬闊縱橫的肌束膜。肌內膜為包裹在肌纖維外的一層結締組織，肌內膜厚度為2 個相鄰肌纖維間結締組織的厚度。一個肌束由幾十條肌纖維聚集成束形成肌束，肌束膜則是包裹在肌束外的一層結締組織。

圖1 不同部位肌纖維HE染色切片（×100）Fig. 1 HE staining images of muscle fibers from different parts (× 100)

2.2 草原紅牛不同部位肌肉NADH-TR染色切片

由圖2可知，肌肉切片經過NADH-TR染色后呈現出顏色深淺不一，Ⅰ型肌纖維染色為深藍色，ⅡB型肌纖維染色為淡藍發白灰色，介于2 種顏色之間的為ⅡA型肌纖維。由于不同部位肌肉肌纖維特性差異，染色后的肌肉切片中不同類型肌纖維交錯分布，不同部位間肌纖維占比也各有不同。

圖2 不同部位肌纖維NADH-TR染色切片（×100）Fig. 2 NADH-TR staining images of muscle fibers from different parts (× 100)

2.3 草原紅牛不同部位肌纖維組織學特性

由表1可知，上腦部位平均肌纖維直徑與橫截面積分別為75.41 μm和4 570.35 μm2，但與其他部位差異不顯著；米龍部位平均肌纖維直徑與橫截面積均小于其他部位。草原紅牛不同部位肌肉樣本肌纖維直徑與橫截面積均差異不顯著。牛腩部位肌束膜厚度平均為109.03 μm，極顯著高于其他部位（P＜0.01）；西冷部位肌束膜厚度平均為25.99 μm，極顯著低于其他部位（P＜0.01）；大條部位平均肌束膜厚度為64.64 μm，與米龍、上腦、小條相比差異極顯著（P＜0.01）。米龍、上腦、小條部位間的肌束膜厚度差異不顯著。西冷部位肌內膜厚度為5.49 μm，極顯著低于米龍、上腦、小條和牛腩部位肌內膜厚度（P＜0.01）；大條部位肌內膜厚度與西冷部位相比差異不顯著，大條部位與米龍、上腦、牛腩部位相比差異顯著（P＜0.05）；米龍、上腦、牛腩相比差異不顯著，米龍與小條部位肌內膜厚度相比差異極顯著（P＜0.01）；上腦部位肌內膜厚度平均為13.47 μm，與小條部位相比差異極顯著（P＜0.01）。

2.4 草原紅牛不同部位肌纖維類型組成占比

由表2可知，不同部位的肌纖維類型組成占比有所不同。對于Ⅰ型肌纖維，西冷部位占比為48.29%，極顯著高于大條、米龍、上腦、牛腩部位（P＜0.01）；牛腩部位占比為22.39%，極顯著低于其他所測5 個部位（P＜0.01）；大條與米龍、上腦相比Ⅰ型肌纖維占比差異顯著（P＜0.05）；小條部位Ⅰ型肌纖維占比為43.09%，顯著高于米龍、上腦（P＜0.05）；米龍部位與上腦部位間Ⅰ型肌纖維占比無明顯差異。對于ⅡA型肌纖維，草原紅牛的不同部位間無明顯差異。對于ⅡB型肌纖維，牛腩部位占比為49.92%，極顯著高于其他部位（P＜0.01）；米龍部位ⅡB型肌纖維占比為35.93%，與大條、上腦部位相比差異極顯著（P＜0.01），與小條部位無明顯差異；西冷部位ⅡB型肌纖維占比為30.21%，極顯著低于其他部位（P＜0.01）；大條部位與上腦部位間差異顯著（P＜0.05）。

表2 不同部位肌纖維組織類型組成占比Table 2 Proportion of muscle fiber types in different parts %

3 討 論

3.1 肌纖維直經與橫截面積

肌纖維直徑與橫截面積為肌肉組織學特性的一部分。肌纖維直徑的大小可以影響肉質性狀[21]，在本研究中二者均無明顯差異，且不同部位間差異不顯著，但與陳玲等[22]的研究結果有所不同，這可能是由于牛品種不同的原因。Solomon等[23]的研究顯示，通過對豬、牛、羊等動物的日糧進行限制飼喂可以對肌纖維直徑的減小產生影響。本研究測得的草原紅牛肌纖維平均直徑為69.8 μm，這與陳俐靜等[24]所測得的安格斯牛的肌纖維直徑32.86 μm、新疆褐牛肌纖維直徑41.52 μm相比要大。說明草原紅牛的肌纖維嫩度較低，在育種改良上可以著重改進草原紅牛的嫩度。肌纖維直徑與橫截面積的不同可能與性別因素有關，歐秀瓊等[25]的研究證明，在不同性別的長榮豬之間，母豬的肌纖維面積在前期的生長發育過程中要大于同一時期的公豬，但在生長后期，公豬的肌纖維橫截面積、直徑則要遠超同一時期的母豬。不同品種、性別及營養水平均會造成肌纖維直徑與橫截面積的差異，本研究雖無明顯差異，但也為草原紅牛的肉質改進提供了依據。

3.2 肌纖維結締組織

肌纖維結締組織包括肌外膜、肌內膜和肌束膜，肌外膜通常在屠宰時剔除，因此不考慮。肌內膜包裹肌纖維，肌束膜包裹由幾十個肌纖維聚集而成的肌束，肌內膜為細微波狀膠原纖維構成的網狀結構，肌束膜則為粗高波狀膠原網狀結構[13]。肌內膜在肌肉樣本中為網狀，分布于肌肉纖維間，影響肌肉嫩度[26]。而肌纖維橫截面積的變化也與結締組織的生長有關。本研究中，牛腩肌束膜厚度極顯著高于其他部位，而西冷部位極顯著低于其他部位，可能與不同部位嫩度不同有關[27]。嫩度與肌肉結締組織的厚度呈現負相關，且在宰后成熟過程中隨著時間的延長結締組織會逐漸降解，導致呈現網狀結構的肌束膜與肌內膜逐漸被破壞，改變肌肉品質的嫩度[28-29]。在本研究中，牛腩肌束膜厚度高于其他部位，說明牛腩部位的嫩度比較低，肌纖維橫截面積與嫩度呈現負相關，則牛腩部位肌纖維橫截面積較大。西冷部位肌內膜厚度小于其他部位，說明草原紅牛的西冷部位嫩度較高。

3.3 肌纖維類型組成占比

通過NADH-TR染色，將肌肉纖維分為Ⅰ型、ⅡA型和ⅡB型，由于草原紅牛在運動過程中不同部位的肌肉發揮不同的作用，來滿足動物機體不同的生理功能，這也直接影響不同肌肉中肌纖維的組成占比。在本研究中，草原紅牛不同部位間的Ⅰ型肌纖維占比由大到小依次為：西冷、小條、米龍、上腦、大條、牛腩；而ⅡB型肌纖維占比由大到小依次為：牛腩、上腦、大條、小條、米龍、西冷；Hwang等[30]的研究表明，韓牛肌肉的ⅡB型肌纖維比例與剪切力呈正相關，Ⅰ型肌纖維占比與剪切力呈負相關；在本研究中，西冷部位Ⅰ型肌纖維占比最大，牛腩部位最小，與剪切力呈負相關，則西冷部位剪切力與其他所測部位相比較小；肌肉的嫩度可以通過剪切力來判定，剪切力與嫩度呈負相關，因此西冷部位嫩度較高。但在Joo等[31]的研究中發現，肌纖維類型的組成比例與肉質的嫩度關系較為復雜，在形成過程中，肌纖維類型受運動方式和強度大小等多種因素的影響。

4 結 論

本研究對中國草原紅牛的不同部位肌肉纖維分別進行HE染色與NADH-TR染色，對染色后肌肉切片的結締組織厚度、肌纖維橫截面積及直徑，以及肌纖維類型組成占比進行統計分析。結果表明：中國草原紅牛不同部位肌纖維直徑與橫截面積間差異不顯著，但不同部位間結締組織厚度卻有明顯差異，牛腩部位肌束膜厚度顯著高于其他部位，說明牛腩部位肌肉纖維嫩度也較低，西冷部位肌纖維結締組織厚度低于其他部位，說明西冷肌纖維嫩度較高。大條、米龍和小條部位肌束膜與肌內膜無明顯差異。西冷部位Ⅰ型肌纖維占比最大，牛腩部位占比最小，ⅡB型肌纖維占比則是牛腩部位最大，西冷部位占比最小，ⅡA型肌纖維各部位間無明顯差異。通過對中國草原紅牛不同部位肌纖維組織學特性的分析，為草原紅牛的培育和肌肉改良提供參考依據。