植入前遺傳學檢測后凍融胚胎移植周期妊娠結局的影響因素

胡瑞，魏才娟，賈冬玲，毛斌，馬曉玲，楊媛

植入前遺傳學檢測（preimplantation genetic testing，PGT）是通過侵入性胚胎活檢，挑選正常胚胎植入子宮的過程，該技術在一定程度上預防了反復妊娠丟失、出生缺陷及遺傳性疾病[1]。根據檢測方法和目的不同，PGT可分為單基因疾病檢測（PGT for monogenic，PGT-M）、染色體重排檢測（PGT for structural rearrangements，PGT-SR）和非整倍體篩查檢測（PGT for aneuploidies，PGT-A）[2]。經PGT后的可移植胚胎（無遺傳突變、染色體結構正常和整倍體）盡可能地減少了因胚胎因素導致的不孕及不良妊娠[3]，所以，臨床上針對PGT后患者選擇高效、經濟及便捷的子宮內膜準備方案是臨床治療的關鍵。目前，凍融胚胎移植（frozen-thawed embryo transfer，FET）時常用的子宮內膜準備方案包括自然周期（natural cycle，NC）方案、激素替代療法（hormone replacement therapy，HRT）方案、促性腺激素釋放激素激動劑（gonadotropin releasing hormone agonist，GnRHa）聯合HRT方案。對于較為珍貴的PGT胚胎而言，目前尚無推薦的子宮內膜準備方案。本研究回顧性分析在蘭州大學第一醫院（我院）生殖醫學中心行PGT患者的相關資料及妊娠結局，旨在為PGT患者FET時選取適當的治療方案提供依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象回顧性分析2017年1月—2022年1月在我院生殖醫學中心行PGT助孕的患者195例、共219個FET移植周期的臨床資料。按照子宮內膜準備方案分為NC組（56個周期）、GnRHa+HRT組（102個周期）和HRT組（61個周期）。本研究經我院倫理委員會批準，且所有患者均簽署了知情同意書。

1.2 納入標準及排除標準

1.2.1 納入標準 PGT-A：①女方年齡＞38歲；②不明原因的反復自然流產（2次及以上）；③不明原因反復種植失敗（移植3次及以上或移植高評分卵裂期胚胎數4～6個或高評分囊胚數3個及以上均失敗）；④嚴重畸形精子癥。

PGT-M/SR：①夫婦任一方或雙方經外周血染色體核型分析診斷為染色體結構異常（相互易位、羅氏易位、倒位、復雜易位、致病性微缺失或微重復等）；②夫婦任一方或雙方攜帶嚴重疾病的遺傳易感基因突變；或具有生育遺傳疾病子代高風險的夫婦，且致病基因突變診斷或致病基因連鎖標記明確；③生育過嚴重血液疾病患兒的夫婦，需通過白細胞抗原配型行骨髓移植治療。

1.2.2 排除標準 ①子宮內膜息肉或宮腔粘連者；②子宮內膜炎或子宮內膜癌者；③未行治療的輸卵管積水或宮腔積液者；④先天性子宮發育異常者，如畸形子宮或縱隔子宮者；⑤合并妊娠高風險、不能耐受的全身性疾病者。

1.3 PGT采用胚胎激光打孔法獲取囊胚期3～10個滋養外胚層細胞，行全基因組擴增，通過高通量測序分析樣本基因分型、基因拷貝數數據，檢測23對染色體的非整倍體、染色體嵌合體以及節段性重復、缺失、易位等。活檢后的胚胎進行玻璃化冷凍，直至移植前行冷凍復蘇。

1.4 子宮內膜準備方案

1.4.1 NC組 平素月經規律、無排卵障礙者，于月經周期第8～10天開始，每隔2～3 d行超聲檢查，監測子宮內膜厚度及卵泡大小。當卵泡直徑≥17 mm，子宮內膜厚度≥8.0 mm，結合雌二醇（estradiol，E2）、孕酮（progesterone）和黃體生成素（luteinizing hormone，LH）水平確定排卵日期。排卵后予黃體支持誘導內膜向分泌期轉化，口服地屈孕酮（達芙通，荷蘭蘇威制藥有限公司）30 mg/d聯合陰道置入黃體酮軟膠囊（安琪坦，法國Besins-healthcare公司）600 mg/d。內膜轉化日后5～6 d行FET。黃體支持至檢測人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）日（移植后14 d檢測血清β-hCG≥50 U/L為hCG陽性）。若成功妊娠，黃體支持至妊娠12周。

1.4.2 GnRHa+HRT組 平素月經不規律、排卵障礙或其他內膜準備方案失敗者，于經期第2～3天給予長效醋酸曲普瑞林（達菲林，法國博福-益普生制藥有限公司）肌內注射1.875 mg或亮丙瑞林（貝伊，麗珠集團麗珠制藥廠）皮下注射3.750 mg。于注射亮丙瑞林14 d或醋酸曲普瑞林28 d后，口服戊酸雌二醇（補佳樂，德國拜耳醫藥保健有限公司）4～6 mg/d，根據患者子宮內膜厚度及卵泡發育具體情況調整藥量，12～14 d，內膜厚度≥8.0 mm，結合LH、E2、孕酮水平，黃體支持轉化內膜（同NC組）。內膜轉化日后第6～7天行FET，黃體支持至檢測hCG日。若成功妊娠，黃體支持至妊娠12周。戊酸雌二醇用至檢測hCG日后逐漸減量至停藥。

1.4.3 HRT組 平素月經不規律、排卵障礙或既往子宮內膜薄者，口服戊酸雌二醇4～6 mg/d。用藥12～14 d左右，內膜厚度≥8.0 mm以上，結合LH、E2、孕酮水平，黃體支持及移植時間同GnRHa+HRT組。

1.5 妊娠結局判定標準移植后4周進行陰道超聲檢查，宮腔內可見妊娠囊者定義為臨床妊娠。胚胎于宮腔外著床定義為異位妊娠。妊娠14周之前胚胎停止發育或已經發生死亡并且未自然排出宮腔者定義為胚胎停育。妊娠不足28周或胎兒體質量不足1 000 g而終止妊娠者定義為流產。妊娠28周后分娩活嬰定義為活產。

1.6 統計學方法采用SPSS 22.0軟件進行統計分析。定量資料采用Kolmogorov-Smirnov檢驗對其進行正態性檢驗，符合正態分布的定量資料采用均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD法；不符合正態分布的定量資料采用中位數和四分位數[M（P25，P75）]表示，組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗；定性資料采用例（%）表示，組間比較采用卡方檢驗。采用多因素Logistic回歸分析PGT患者FET妊娠結局的影響因素。所有檢驗均以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組患者一般情況比較3組患者的年齡、不良孕產史、不孕時間、體質量指數（body mass index，BMI）、輔助生殖史、基礎卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，FSH）、基礎LH、基礎E2、抗苗勒管激素（anti-Müllerian hormone，AMH）、催乳素（prolactin，PRL）及促排卵情況（獲卵數、總囊胚率、優質囊胚率和囊胚培養率）比較，差異無統計學意義（均P＞0.05）。3組患者的PGT類型比較差異有統計學意義（P=0.002），NC組行PGT-SR的患者比例高于另兩組（P＜0.05）。見表1和表2。

表1 3組患者的一般情況比較

表2 3組患者的排卵情況及PGT類型比較

2.2 3組患者FET情況及妊娠結局比較3組患者的可移植胚胎數、移植日子宮內膜厚度、臨床妊娠率、流產率、胚胎停育率和活產率比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05）。NC組的異位妊娠率高于GnRHa+HRT組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 3組患者FET情況及妊娠結局比較

2.3 活產組與非活產組的臨床特征比較將所有周期分為活產組（138個周期）、非活產組（81個周期），活產組的BMI≤25 kg/m2、獲卵數＞12個、可移植胚胎數＞2個、優質囊胚數＞2個的周期比例高于非活產組，差異有統計學意義（均P＜0.05），見表4。

表4 活產影響因素的單因素分析 [例（%）]

2.4 PGT患者活產的影響因素分析以妊娠結局活產為因變量（活產賦值0，非活產賦值1），將2組比較P＜0.2的臨床特征因素包括不良孕產史、BMI、獲卵數、總囊胚數、可移植胚胎數和優質囊胚數等指標作為自變量給予賦值后進行Logistic回歸分析，結果顯示優質囊胚數＞2個是PGT患者FET活產的保護因素（P＜0.05），見表5。

表5 PGT患者活產影響因素的Logistic回歸分析

3 討論

隨著胚胎遺傳學檢測技術的發展和臨床應用，PGT成為了較成熟、準確、安全且可靠的輔助生殖技術之一[4]。該技術顯著提高持續妊娠率和活產率；降低流產率、多胎妊娠率及新生兒遺傳性疾病風險，對優生優育有重要意義。眾所周知，影響胚胎植入的因素主要有胚胎質量及子宮內膜容受性。盡管PGT助孕流程復雜，費用較高，對胚胎的質量也有一定的要求。但使用篩選過的正常及優質胚胎進行移植，已最大程度地降低因胚胎因素導致的不良妊娠結局。所以，為改善患者的妊娠結局，分析其他相關的影響因素顯得極為關鍵。

3.1 PGT人群不同內膜準備方案對其妊娠結局的影響NC、HRT和GnRHa+HRT方案是常見的子宮內膜準備方案。對于月經周期規律、排卵正常的患者且子宮內膜厚度能達到移植標準，優先推薦NC方案[5]，僅在排卵前行月經周期監測，體內激素水平更接近自然狀態，可預防高雌激素對內膜容受性的不良影響。但是，該方案的周期可控性較低，取消率較高（5%～6%）。HRT方案主要適于排卵不規律、無自發性排卵或多次采用NC周期失敗者[5]，該方案補充外源性雌、孕激素促進內膜增殖并與胚胎發育同步化，可控性較強、復診次數少、周期取消率低。但其成本增加，可能出現與補充雌激素有關的潛在不良影響，如血栓形成風險增加，內源性早發性的LH峰影響內膜微環境，不利于胚胎著床[6]。GnRHa+HRT方案則適于子宮肌瘤、子宮腺肌病、子宮內膜異位癥者或其他內膜準備方案失敗者。GnRHa可抑制內源性LH峰，并且提高子宮內膜對外源性雌激素的敏感性[7]，但周期長、費用較高。

本研究發現，臨床上不同PGT類型的患者子宮內膜準備方案選擇有差異。對于PGT-A患者，更傾向于選擇人工周期內膜準備方案（GnRHa+HRT方案或單獨HRT方案）。PGT-A患者更多因高齡、反復種植失敗、復發性流產等選擇該項助孕技術，該類患者可能有子宮內膜分型差、血供減少、宮腔微環境異常及子宮內膜容受性較低等問題，GnRHa+HRT方案或單獨HRT方案可以獲得與NC方案相似的妊娠結局[8-9]，所以針對既往有不良孕產史的患者更傾向人工周期。PGT-SR患者主要因染色體異常（易位、倒位、致病性微缺失或微重復等）前來就診，這類患者的不孕病因較為明確，并非因異常的子宮內膜容受性，在月經周期及排卵規律的情況下，NC方案基本可滿足胚胎著床的要求。

但是，上述3個方案的FET應用人群尚存在爭議，尤其是PGT胚胎的子宮內膜準備方案的研究很少。一項大型Meta分析顯示，沒有足夠的證據可以證明在FET的3種方案中哪種最優[10]。一項關于PGT-A患者的FET周期方案的研究發現，NC方案和HRT方案的臨床妊娠率、流產率及活產率無顯著差異[7]。同時，NC方案和HRT方案的PGT患者的臨床妊娠率、活產率及早期流產率比較差異均無統計學意義[11]。本研究也發現，PGT患者的FET周期中，3組內膜準備方案的臨床妊娠率及活產率相似。此外，本研究顯示NC組的異位妊娠率高于GnRHa+HRT組，與HRT組無差異。既往研究表明，NC方案和HRT方案的異位妊娠風險差異無統計學意義（0.53%vs.0.47%，OR=1.12，95%CI：0.89～1.42）[12]。Pang等[13]也發現NC方案與HRT方案的異位妊娠率差異無統計學意義（1/98vs.1/76，P=0.877）。本研究與上述研究結論不一致可能是由于這些研究納入的研究對象幾乎是所有FET類型的體外受精/卵細胞質內單精子注射（in vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection，IVF/ICSI）患者，其不孕因素主要包括男方因素、輸卵管因素、子宮內膜異位癥和內分泌相關不孕等。異位妊娠的發生可能與輸卵管功能及盆腔環境異常相關。本研究對象全部為PGT患者，但并非所有的PGT患者都需要進行輸卵管通暢度及功能的檢測。輸卵管盆腔因素已是公認的異位妊娠的獨立危險因素[14]。之前研究指出，胚胎植入宮腔時，輸卵管功能如果受損將無法把胚胎送回宮腔，44%的胚胎會被推入輸卵管中[15]。因此，推測在行NC方案解凍移植時，輸卵管盆腔因素的異常很可能增加了異位妊娠發生率，但本研究樣本量有限，需更大樣本的研究進行證實。

3.2 PGT活產結局的影響因素本研究結果還顯示，活產組中，BMI≤25 kg/m2、獲卵數＞12個、可移植胚胎數＞2個、優質囊胚數＞2個的周期比例較高（P＜0.05）。超重和肥胖女性的生育力較差，其IVF/ICSI的活產率降低，可能與卵泡發育、卵母細胞質量、胚胎發育及宮腔環境等因素有關[16]。另外，獲卵數、可移植胚胎數與活產的關系尚未統一。有研究表明，PGT-M/SR周期的活產率隨著獲卵數和可移植胚胎數的增加而上升[17]，與本研究結果一致。當獲卵數超過10個，活產率趨于平穩，但也有其他研究指出，獲卵數超過18個時活產率不再增加。這很可能與隨獲卵數增加的卵巢過度刺激綜合征風險及未成熟卵比例增高有關[18]。在復蘇及選擇移植胚胎時，為了進一步改善妊娠結局，應優先考慮優質囊胚[19]。同樣，在本研究中發現，優質囊胚數＞2個為PGT患者活產的保護因素。

3.3 結語針對PGT患者而言，3種常見內膜準備方案的臨床妊娠率及活產率無明顯差別，但NC組的異位妊娠率高于GnRHa+HRT組，推測與輸卵管因素有關，PGT患者是否需要進行輸卵管通暢度的檢查，還需大樣本的統計分析及進一步探究，在臨床中可能需要注意。另外，PGT患者的活產率還可能與BMI、獲卵數、可移植胚胎數及優質囊胚數等因素有關。因此，在促排卵周期中，盡可能讓超重及肥胖的女性患者減重，把握卵巢刺激強度使獲卵數控制在一定數量，盡量不低于12枚，但也要同時防止卵巢過度刺激。另外，要重視影響囊胚培養過程的不利因素，在安全有效的原則下，建議提高優質囊胚數（＞2個），而不是僅僅追求總囊胚數量。本研究的局限性在于，PGT樣本例數有限（尤其是PGT-M類型），因此還需擴大樣本例數及研究中心范圍，深入個體化研究，進一步去闡述PGT患者與妊娠結局相關的影響因素，以提高PGT患者輔助生殖的活產率。