橘小實蠅對甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽的抗性機制及對其他藥劑的交互抗性

王 敏, 王新溪, 王圣印

(1.浙江省金華市永康市農業技術推廣中心, 金華 321300; 2.浙江農林大學現代農學院, 杭州 311300)

橘小實蠅Bactroceradorsalis又名橘子蛆、果蛆、黃蒼蠅、柑橘小實蠅和東方果實蠅等,廣泛分布于中國華東、華南、華中和云貴地區[1-2]。橘小實蠅寄主范圍較廣,目前發現其寄主包括花卉、水果、蔬菜共76個科211個屬627種,適宜寄主種類數量高達478種[3]。橘小實蠅成蟲羽化后需經歷長時間補充營養,卵巢發育成熟后才能交配[4], 其雌成蟲使用外生殖器刺破柑橘果皮,在果皮內產卵,每處產卵數量5～10粒不等[5]。卵期1～6 d,孵化后幼蟲在果肉內為害,常導致柑橘被害果提前脫落,果肉腐爛失去經濟價值[6-7]。目前橘小實蠅是重要的危險性國際檢疫害蟲,也是我國的檢疫對象[8-9]。

橘小實蠅形態特征、分類地位、生活習性、發生規律和綜合防治措施是目前的主要研究內容,由于殺蟲劑廣泛使用,關于橘小實蠅田間種群抗性的研究報道也逐漸增加[10-13]。橘小實蠅在我國華南、華中、華東和云貴地區為害猖獗,導致上述地區橘小實蠅抗藥性發展迅速。陳朗杰等的研究發現,在深圳周邊地區,橘小實蠅對生物源殺蟲劑阿維菌素和菊酯類殺蟲劑氯氟氰菊酯和高效氯氰菊酯產生了16.59～18.95倍的中等水平抗性,對廣譜性殺蟲劑敵百蟲、辛硫磷、毒死蜱與滅多威產生了低水平抗性,但對生物源殺蟲劑甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽(以下簡稱甲維鹽)和多殺霉素仍處于敏感狀態[14]。何鳳梅等的研究發現,廣西不同地區橘小實蠅抗性發展水平差異較大,玉林和百色等4個地市橘小實蠅田間種群均對氯氰菊酯產生了中等水平抗性,對阿維菌素形成中等抗性的橘小實蠅僅發現于桂林和玉林兩市[15]。為探索高頻使用甲維鹽防治橘小實蠅是否存在抗性風險,通過室內連續篩選33代獲得了橘小實蠅抗甲維鹽種群(43.4倍),測定了抗甲維鹽橘小實蠅種群與常用菊酯類殺蟲劑高效氯氟氰菊酯、新煙堿類殺蟲劑吡蟲啉和噻蟲胺、有機磷類殺蟲劑辛硫磷和毒死蜱、生物源殺蟲劑阿維菌素和多殺霉素、新型雜環殺蟲劑蟲螨腈的交互抗性水平,并探索了橘小實蠅對甲維鹽的生化抗性機制。

1 材料與方法

1.1 供試殺蟲劑和試劑

供試殺蟲劑均為原藥:99%甲維鹽、99%阿維菌素和98%吡蟲啉購于貴州利興藥業有限公司;99%辛硫磷、99%毒死蜱、99%噻蟲胺、99%高效氯氟氰菊酯和99%多殺霉素購于合肥諾爾達生物科技有限公司;98%蟲螨腈購于陜西惠誠生物科技有限公司。

主要試劑:98%毒扁豆堿、98%乙二胺四乙酸(EDTA)、98%牛血清白蛋白(BSA)與99%十二烷基磺酸鈉(SDS)購于Sigma公司;70%考馬斯亮藍G250與99%還原型谷胱甘肽(GSH)購于Fluka公司;96% α-乙酸萘酯(α-NA)購于Aladdin公司。增效劑95%胡椒基丁醚(PBO)購于湖北漢達飛生物科技有限公司;98%磷酸三苯酯(TPP)購于山東國化化學有限公司;97%順丁烯二酸二乙酯(DEM)購于上海昆淼實業有限公司。其他試劑為國產分析純或化學純。

1.2 供試蟲源

相對敏感種群(S):采自浙江省金華市武義縣履坦鎮湯村。在果園內采集帶蟲柑橘落果,帶回實驗室內以柑橘飼喂。將蟲果放置在鋪有5 cm河沙的塑料盆中,果內老熟幼蟲脫果進入河沙內化蛹。收集橘小實蠅成蟲放置于20目紗籠內(60 cm×60 cm×60 cm),為其提供蜂蜜水(3%)補充營養,使用柑橘誘集產卵。室內飼養10代,期間不接觸任何殺蟲劑,建立相對敏感種群,收集2日齡成蟲作為供試蟲源。

金華田間種群(JH):采自浙江省金華市永康市花街鎮八字墻村,蟲果帶回室內后參照敏感種群飼養。收集F2代的2日齡成蟲供試。

甲維鹽抗性種群(EB):將甲維鹽原藥使用丙酮配制成母液,根據橘小實蠅抗性發展速度,按照每次篩選殺死約50%成蟲的劑量在蜂蜜水中加入甲維鹽母液。收集敏感種群2日齡成蟲約1 000頭作為供試蟲源封閉于紗籠內,饑餓處理2 h后,在紗籠內放入甲維鹽蜂蜜水,橘小實蠅取食1 h后取出甲維鹽蜂蜜水,使用無殺蟲劑的柑橘繼續飼養。篩選33代后,抗性種群的抗性倍數為43.4倍。收集抗性種群2日齡成蟲供試。飼養環境條件為(25±0.5)℃,光周期L∥D=14 h∥10 h,RH(65±5)%。

1.3 生物測定

橘小實蠅生物測定采用玻璃管藥膜法[10,14]。將供試殺蟲劑原藥使用丙酮配制成母液,根據預試驗測定結果,將殺蟲劑母液用丙酮稀釋成5～7個濃度。抽取10 mL稀釋后的藥液,注入玻璃管中(直徑5 cm,長15 cm),搖動玻璃管使藥液均勻涂布,倒掉多余的藥液,靜置玻璃管至內壁藥液風干。將20～25頭橘小實蠅2日齡成蟲引入涂布藥膜的玻璃管,放置3%蜂蜜水浸透的棉球供成蟲取食,用紗布封閉玻璃管口。24 h后觀察玻璃管內橘小實蠅成蟲的存活數量,以毛筆輕觸蟲體不能正常爬行作為標準判定為死亡。對照組為丙酮水溶液,有效試驗中對照組死亡率必須低于10%。處理和對照組均重復3次。

增效劑生物測定:首先將增效劑胡椒基丁醚(PBO)、磷酸三苯酯(TPP)和順丁烯二酸二乙酯(DEM)使用丙酮配制成母液(10 g/L)[16]。然后根據預試驗結果,將供試殺蟲劑稀釋成5～8個濃度,藥液體積除以100為增效劑母液的體積。將增效劑母液加入藥液,可使增效劑在所有藥液中的濃度一致(100 mg/L)。其他操作與上述生物測定方法相同。每濃度重復3次。

1.4 酶活性測定

1.4.1細胞色素P450含量測定

參考Lee等[17]的方法收集橘小實蠅2日齡雌成蟲5頭,置于勻漿緩沖液(0.1 mol/L pH 7.5磷酸鈉緩沖液,含1 mmol/L EDTA、0.1 mmol/L DTT、1 mmol/L PTU、1 mmol/L PMSF和10%甘油)中勻漿,操作全程冰浴。4℃,10 000 g離心15 min。過濾上清液后,4℃,10 000 g下離心1 h,將微粒體沉淀在重懸浮緩沖液(0.1 mol/L pH 7.5磷酸鈉緩沖液、1 mmol/L EDTA、0.1 mol/L DTT、1 mmol/L PMSF和20%甘油)中重懸浮作酶源。重復3次提取酶原。

參考Omura等[18]CO差示光譜法測定多功能氧化酶(MFO)和細胞色素P450含量。將微粒體懸浮液用重懸緩沖液稀釋至1 mg/mL左右,加入連二亞硫酸鈉顆粒至飽和,平衡5 min,一分為二,分別加入參比杯和樣品杯中。使用紫外可見分光光度計在波長400～500 nm處掃描,以參比杯為空白,掃描樣品杯的光吸收值為基線。待基線穩定平直時在樣品杯中通CO,以參比杯為空白,掃描樣品杯的光吸收值,記錄 OD450、OD490、OD426和OD409,按下式分別計算P450和細胞色素b5含量。每次提取酶液重復測定3次。

P450含量=(OD450-OD490)/(消光系數×蛋白含量),其中消光系數為91 mmol·L-1·cm-1;

細胞色素b5含量=(OD426-OD409)/(消光系數×蛋白含量),其中消光系數為185 mmol·L-1·cm-1。

1.4.2細胞色素P450O-脫甲基酶活性測定

參考Hansen等[19]測定多功能氧化酶(MFO)O-脫甲基酶活性。反應總體系2 mL:1 270 μL 0.1 mol/L pH 7.8的磷酸緩沖液,200 μL 0.36 mmol/L NADPH,30 μL 3 mmol/L對-硝基苯甲醚,500 μL酶液。反應體系在25℃振蕩溫育反應30 min,加入0.5 mL 1 mol/L HCl終止反應,再加入2.5 mL三氯甲烷萃取反應產物對-硝基酚,3 000 g離心15 min。取下層即三氯甲烷層1.5 mL加入1.5 mL 0.5 mol/L NaOH反萃取。NaOH萃取液使用分光光度計在400 nm測定OD值,以0.5 mol/L NaOH溶液為對照。以對-硝基酚標準曲線和酶液中的蛋白質含量求出每分鐘每毫克蛋白催化產生的對-硝基酚的摩爾數來表示酶的活性。重復3次提取酶液,每次提取酶液重復測定3次。

1.4.3羧酸酯酶活力測定

參照Van Asperen[20]的方法測定橘小實蠅CarE活力。取5頭橘小實蠅2日齡雌成蟲在液氮中冷凍后立刻加入0.04 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.0)2 mL,在冰浴條件下迅速充分勻漿,勻漿液于4℃、10 000 r/min離心10 min,分離上清液即為酶液,冰浴待用。以5 mL α-乙酸萘酯(3×10-4mol/L)為底物,加入0.2 mL酶液,在37℃條件下恒溫水浴振蕩30 min,加入1 mL DBLS(1%堅固藍B鹽水溶液∶5%十二烷基硫酸鈉水溶液=2∶5)終止反應,將混合液置于室溫顯色30 min,使用分光光度計測定600 nm處OD值。對照組以0.2 mL磷酸緩沖液代替酶液。根據α-萘酚標準曲線計算出每毫升酶生成的α-萘酚量。測定酶源蛋白質含量(mg·mL-1),計算出羧酸酯酶的比活力(nmol·min-1·mg-1)。重復3次提取酶液,每次提取酶液重復測定3次。

1.4.4谷胱甘肽S-轉移酶活力測定

參照Wu等[21]的方法測定GST的比活力。取5頭橘小實蠅2日齡雌成蟲在液氮中冷凍后立刻加入0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.0)2 mL在冰浴條件下迅速充分勻漿,勻漿液于4℃、10 000 r/min離心10 min,分離上清液即為酶液,冰浴待用。以CDNB為底物,在試管中依次加入66 mmol/L磷酸緩沖液2.4 mL,50 mmol/L谷胱甘肽0.3 mL,0.03 mol/L CDNB 0.1 mL,酶液0.2 mL,立即混勻,在27℃水浴條件下反應5 min,使用分光光度計在340 nm下測OD值。對照組以0.2 mL磷酸緩沖液代替酶液。酶源經蛋白質含量測定,計算出谷胱甘肽S-轉移酶的比活力(nmol·min-1·mg-1)。重復3次提取酶液,每次提取酶液重復測定3次。

1.4.5蛋白總量測定

酶源蛋白質含量采用考馬斯亮藍G-250染色后測定[22]。吸取0.3 mL酶液于10 mL試管中,空白對照以0.3 mL磷酸緩沖液代替,加入5 mL考馬斯亮藍G-250試劑,充分混勻于25℃恒溫水浴染色2 min,水浴后5 min內在595 nm下比色測OD值。根據牛血清白蛋白標準曲線計算出蛋白質含量,除以0.3即每毫升酶液中的蛋白含量(mg·mL-1)。重復3次提取酶液,每次提取酶液重復測定3次。

1.5 數據處理

橘小實蠅交互抗性與增效劑生物測定數據使用Polo Plus 1.0軟件分析,計算毒力回歸曲線斜率、致死中濃度(LC50)和95%置信區間[23]。酶活性測定數據使用SPSS 22.0軟件進行分析,用Duncan氏新復極差法進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 交互抗性

橘小實蠅EB種群與阿維菌素存在中等水平交互抗性(RR50=20.7),與吡蟲啉、辛硫磷和馬拉硫磷存在低水平交互抗性(5

表1 橘小實蠅抗甲維鹽種群對8種殺蟲劑的交互抗性水平1)

2.2 3種增效劑對甲維鹽的增效作用

增效劑生物測定結果表明(表2), PBO對橘小實蠅EB種群、S種群和JH種群均有顯著增效作用,增效倍數分別為3.4、2.9倍和3.3倍; TPP對橘小實蠅EB種群、S群和JH種群均有顯著增效作用,增效倍數分別為2.5、2.0倍和2.5倍; DEM對橘小實蠅EB種群、S種群和JH種群也具有顯著增效功能,增效倍數分別為1.7、1.4倍和1.6倍。

表2 增效劑PBO,TPP和DEM對甲維鹽的增效作用1)

2.3 酶活性比較

酶活性測定結果表明(表3),橘小實蠅EB種群和JH種群的細胞色素P450(3.9倍和3.1倍)和b5含量(3.3倍和1.3倍)、O-脫甲基酶活性(4.2倍和1.5倍)均較敏感種群S交顯著提高。

表3 橘小實蠅不同種群MFO O-脫甲基酶活性、細胞色素P450和b5含量1)

橘小實蠅EB種群和JH種群的谷胱甘肽S-轉移酶活性(2.7倍和1.4倍)和羧酸酯酶活性(3.2倍和1.9倍)均顯著高于敏感種群(表4)。

表4 橘小實蠅不同種群谷胱甘肽S-轉移酶和羧酸酯酶活性1)

3 討論

研究發現,棉鈴蟲Helicoverpaarmigera、西花薊馬Frankliniellaoccidentalis、黏蟲Mythimnaseparata等農業害蟲經人工選育對甲維鹽產生中高水平抗性之后,常對多種殺蟲劑產生不同水平的交互抗性[24-26]。人工室內選育出的西花薊馬抗甲維鹽種群可對阿維菌素產生高水平交互抗性(31.7倍),對甲維鹽具有高抗性水平的黏蟲種群也會對阿維菌素形成中等交互抗性(21.8倍)[25]。本研究發現,橘小實蠅EB種群與阿維菌素存在中等水平交互抗性。綜合黏蟲、西花薊馬和棉鈴蟲交互抗性研究結果推測,同種害蟲易對作用機制相同的殺蟲劑產生交互抗性。對甲維鹽具有高抗性水平的西花薊馬種群可對啶蟲脒形成中等交互抗性,對吡蟲啉、蟲螨腈、氯氟氰菊酯、毒死蜱和滅多威有低水平交互抗性;黏蟲高抗甲維鹽種群可對毒死蜱和滅多威形成中等交互抗性,與辛硫磷和氟氯氰菊酯之間交互抗性水平較低;西花薊馬和黏蟲抗性種群的多功能氧化酶、羧酸酯酶和谷胱甘肽S-轉移酶等生化解毒酶活性均顯著增強[25-26]。在本研究中,橘小實蠅EB種群對吡蟲啉、馬拉硫磷、辛硫磷、高效氯氟氰菊酯、噻蟲胺表現出低水平交互抗性,推測橘小實蠅EB種群代謝解毒酶活性升高可能是形成上述低水平交互抗性的重要生化機制。橘小實蠅EB種群對噻蟲胺、高效氯氟氰菊酯、多殺霉素和蟲螨腈未表現出交互抗性,因此推薦甲維鹽與噻蟲胺、高效氯氟氰菊酯、多殺霉素和蟲螨腈在田間輪換使用,對于甲維鹽與吡蟲啉、辛硫磷和馬拉硫磷輪用應持謹慎態度,禁止甲維鹽與阿維菌素輪用。

多項研究表明,多種農林害蟲對甲維鹽的抗性與多功能氧化酶活性增強相關[27-29]。王圣印等[25]的研究發現,多功能氧化酶抑制劑增效醚(PBO)可顯著降低甲維鹽對西花薊馬的致死中濃度,對甲維鹽具有高抗性水平的西花薊馬種群多功能氧化酶活性顯著高于敏感種群。宋月芹等[26]的研究表明,PBO可顯著提高甲維鹽對黏蟲的毒力,黏蟲對甲維鹽產生高水平抗性時,其多功能氧化酶活性亦同步顯著上升。侍甜等[30]的研究表明,多功能氧化酶抑制劑增效醚(PBO)可顯著提高甲維鹽對甜菜夜蛾田間種群的毒力,酶活性測定結果也表明其多功能氧化酶活性比敏感種群高出1.7～7.4倍。在本研究中,PBO可顯著提高甲維鹽對橘小實蠅的室內毒力,橘小實蠅EB種群的O-脫甲基酶活性顯著升高,細胞色素P450和b5含量也顯著增高。由上述研究結果推測,多功能氧化酶活性提高可能是橘小實蠅經室內篩選對甲維鹽產生高水平抗性的主要生化機制。

羧酸酯酶抑制劑磷酸三苯酯(TPP)常用于間接探索昆蟲羧酸酯酶活性與抗藥性的關系[31-33]。王圣印等[25]的研究發現,TPP可顯著降低甲維鹽對西花薊馬高抗甲維鹽種群和敏感種群的致死中濃度,西花薊馬對甲維鹽產生高水平抗性后,其羧酸酯酶活性也顯著增高。對黏蟲高抗甲維鹽種群和敏感種群進行室內毒力測定時,TPP可顯著降低甲維鹽對上述兩個種群的致死中濃度,抗甲維鹽種群的羧酸酯酶活性也顯著升高到1.64倍[26]。侍甜等[30]的研究表明,在使用甲維鹽對甜菜夜蛾進行室內生物測定時,酯酶抑制劑DEF對甲維鹽的增效倍數最高可達7.7倍,其羧酸酯酶活性可上升至敏感種群的4.7倍。本研究中,橘小實蠅EB種群的羧酸酯酶活性顯著增強,而TPP可顯著降低甲維鹽對橘小實蠅EB、JH和S種群的致死中濃度。綜上所述,羧酸酯酶活性增強可能是橘小實蠅對甲維鹽抗性提高的重要因素。

在增效劑生物測定試驗中,順丁烯二酸二乙酯(DEM)常用于間接探索昆蟲谷胱甘肽S-轉移酶與其抗藥性的關系[34-36]。谷胱甘肽S-轉移酶活性抑制劑DEM可顯著降低甲維鹽對西花薊馬的致死中濃度,西花薊馬對甲維鹽的抗性水平上升時,谷胱甘肽S-轉移酶活性也隨之顯著提升[25]。DEM可顯著提升甲維鹽對黏蟲的室內毒性,當黏蟲對甲維鹽產生高水平抗性時,抗性種群的谷胱甘肽S-轉移酶活性顯著上升[26]。本研究中,室內汰選得到的橘小實蠅EB種群谷胱甘肽S-轉移酶活性顯著提高,而DEM可顯著提高甲維鹽對EB、JH和S等3個橘小實蠅種群的室內生物測定毒力,因此,谷胱甘肽S-轉移酶活性增強可能是橘小實蠅對甲維鹽抗性水平上升的重要因素之一。

目前對橘小實蠅多進行綜合防控,檢驗檢疫是防治橘小實蠅的首要措施,預測預報有助于做好防治準備措施并決定防治時機,農業防治清潔田園可有效減少蟲源,物理防治懸掛黃板或誘集液有助于防治橘小實蠅成蟲[37]。在橘小實蠅成蟲暴發期,化學防治也是必須采取的措施之一[37-38]。結合本研究結果,建議合理輪換使用甲維鹽、噻蟲胺、高效氯氟氰菊酯、蟲螨腈和多殺霉素,可有效延長甲維鹽、噻蟲胺、高效氯氟氰菊酯、蟲螨腈和多殺霉素的使用壽命。以甲維鹽單劑為基礎,通過添加增效劑創新殺蟲劑配方與劑型,有助于實現對橘小實蠅抗性治理,提高甲維鹽對橘小實蠅的田間防效。