基于TCGA數據庫和GEO數據庫分析SERPINE1在胃癌中的表達和預后影響

周濤，王笑天，劉東，孔斌，趙士彭

2020年全球癌癥統計數據指出，胃癌發生率位于所有癌癥中第五位，病死率排在第四位[1]，對人類健康影響巨大，嚴重威脅患者生命健康。雖然目前胃癌的治療方法較多，但是總體生存率仍較低，有必要探索發現新的預后標志物和治療靶點，不僅有助于對患者預后進行評估，而且可能提供更多的分子治療靶點。SERPINE1是SERPIN家族E成員1，又稱PAI、PLANH1、PAI1,其位置在7號染色體(7q22.1)，被認為在頭頸部腫瘤、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、結直腸癌等癌癥中對腫瘤轉移及預后有影響[2-6]。本研究通過癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas ,TCGA)及基因綜合表達(the gene expression omnibus,GEO)公共數據庫，挖掘并分析SERPINE1對胃癌預后的影響，探討其作為預測胃癌預后的一種生物學標志物及分子治療靶點的可能，為以后研究胃癌的發生發展機制提供一定的研究基礎，報道如下。

1 資料與方法

1.1 數據檢索及下載 檢索TIMER數據庫(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)，了解SERPINE1在33種癌癥中的差異表達情況。檢索TCGA數據庫(https://portal.gdc.cancer.gov/)并下載胃癌患者的STAR-Counts數據、臨床資料，獲得375例胃癌組織和32例癌旁組織的STAR-Counts數據。通過GEO數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)檢索GSE54129數據集，下載111例胃癌組織和21例癌旁組織基因表達芯片和臨床資料，調取以上111例胃癌組織SERPINE1 mRNA的表達數據，以中位數為截斷值將其分為高表達組和低表達組。

1.2 表達差異分析 將TCGA下載的375例胃癌組織和32例癌旁組織的SERPINE1 mRNA表達進行差異分析，將GSE54129數據集中21例癌旁正常組織和111例胃癌組織的SERPINE1 mRNA表達進行差異分析。

1.3 單/多因素COX分析及預后分析 收集TCGA數據集中375例胃癌患者臨床資料和SERPINE1 mRNA表達水平，刪去缺失預后資料樣本后剩余333例，然后刪去缺失性別、年齡、T分期、N分期、M分期、病理分期等資料的樣本，剩余300例患者資料，然后進行單因素分析，單因素分析后P<0.05的因素可進入多因素COX回歸分析。

1.4 Kaplan-Meier生存曲線、ROC曲線和生存列線圖繪制 收集TCGA數據集中具有完整預后資料患者共333例，并收集SERPINE1 mRNA表達數據，以其中位數為截斷值，分成高表達組和低表達組，進行Kaplan-Meier生存曲線、受試者工作特征曲線(ROC)、生存列線圖的繪制。

1.5 基因富集分析(GSEA富集) 采用軟件GSEA_4.2.3進行分析，TCGA數據集以SERPINE1 mRNA的表達量中位數為截斷值將其分為高、低表達組，以 Hall-mark 基因集作為參考基因集，分析SERPINE1在胃癌中的作用機制。

1.6 統計學方法 R 3.6.3 版本對數據進行統計分析及作圖，涉及的R包包括ggplot2包、survival包、survminer 包、timeROC包、rms包。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 泛癌分析 通過TIMER數據庫檢測SERPINE1在33種癌組織中的表達差異情況，發現SERPINE1在乳腺浸潤癌(BRCA)、結腸癌(COAD)、食管癌(ESCA)、頭頸部鱗狀細胞癌(HNSC)、腎透明細胞癌(KIRC)、直腸腺癌(READ)、胃癌(STAD)、甲狀腺癌(THCA)等8種癌組織中高表達，在膽管癌(CHOL)、腎嫌色細胞癌(KICH)、腎乳頭狀細胞癌(KIRP)、肝細胞肝癌(LIHC)、皮膚黑色素瘤(SKCM)、子宮內膜癌(UCEC)等6種癌組織中低表達，其差異均有統計學意義(P<0.05)。

2.2 胃癌組織和癌旁組織中SERPINE1 mRNA的表達差異 TCGA數據集、GSE54129數據集中胃癌組織中SERPINE1 mRNA表達高于癌旁組織(P<0.001)，見圖1。

圖1 SERPINE1 mRNA在胃癌組織和癌旁組織中的表達比較

2.3 影響胃癌患者預后的單/多因素COX回歸分析 將TCGA數據集中胃癌患者臨床資料進行單因素COX分析表明，N分期、病理分期、SERPINE1表達水平均與預后生存時間有關(P<0.05)；多因素COX回歸分析表明，病理分期4期、SERPINE1表達水平高是影響胃癌患者預后生存時間的獨立危險因素(P<0.05)，見表1。

表1 TCGA數據庫影響胃癌患者預后生存的單/多因素COX分析

2.4 Kaplan-Meier生存曲線和ROC曲線分析 收集TCGA胃癌患者生存信息和SERPINE1 mRNA表達水平，Kaplan-Meier生存曲線分析發現，高表達組總生存期(OS)明顯低于低表達組(HR=1.86，95%CI1.32～2.62，P<0.001)，見圖2。ROC曲線分析發現，SERPINE1表達預測1、3、5年生存幾率的曲線下面積(AUC)分別為0.598、0.649、0.731，預測5年生存幾率效能最好，見圖3。

圖2 Kaplan-Meier生存曲線

圖3 SERPINE1表達預測1、3、5年生存幾率的ROC曲線

2.5 生存預測列線圖構建 通過各臨床指標(性別、年齡、T分期、N分期、M分期，病理分期，SERPINE1 mRNA)構建列線圖，其得分可直觀地預測1年、2年、3年生存幾率，見圖4。

圖4 生存預測列線圖

2.6 GSEA富集分析 GSEA分析表明，SERPINE1 mRNA高表達組與SERPINE1 mRNA相關的基因富集在上皮間質轉化、炎性反應、細胞頂端連接復合物、KRAS通路、血管生成等基因集上，被富集到的通路在SERPINE1 mRNA高表達組表現為上調趨勢，可能SERPINE1的表達與以上通路及功能存在密切關系,見表2。

表2 GSEA富集分析與SERPINE1相關的通路

3 討 論

在所有已知癌癥中，胃癌的發生率及病死率仍名列前茅，雖然目前治療胃癌的方法比較多，如手術、化療、放療、靶向、免疫治療等方法[7]，但是其對人類的生存威脅仍較大，為能夠造福胃癌患者并指導臨床治療，挖掘并研究參與胃癌發生及影響胃癌患者生存的生物學標志物很有必要。有多項報道證實，尿激酶纖溶酶原激活物(uPA)系統參與癌癥的血管生成、遷移、上皮間質轉化(EMT)、免疫等生物學行為及過程，SERPINE1是尿激酶纖溶酶原激活物系統中的重要成員[8-12]。有研究發現其影響頭頸部腫瘤、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、結直腸癌等多種腫瘤患者的預后，通過靶向uPA系統治療癌癥的方法已廣泛用于腫瘤治療的研究中[13]。有研究發現，SERPINE1在荷瘤小鼠胃癌組織和胃癌細胞株中顯著高表達，過表達SERPINE1后荷瘤小鼠體內腫瘤生長明顯增快，敲低LINC00200后荷瘤小鼠體內腫瘤生長減慢，LINC00200可正向調控SERPINE1影響胃癌細胞的生長及腫瘤的形成[14]。多項研究證實，SERPINE1的表達與腫瘤發生、進展存在密切關系。

本研究基于TCGA和GEO數據庫，主要分析TCGA數據庫333例具有預后資料的胃癌患者臨床信息和STAR-Counts數據。本研究發現，SERPINE1在胃癌組織中高表達，單/多因素COX分析發現SERPINE1 mRNA的表達與胃癌患者預后具有相關性，并且是一個影響胃癌患者預后的獨立危險因素，Kaplan-Meier生存曲線和ROC曲線分析表明SERPINE1預測胃癌患者生存時間的可行性，通過GSEA富集分析，發現多個與癌癥相關的通路和生物學行為與SERPINE1高表達呈正相關，EMT生物學過程已經被多項研究證實參與腫瘤細胞的侵襲、轉移，炎性反應同樣被證實與腫瘤的發生及進展有關，EMT和炎性因子之間相互誘導，促進腫瘤的發生及轉移[15]。KRAS突變與腫瘤的發生有著密切關系，SERPINE1水平可通過KRAS通路上調[16]。另外低氧環境、血管生成也與腫瘤的發生有關，本研究通過富集分析發現，SERPINE1與影響腫瘤發生、進展的不良因素均有關。所以進一步深入的通過基礎實驗研究SERPINE1對腫瘤發生、進展的影響有重大意義。為以后從多個方面研究SERPINE1在胃癌進展中的生物學作用及影響患者預后的機制方面提供了理論依據和思路。

目前臨床中用于輔助診斷胃癌的生物學標志物有CEA、CA199、CA125、AFP等，但仍較少，并且缺乏一定的特異度及敏感度，需要挖掘更多更準確的生物學標志物用于服務臨床。通過本研究發現并證實SERPINE1作為一種生物學標志物用于胃癌輔助診斷及預測胃癌患者預后的可能性，并且可能成為一種新的治療靶點，為胃癌患者的治療提供了新的思路及方向。本研究患者例數仍較少，臨床中需要收集更多胃癌患者的臨床資料及免疫組化或基因表達數據進行更深入更有說服力的研究，致力于發現更好的治療方法來延長胃癌患者的生存時間。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

周濤：提出研究方向、研究選題、設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫;王笑天：設計研究方案，分析試驗數據，論文審核;劉東：實施研究過程，資料搜集整理，論文審核;孔斌：修改論文、論文審核;趙士彭：修訂論文、論文終審