circ-BRWD1靶向調控作用miR-132-3p介導FOXO1成骨

譚文進 王 斌

1 廣東省廣州市南沙區中醫醫院外二科 511462； 2 佛山市三水區人民醫院骨科

世界衛生組織將骨質疏松癥定義為通過雙能X射線骨密度儀測量的骨礦物質密度低于平均骨量2.5個標準差[1]。它是一種骨骼疾病，其特點是骨量低、骨結構缺陷和高風險，即使在較小的壓力下也會斷裂[1]。2010年，全球50歲以上骨質疏松骨折約1.5億，2040年將會增加1倍[2]。鈣、維生素D、雙膦酸鹽的攝入常被用于預防和治療骨質疏松癥。然而，要徹底治愈它，除了常見的物理治療和藥物治療外，應該關注從基因間的相互作用中尋找治療骨質疏松癥的方法。

環狀RNA(circRNAs)是一類非編碼RNA，通過將RNA的3’端連接到5’端而具有環狀結構[3]。它能靶向miRNA并改變miRNA的表達[3]。據預測，circRNAs會與miRNAs結合，競爭結合位點[4]。circ-BRWD1能通過調節miR-1277/TRAF6軸參與骨關節炎的發展[5]。miR-132-3p介導FOXO1對內皮祖細胞增殖有調控作用[6]。FoxO1/SIRT1/RANKL/OPG通路的激活可能是白藜蘆醇治療骨質疏松癥的基礎[7]。故假說circ-BRWD1通過靶向miR-132-3p調節FOXO1預防骨質疏松癥。本文將為骨質疏松的防治提供一定的依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2021年1—12月因股骨頸骨折行髖關節置換術的絕經后骨質疏松患者(骨密度T值≤-2.5)20例作為PMOP組，術中取自遠離關節周圍骨的股骨粗隆區的骨小梁樣本。另選取非PMOP的外傷性股骨近端骨折的患者(骨密度T值≤-0.5)18例作為對照組，需要手術內固定并暴露骨折端組織。存于液氮當中。所有患者均未接受任何影響骨骼或礦物質代謝的藥物治療。本研究經佛山市三水區人民醫院倫理委員會授權，所有患者均簽署知情同意書。兩組一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 兩組一般資料比較

1.2 儀器及試劑 紫外分光光度計、實時PCR檢測系統、流式細胞儀、熒光素酶報告檢測系統：Bio-Rad公司，美國。PCR試劑盒、引物、ALP試劑盒、茜素紅染色試劑盒、載體、miRNA mimics 及對照物、inhibitors、Trizol試劑：Takara公司，中國。抗體：abcam公司，美國。培養基、成骨分化液：Sigma公司，美國。質粒、293T細胞、Lipofectamine 2000、Percoll分離液：Invitrogen公司，美國。質粒抽提試劑盒：QIAGEN公司，德國。

1.3 研究過程 PMOP組和對照組分別取骨，建立BMSCs的體外培養體系，并作BMSCs鑒定，以ARS、ALP檢測BMSCs成骨能力，RT-qPCR檢測對照組和PMOP組BMSCs的circ-BRWD1、miR-132-3p、FOXO1相對表達值，網上找到circ-BRWD1與miR-132-3p、miR-132-3p與FOXO1的結合靶點，熒光素酶報告基因實驗進一步驗證。將pc-circ-BRWD1與agomiR-132-3p共轉染入BMSCs后檢測FOXO1的表達水平：RT-qPCR分析檢測control、agomiR-NC、agomiR-132-3p、agomiR-132-3p+pcDNA3.1、agomiR-132-3p+pc-circ-BRWD1轉染的BMSCs細胞中FOXO1的相對表達。將pc-circ-BRWD1與agomiR-132-3p或sh-FOXO1共轉染BMSCs后檢測特異性成骨分化相關因子Runx2的表達水平：RT-qPCR檢測在control、pcDNA3.1、pc-circ-BRWD1、pc-circ-BRWD1+agomiR-NC、pc-circ-BRWD1+agomiR-132-3p、pc-circ-BRWD1+sh-NC、pc-circ-BRWD1+sh-FOXO1中Runx2的相對表達。

1.4 試驗方法

1.4.1 細胞培養和成骨分化的誘導：骨組織置于抗凝管中，建立BMSCs的體外培養體系：將骨與1%雙抗的DMEM培養液混合。分離，重懸細胞，并將細胞懸液注入Percoll分離液，離心，取中間細胞層，加入培養基，吹打混勻后可獲得BMSCs細胞懸液。在37℃下儲存在5%CO2的環境中行BMSCs的成骨分化。培養基添加了成骨誘導劑：包括10-8mol/L地塞米松、濃度為50μg/ml的抗壞血酸2-磷酸和10mmol/L的2-磷酸甘油。BMSCs以5×105細胞/孔的密度接種在12孔板中，當細胞達到80%匯合度時，用成骨培養基替換培養基。每3d更換1次培養基，然后在第0、7、14、21天收獲并分析誘導細胞。

1.4.2 BMSCs鑒定：將細胞離心并懸于PBS中，分裝，棄PBS液，于每管加FITC標記的CD34、CD45、CD73、CD90以及抗體，避光孵育，PBS清洗去除未標記抗體，PBS液吹打重懸細胞后，流式細胞儀檢測。

1.4.3 堿性磷酸酶染色 (ALP)：成骨分化7d或14d后，用PBS洗滌細胞并固定。用PBS洗滌細胞后，加入500μl BCIP/NBT液體底物，室溫避光孵育10min。在每個周期后，將細胞洗滌、裂解并與緩沖底物在37℃下1h。添加3N NaOH停止，通過測量對硝基苯酚的吸光度反映的ALP活性在405nm處測定波長。

1.4.4 茜素紅染色 (ARS)：ARS以檢測成骨細胞鈣化。BMSC的接種密度為5×104細胞/孔置于12孔板中，培養24h轉染后加入分化培養基。然后細胞PBS洗滌2次，95%乙醇固定10min，蒸餾水洗滌3次，用pH 8.3的茜素紅S染色液染色37℃ 30min。細胞用蒸餾水沖洗2次后拍照，定量分析。

1.4.5 細胞轉染：購買agomiR-NC,agomiR-132-3p,pcDNA3.1、pc-circ-BRWD1[pcDNA3.1(+)/circ-BRWD1 plasmid]，agomiR-132-3p,sh-NC、sh-FOXO1載體。BMSCs在轉染前以50%～60%的匯合度在6孔板中種植24h，然后根據制造商的說明用Lipofect-tamine 2000轉染。

1.4.6 RT-qPCR：使用TRIzol試劑提取總RNA，并使用iScriptTMcDNA合成試劑盒按照試劑盒的方案合成cDNA。用iQTMSYBR Green supermix進行RT-qPCR。7500 HT快速實時PCR系統用于循環和量化反應。評估circ-BRWD1、miR-132-3p和FOXO1的相對基因表達水平。U6和GADPH被用作內參。

1.4.7 雙熒光素酶報告基因檢測：500ng野生型載體或突變載體與20nmol/L miR-132-3p模擬物或miR-NC的混合物在應用Lipo-fectamine 2000共轉染到293細胞中。然后在轉染48h后收獲細胞并測量的熒光素酶活性。

1.5 統計學方法 用SPSS20.0 軟件分析統計所得數據。計量資料以均數±標準差表示，多組比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。兩組用t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BMSCs鑒定 流式細胞術鑒定(見圖1)：CD34、CD45為陰性，CD73、CD90為陽性。符合BMSCs特點，為BMSCs。

圖1 BMSCs的流式細胞術鑒定

2.2 ARS、ALP結果 隨著時間的延長，ARS、ALP第0、7、14、21天逐漸升高(見圖2、3)。

圖2 ARS結果(#代表P<0.05) 圖3 ALP結果(#代表P<0.05)

2.3 RT-qPCR檢測對照組和PMOP組BMSCs的circ-BRWD1、miR-132-3p、FOXO1相對表達值 PMOP組circ-BRWD1、FOXO1相對表達值低于對照組，miR-132-3p高于對照組(見圖4)。

圖4 circ-BRWD1、miR-132-3p、FOXO1相對表達值(#代表P<0.05)

2.4 circ-BRWD1與miR-132-3p、miR-132-3p與FOXO1結合位點驗證 網址找到circ-BRWD1與miR-132-3p、miR-132-3p與FOXO1的結合靶點，如圖5所示。熒光素酶報告基因示miR-132-3p可顯著抑制pMIR-circ-BRWD1-WT的熒光素酶活性，而不影響pMIR-circ-BRWD1-MT活性；miR-132-3p可顯著抑制pMIR-FOXO1-WT的熒光素酶活性，而不影響pMIR-FOXO1-MT活性(見圖6)。

圖5 www.targetscan.org、starbase.sysu.edu.cn網址找到circ-BRWD1與miR-132-3p、miR-132-3p與FOXO1的結合靶點

圖6 熒光素酶報告基因實驗(#代表P<0.05)

2.5 circ-BRWD1通過miR-132-3p調控FOXO1的表達 將pc-circ-BRWD1與agomiR-132-3p共轉染后檢測FOXO1的表達水平。RT-qPCR結果顯示，過表達miR-132-3p顯著下調FOXO1表達，而過表達circ-BRWD1則上調FOXO1表達(見圖7)。

2.6 miR-132-3p過表達和FOXO1敲低對Runx2表達的影響 將pc-circ-BRWD1與agomiR-132-3p或sh-FOXO1共轉染后檢測特異性成骨分化相關因子Runx2的表達水平。Runx2的表達水平在過表達circ-BRWD1中升高，在共轉染過表達circ-BRWD1+miR-132-3p中降低，在共轉染過表達circ-BRWD1+敲除FOXO1中降低(見圖8)。

圖7 RT-qPCR分析circ-BRWD1通過miR-132-3p調控FOXO1的表達(#代表P<0.05)

圖8 RT-qPCR檢測在miR-132-3p過表達和FOXO1敲低對Runx2表達的影響(#代表P<0.05)

3 討論

FOXO1可通過降低成骨細胞內的氧化應激，對骨形成有一定的促進作用[8]。miR-96-5p可通過調控FOXO1調節成骨細胞分化[8-11]。miR-132-3p可以靶向FOXO1對內皮祖細胞增殖調控[6]。circ-BRWD1能通過調節miR參與骨關節炎的發展[5]。

本研究顯示：隨著時間的延長，ARS、ALP逐漸升高,說明BMSCs促進成骨分化。RT-qPCR檢測對照組和PMOP組BMSCs的相對表達值：circ-BRWD1、FOXO1降低，miR-132-3p升高。說明circ-BRWD1、FOXO1促進成骨，miR-132-3p抑制成骨。網上找到circ-BRWD1與miR-132-3p、miR-132-3p與FOXO1的結合靶點。熒光素酶報告基因示miR-132-3p可顯著抑制pMIR-circ-BRWD1-WT的熒光素酶活性，而不影響pMIR-circ-BRWD1-MT活性；miR-132-3p可顯著抑制pMIR-FOXO1-WT的熒光素酶活性，而不影響pMIR-FOXO1-MT活性。都證實了circ-BRWD1可靶向調控miR-132-3p、miR-132-3p可靶向調控FOXO1。而有研究[12]顯示miR-132-3p通過抑制成骨相關基因FOXO1調控胸黃韌帶細胞的成骨分化，驗證了他們之間互相調節的作用。模擬失重可通過miR-132-3p/FoxO3a/ROS通路影響成骨細胞凋亡[13]。而本實驗RT-qPCR結果顯示，過表達miR-132-3p顯著下調FOXO1表達，而過表達circ-BRWD1則上調FOXO1表達。這些結果表明，circ-BRWD1可能通過調控miR-132-3p對FOXO1表達產生調控作用。Runx2的表達水平在過表達circ-BRWD1中升高，在共轉染過表達circ-BRWD1+miR-132-3p中降低，在共轉染過表達circ-BRWD1+敲除FOXO1中降低。這些研究結果表明,miR-132-3p過度表達和FOXO1敲除可能逆轉的circ-BRWD1過表達引起的成骨的過度分化。

成骨細胞是骨形成最直接的執行者，是骨質疏松改善的主要細胞。已有研究表明circRNA在地塞米松誘導的骨質松機制中起重要作用[14]。miRNA可以調控BMSCs向成骨細胞分化，其對BMSCs增值影響并導致骨質疏松等相關疾病[15]。上調FoxO1的蛋白表達水平和轉錄活性從而抑制骨質疏松的形成[16]。circRNA、miRNA、FoxO1可通過成骨分化調節影響骨質疏松。總之，circ-BRWD1可以靶向miR-132-3p并增強FOXO1的表達，從而預防骨質疏松癥，并可能提供一種新的治療策略。