轉基因乳酸菌的安全性探討

陳營營,毛瑞峰

(淮陰師范學院 生命科學學院,江蘇 淮安 223300)

乳酸菌(Lactic Acid Bacteria,LAB)是一類異質性革蘭氏陽性菌,它們的使用歷史悠久,被認為是安全的,其中一些物種具有對人類健康有益的影響,因此被用作益生菌。此外,在描述其特征時,LAB通常被聲稱具有“公認安全”(Generally Recognized as Safe,GRAS)狀態,這也證明了其安全性[1]。然而,盡管一些LAB物種對人類無害,但從監管的角度來看,并非所有LAB都可以被描述為GRAS。美國食品藥品監督管理局(FDA)負責GRAS狀態批準,因此要求在授予特定菌株GRAS狀態之前評估其安全性。迄今為止,只有非基因修飾(非轉基因)的乳酸菌菌株獲得了美國食品藥品監督管理局的批準。

LAB的基因工程提供了各種工具來改進菌株,提高其生存能力和穩定性,提高產量和生長速度。有效表達治療蛋白和將LAB用作疫苗的可能性進一步加強了其潛在用途[2]。然而,無論一種特定的轉基因LAB可能有多有效,阻礙其營銷的一個缺點是它受到了基因操縱;這主要是由于消費者對轉基因微生物的接受度低(特別是在歐盟)以及對其使用的監管限制。在2018年國際益生菌協會世界大會上,有人指出,從科學角度來看,轉基因益生菌是完美的,在歐洲食品安全局注冊時可能不會遇到問題。然而,消費者和工業界對轉基因生物的差異阻礙了它們的接受,因此,只有天然產生的菌株才能獲得批準。 本文討論了將基因工程LAB推向市場時可能遇到的障礙,以及它們獲得更好接受所需的步驟。

1 GRAS狀態:定義與確定

GRAS狀態表明,當一種物質被添加到食品中時,美國食品藥品監督管理局認為它是安全的。美國食品藥品監督管理局可以將微生物及其衍生物歸類為批準用于特定用途的食品添加劑,也可以將其歸類為GRAS物質。自1997年以來,一種物質被認為是GRAS,如果:1)1958年之前在食品中使用過(即,GRAS狀態是基于在食品中安全使用的歷史,要求大量消費者有大量的食品消費史);或2)已采取科學程序,要求與滿足食品添加劑法規所需的證據數量和質量相同。GRAS物質和食品添加劑是根據評估專家來區分的。對于食品添加劑,美國食品藥品監督管理局確定該成分的安全性,而對于GRAS物質,可以由美國食品藥品管理局以外的合格專家進行確定。

鑒于GRAS狀態適用于美國和歐洲的監管框架,歐洲食品安全局使用合格安全假設程序來評估含有微生物的產品,并評估與人類、動物和環境使用相關的風險[3]。關于歐洲監管框架和合格安全假設程序所需的步驟,請參閱參考文獻[4],其中提供了詳細描述。

2 基因修飾的后果

LAB的基因組修飾可以導致細胞功能的失活或引入新功能。為了實現功能的失活,可以刪除或突變基因以削弱其功能。約翰遜乳桿菌具有三個活性膽汁鹽水解酶(bsh)基因,可以在小鼠腸道中持續存在;另一方面,瑞士乳桿菌不能持續存在,因為它的bsh基因發生了框架移位,導致其失活[5]。該領域的發展帶來了新的技術,現在可以精確去除或替換遺傳元素,并且已經成功應用于LAB[6],通常目的是實現生物防護,避免不需要的遺傳元素傳播到環境中。當引入新功能時,可以通過啟動子的突變(例如,允許或增加蛋白質表達)或通過逐點突變改變基因(例如,增加酶的催化活性)來激活基因[7]。還可以通過新基因的穩定基因組整合來引入新功能。

3 關于轉基因乳酸菌的主要問題及其解決方案

從監管立法角度和消費者角度來看,基因改造本身都被認為是有問題的。到目前為止,還沒有一種轉基因LAB菌株被推向市場用于治療或作為食品補充劑。相反,該行業專注于避免使用重組DNA技術,而是應用了自發誘變。

3.1 生物防護

生物防護是一種策略,用于防止遺傳物質向其他細菌的橫向傳播和工程菌株的環境傳播,以及隨后在環境中的積累。任何突變體逃逸的頻率必須足夠低,以確保突變體不可能存活。生物防護系統可以是主動的,也可以是被動的。主動遏制系統能夠通過激活殺死基因或抑制必需基因來殺死宿主,該基因的表達受到環境響應元件的嚴格控制[8]。然而,可能發生使殺傷基因失活或導致必需基因組成型表達的突變。此外,在主動系統中,引入的外源DNA的量通常大于被動系統中的外源DNA。活性系統通常依賴于質粒,質粒需要整合到細菌染色體中。隨后,在質粒整合到細菌染色體中之后,需要證明LAB的功能。另一方面,被動遏制系統是穩健的,設計非常簡單,它們主要基于通過補充環境中通常不存在的另一種基因或必需代謝產物來補充營養缺陷或基因缺陷。被動系統的主要缺點是它們通常是抑菌的,而不是殺菌的。然而,殺菌作用可以通過兩種營養缺陷型營養因子的組合獲得[8]。

新的生物防護策略使用合成基因回路來控制細胞增殖,以應對環境條件,這是由變構調節的轉錄因子檢測到的[9]。為了開發合成營養缺陷型,在大腸桿菌中構建了依賴于外源合成小分子表達必需基因的菌株。生物防護系統包含重疊的保障措施:用于控制基本基因表達的工程核糖調節劑;以及基于切割宿主基因組的核酸酶的工程成癮模塊[10]。這些新的生物防護策略可以從大腸桿菌轉移到LAB。

3.2 乳酸菌的抗生素耐藥性及其在篩選轉基因生物中的應用

抗生素耐藥性涉及活性抗生素分子直接失活的幾種機制,以及通過改變靶位點或減少抗生素攝取而喪失對抗生素的易感性的幾種機制。頻繁使用抗生素會導致耐藥細菌微生物將其耐藥機制轉移到其他微生物身上,并對公共健康和環境構成威脅。因此,2017年,世界衛生組織發起了一項運動,作為全球計劃的一部分,提高人們對抗生素耐藥性(包括抗生素耐藥性)的認識[11]。

乳酸菌可能是抗生素耐藥性基因的宿主。抗性基因轉移是垂直的,因此它本身并不存在安全問題。然而,外部因素可以誘導有利于通過食物鏈水平轉移對病原體的抗性基因的變化,這是人類和動物健康關注的一個主要原因。LAB的安全性研究表明,它們很容易對抗生素產生耐藥性。大多數可用數據都是從機會致病性腸球菌中收集的,尤其是耐萬古霉素的腸球菌,它會導致反復的醫院獲得性感染[12]。對于攝入益生菌后人類消化道中抗生素耐藥性基因轉移的風險,應考慮向免疫受損的患者添加益生菌乳酸桿菌。

3.3 無抗生素選擇系統

目前,已經開發了不含抗生素耐藥性基因的表達和基因遞送載體來提高產品的安全性。根據其作用機制,這些系統可以基于營養缺陷型、非抗生素顯性和互補標記、分離后殺傷、RNA干擾或對必需基因的去抑制[13]。非抗生素顯性選擇標記是直接的,并且取決于它們在感興趣的質粒中的存在。顯性選擇標記的例子取決于細菌素抗性或重金屬抗性[14]。細菌素的一個典型代表是乳鏈菌素,它是由某些乳酸乳桿菌菌株產生的,在食品工業中被廣泛用作一種安全天然的防腐劑。基于細菌素抗性的第一個食品級質粒含有乳酸鏈球菌素抗性基因[15]。

3.4 毒力因素

每種生物工程菌株都需要仔細評估毒力因素,即可能引起致病性的基因。外源DNA的引入可能導致新物質的合成,如蛋白質或代謝產物,這些物質也可能具有毒性或致敏性。對于新的蛋白質,必須將氨基酸序列與已知蛋白質進行比較,以獲得潛在的同源性。它們的抗營養活性(例如,作為蛋白酶抑制劑、凝集素)以及對加熱、加工和降解的穩定性必須在適當的代表性胃和腸模型系統中進行評估。到目前為止,還沒有關于這種新表達的蛋白質預測人類過敏反應的有限測試報告[16]。

3.5 延遲的不良影響

產品的安全性和個人對產品的反應取決于其應用模式(例如局部、系統)和消費者的基因檔案。特定亞群體可能特別敏感,如免疫受損的個體、嬰兒和老年人。因此,必須對新型食品進行上市后監測,以避免潛在的嚴重不良影響。在任何此類新型食品投放市場后,需要對其對消費者的影響進行長期監測。由于攝入不一致導致的技術問題可能是一個缺點,并且可能難以長期監測變化[16]。在轉基因LAB投放市場后,建議對其進行密切監測,以防止延遲的不良影響,并確保安全消費。

3.6 表面展示

重組蛋白與未分化細菌表面的異源結合將使非轉基因和不太復雜的調控程序得以使用[17];然而,需要確認缺乏重組DNA和活的重組細菌細胞。已經在LAB中成功開發了幾種異源蛋白質展示系統。與GFP融合并在大腸桿菌中表達的內溶素Lyb5附著在各種LAB的表面,包括乳桿菌、干酪乳桿菌、短乳桿菌、植物乳桿菌、發酵乳桿菌、德氏乳桿菌[18]。此外,與AcmA融合的“設計錨蛋白重復蛋白”已顯示出與嗜酸乳桿菌表面的異源結合。源于活性LAB的細菌樣顆粒同樣可以作為表面展示的載體,通過利用大腸桿菌等異源表達體系,獲得含有錨定域的融合重組蛋白,再通過與LAB細菌樣顆粒混合,可實現將目的蛋白質展示于細菌樣顆粒表面,進而獲得顆粒型疫苗等制劑,從而可避免轉基因組分的使用[19]。

4 將LAB作為細胞工廠進行基因改造

經過基因改造的LAB可以在封閉系統中作為細胞工廠生產所需的化合物,這降低了微生物不必要地釋放到環境中的可能性和污染風險。因此,從監管的角度來看,此類應用的問題要小得多。LAB的基因工程使其能夠應用于重組蛋白的表達。這里使用的最常見的屬是乳球菌屬和乳桿菌屬。LAB的代謝工程允許修改現有的代謝途徑,以改善LAB作為食品發酵起始物的特性。不同的代謝工程策略已被用于改變生產甜味劑、風味、香氣、胞外多糖和維生素的代謝途徑[20]。LAB的主要工業應用是發酵生產乳酸,乳酸也是其碳水化合物代謝的主要產物。乳酸在食品、化妝品、制藥、化工和農業中的應用歷史悠久。此外,由于乳酸被用作生產可生物降解和生物相容性聚乳酸的前體,對乳酸的需求正在增長,在纖維、紡織、塑化和包裝行業具有商業價值。感興趣的化合物的內在生產是優選的,但這通常會導致數量不足。基因修飾提供了提高感興趣化合物產量以及提高化合物特性(例如純度)的可能性。除了乳酸的生產外,LAB還在非食品(如乙醇生產)和功能成分(如維生素、低熱量甜味劑、胞外多糖和抗菌劑)的工業生產中發揮作用。代謝工程乳桿菌已用于從乳制品和玉米加工廢料中進行乙醇的工業生物轉化[21]。乳酸菌可用于生產營養品,如多元醇(如糖醇)和維生素,尤其是B族維生素,如核糖和葉酸。

5 結語

LAB的基因修飾可以產生具有廣泛應用的改良菌株,包括用于治療、食品工業和代謝產物生產(例如作為生物催化劑、細胞工廠)。這些應用程序在所需監管程序的可接受性和嚴格性方面存在差異。作為生物催化劑,LAB可用于生產乳酸、醫藥中間體、營養品和一系列化學品。它們代表了重組蛋白生產和隨后分離的有前景的細胞工廠,因為它們形成包涵體的趨勢很低,并且缺乏內毒素。如果不涉及基因工程,則通過過表達所需蛋白質來改善LAB作為細胞工廠是更可接受的。轉基因LAB在食品制造中的使用是最有問題的,因為人們擔心改良的染色劑、質粒和重組基因的傳播,尤其是公眾接受度低。為了使轉基因LAB在食品工業中的實施成為可能,已經開發了食品級表達系統,其確保用替代標記物和同源DNA的使用來取代抗生素耐藥性標記物。然而,用于食品的菌株開發仍然依賴于經典的非轉基因方法。鑒于公眾對轉基因LAB安全性方面的擔憂,相關新型研究工具應當進一步優化與完善,盡可能規避或降低出現意外風險的可能性,進而提高公眾對其的認知和接受能力。