10種中草藥提取物對棉鈴蟲、綠盲蝽觸殺活性研究

叢勝波, 萬 鵬, 李文靜, 李 棟, 孫 俊, 尹海辰*

(1.湖北省農業科學院植保土肥研究所, 農業農村部華中作物有害生物綜合治理重點實驗室,農作物重大病蟲草害防控湖北省重點實驗室, 武漢 430064; 2.中化現代農業(湖南)有限公司, 長沙 410205)

棉鈴蟲Helicoverpaarmigera,屬于鱗翅目Lepidoptera夜蛾科Noctuidae,綠盲蝽Apolyguslucorum,屬于半翅目Hemiptera盲蝽科Miridae,兩種害蟲廣泛分布于世界各地,在我國棉花、蔬菜和果樹種植區均有發生,寄主種類均在200種以上,棉鈴蟲可為害番茄、白菜、甘藍等,綠盲蝽則對蘋果、棗、葡萄等50余種經濟作物生產造成嚴重影響[1-3]。棉鈴蟲曾經在我國長江及黃河流域棉花種植區造成嚴重危害,隨著Bt棉花的種植,該蟲的危害得到了有效的控制,綠盲蝽上升成為我國棉花的主要害蟲。然而在Bt棉花的高強度種植區,已有棉鈴蟲耐受性提升的報道[4-5],綠盲蝽由于具有世代重疊嚴重、飛行能力強等特點,抗藥性風險日益嚴重[6-7]。綜上所述,急需尋找一種對棉鈴蟲、綠盲蝽安全高效的防治新手段。

我國的中草藥植物是一類重要的植物資源,除去在醫藥上的應用外,利用植物防治害蟲具有悠久的歷史,早在2000多年前我國就已有相關記載,近年來科研人員篩選了多種具有較高殺蟲活性的中草藥植物提取物[8-10]。相比于傳統化學農藥,這些植物源農藥來源于自然,對害蟲的作用方式多樣,因此具有污染小，易降解,害蟲不易產生抗性等優點[11-12]。本研究選取了10種中草藥植物,制備了其乙醇提取物,測定了乙醇提取物對棉鈴蟲、綠盲蝽兩種害蟲的觸殺活性,并采取萃取、硅膠柱分離等手段,初步對其有效成分進行了分離,本研究以期為兩種害蟲高效安全的新型藥劑開發提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試蟲飼養

試驗所用綠盲蝽和棉鈴蟲采集自湖北省武漢市、鄂州市等地棉田,在實驗室內于(26±1)℃,光周期L∥D=16 h∥8 h,相對濕度60%條件下分別用四季豆和人工飼料飼養多代,飼養期間未接觸任何藥劑。

1.2 供試中草藥粗提取物的制備

選用苦杏仁(種子)、云木香(根)、香加皮(根皮)、大黃(根)、萹蓄(全株)、薄荷(地上部分)、紫花地丁(全株)、韭菜籽(種子)、澤漆(全株)、五加皮(樹皮)等10種中藥材,本研究所用中草藥均采購自湖北中醫藥大學,將100 g供試中藥打成粉末后置于250 mL無水乙醇中室溫浸泡15 d,將提取液用旋轉蒸發儀蒸干溶劑獲得膏狀提取物。

1.3 植物提取物對棉鈴蟲、綠盲蝽的觸殺活性測定

將100 mg中草藥乙醇粗提物用少量乙醇溶解,用蒸餾水將樣品稀釋至15 mg/mL,每種粗提物配制1 mL藥液用于試驗。每種粗提物設置3組重復,每個重復20頭2齡棉鈴蟲幼蟲或2齡綠盲蝽若蟲,以含有少量乙醇的蒸餾水為對照組。將試蟲置于培養皿中,用POTTER噴霧塔(北京安迪永富科貿有限公司,ADPT-1型)噴霧處理,處理后棉鈴蟲置于24孔板內飼養,每孔放入1塊人工飼料(1 cm3大小)并接入1頭棉鈴蟲幼蟲;綠盲蝽置于玻璃指形管(直徑2 cm,高5 cm)內飼養,每個指形管放入1塊四季豆(長約4 cm)并接入20頭綠盲蝽若蟲。統計藥后1、3、7 d棉鈴蟲幼蟲和綠盲蝽若蟲死亡率。

1.4 不同極性溶劑萃取及萃取物生測

選擇觸殺活性較高的粗提物進行不同溶劑萃取,將10 g粗提物用500 mL純凈水溶解后,依次使用等量的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇4種極性不同溶劑進行萃取,萃取后使用旋轉蒸發儀蒸干溶劑,獲得萃取物,將萃取物用于棉鈴蟲、綠盲蝽觸殺活性的生測,生測方法、濃度及用量等同上。

1.5 萃取物硅膠柱層析分離及生測

硅膠柱層析分離方法參考李秀梅等[13]的報道,選擇觸殺活性較高的萃取物,利用相應溶劑溶解。采用濕法裝柱,選用200～300目硅膠為吸附劑,洗脫液為石油醚∶乙酸乙酯(3∶1)。每份300 mL,收集流分并編號,并通過經TLC檢測合并相鄰流分中含有相同Rf值洗脫物的流分。流分經旋轉蒸發后,供殺蟲活性測定使用,生測方法、濃度及用量等同上。

1.6 數據處理

根據公式計算校正死亡率：

校正死亡率=(處理死亡率-對照死亡率)/(1-對照死亡率)×100%。

不同植物提取物、萃取物及流分之間的校正死亡率通過單因素方差分析LSD法分析,分析軟件使用SPSS Statistics 17.0。

2 結果與分析

2.1 植物提取物對棉鈴蟲、綠盲蝽的觸殺活性

中草藥乙醇粗提物生測結果表明, 10種乙醇粗提物對棉鈴蟲2齡幼蟲均具有一定的觸殺效果,其中經香加皮和苦杏仁處理后的棉鈴蟲幼蟲,藥后7 d校正死亡率較高,分別為56.8%和65.4%(表1)。而對于綠盲蝽2齡若蟲,粗提物觸殺效果較為顯著,除五加皮提取物外,其余9種提取物均具有顯著的觸殺活性,藥后7 d校正死亡率均在80%以上(表2)。

表1 中草藥乙醇粗提物對棉鈴蟲2齡幼蟲的觸殺活性1)

表2 中草藥乙醇粗提物對綠盲蝽2齡若蟲的觸殺活性

2.2 不同極性溶劑萃取組分對綠盲蝽的活性

由表1和表2可知,中草藥粗提物對于棉鈴蟲的觸殺活性相對較差,因此后續選擇綠盲蝽若蟲為試驗對象。苦杏仁和萹蓄提取物對于綠盲蝽觸殺作用均較強,但萹蓄的提取率較低,因此選擇苦杏仁進行后續試驗。在進行分離萃取時,由于乙酸乙酯、正丁醇萃取蒸干后獲得的提取物質量過低,因此無法進行生測;當加入氯仿后苦杏仁粗提物出現析出物,這種析出的不溶物對綠盲蝽觸殺活性最高,藥后7 d校正死亡率達96.9%;而氯仿和石油醚的萃取物藥后7 d對綠盲蝽的校正死亡率僅為6.2%和7.3%,水相未表現出殺蟲活性(表3)。由于氯仿萃取時析出物對綠盲蝽表現出最高的觸殺活性,因此選擇其進行層析柱分離。

表3 苦杏仁4種萃取物對綠盲蝽2齡若蟲的觸殺活性

2.3 苦杏仁萃取物硅膠柱層析分離及生物活性

苦杏仁粗提物經氯仿萃取時析出的不溶物經層析柱分離后可產生4組流分,生測結果表明,流分L36-48對綠盲蝽2齡若蟲的觸殺活性最高,校正死亡率可達84.7%(表4)。而L8-15、L18-24兩組流分校正死亡率低于50%。

表4 苦杏仁氯仿萃取析出物不同流分對綠盲蝽2齡若蟲的觸殺活性

3 討論

本文利用10種中草藥提取物對棉鈴蟲、綠盲蝽開展觸殺活性測定,結果表明，中草藥提取物對綠盲蝽具有較好的觸殺活性,其中苦杏仁提取物校正死亡率最高。進一步分離發現活性成分可能存在于氯仿萃取時的析出物中,且流分L36-48觸殺活性最高。

目前,中草藥提取物的殺蟲活性已受到科研人員的廣泛關注。王謙等[14]采用藥膜法測定了5種中草藥提取物對菇蠅的毒殺活性,結果表明，百部Stemonajaponica和苦參Sophoraflavescens對菇蠅的毒殺活性顯著;方濤等[15]測定了28種植物提取物對棉蚜Aphisgossypii的殺蟲活性,結果發現曼陀羅Daturametel、毒參Coniummaculatum、大戟Euphorbiapekinensis等8種植物提取物具有較高殺蟲活性,其中曼陀羅提取物殺蟲活性最高;Abdelatti和Hartbauer[16]研究發現,葛縷子Carumcarvi、橘皮Citrusaurantiumdulcis和平鋪白珠樹Gaultheriaprocumbens等3種提取物的復配劑對蝗蟲具有較好的防治效果,噴施24 h后試蟲死亡率可達80%～100%,且該提取物對于小麥幼苗無藥害。本文通過對蘿藦科、薔薇科、大戟科等10種中藥材提取物殺蟲活性的研究,為中草藥植物資源的利用提供了理論支持。

目前,苦杏仁提取物已被證實對家蠅Muscadomestica、玉米象Sitophiluszeamais、白紋伊蚊Aedesalbopictus以及黏蟲Mythimnaseparata具有很好的熏蒸、觸殺活性[17-19]。但對于其有效成分分離鑒定的相關研究較少,馬玉花等[19]的研究發現,去除HCN的苦杏仁精油的殺蟲活性顯著高于含HCN的苦杏仁精油,其原因可能是精油中微量的HCN不足以對試蟲造成毒殺作用,而除去HCN后反而提升了精油中有效成分的含量。于新池[20]的研究表明,苦杏仁精油主要成分是苯甲醛、苯甲酸、二甲苯、正十六烷等,然而其抗菌殺蟲活性并不能完全歸因于其主要成分苯甲醛。由此可見,苦杏仁的活性成分目前尚不明確,本文對其有效成分開展了初步的分離鑒定,為后續研究奠定了基礎。

在當前棉花害蟲抗藥性風險日益嚴峻的情況下,利用中草藥植物資源開發新型藥劑是解決防治問題的重要思路。在今后研究中還應繼續開展中草藥植物活性物質的鑒定,同時在觸殺作用以外,苦杏仁等植物提取物還可能存在熏蒸、驅避等多種作用方式,綜合利用這些植物資源是開發害蟲高效安全的防治手段的基礎。