棉鈴蟲載脂蛋白受體基因克隆及轉錄分析

劉香亞, 楊蕊弘, 張 晶, 彭英傳, 肖海軍, 張萬娜*

(1.江西農業大學, 南昌 330045; 2.北京林業大學, 北京 100083)

昆蟲的生殖與營養狀況息息相關[1],卵巢作為雌蟲繁衍的生殖器官,其發育調控關系昆蟲的種群密度,解析卵巢發育過程中營養的積累過程,有助于探索針對害蟲生殖進行防控的策略來控制害蟲種群繁殖。昆蟲卵母細胞內需要積累充足糖原、脂質和蛋白質,為胚胎發育提供能量和營養[2]。關于昆蟲卵母細胞中蛋白質的積累研究已較為明確[3],雌性脂肪體內合成的卵黃原蛋白(vitellogenin, Vg)分泌到血淋巴后,通過卵黃原蛋白受體(vitellogenin receptor, VgR)介導的內吞作用,被發育的卵母細胞攝取[4-5]。然而脂質如何在卵母細胞中積累,尤其是脂類運輸所依賴受體的轉運過程尚不清楚。脂質占昆蟲卵干重的30%～40%[6-7],昆蟲利用脂肪酸合成甘油三酯(triacylglycerol, TAG),為昆蟲胚胎發育提供主要的能量來源[8],但卵母細胞自身合成脂肪酸的能力非常有限,因此昆蟲卵母細胞中積累的大部分脂質必須從其他組織攝取。在昆蟲卵黃發生過程中,脂肪體中的脂類和卵黃蛋白前體依賴載脂蛋白(lipophorin, Lp)轉運至卵巢組織[9],在部分昆蟲中,Lp也同脂肪體合成的其他卵黃蛋白一起被卵巢吸收[10-12]。然而Lp完成脂質等物質的運輸后,需要細胞表面的載脂蛋白受體(lipophorin receptor, LpR)通過內吞作用介導細胞對脂蛋白的攝取和代謝[9]。由此可見,LpR在脂類物質的轉運途徑中發揮重要作用。

LpR 是一種跨細胞膜的糖蛋白,屬于低密度脂蛋白受體(low density lipoprotein receptor, LDLR)超家族,具有LDLR家族的保守結構域[5]:配體結合域(ligand binding domain, LBD)、表皮生長因子前體同源結構域(EGF-precursor homology domain)、O-糖鏈結構域(O-sugar linked domain)、跨膜結構域(transmembrane domain, TM)及胞質結構域(cytoplasmic domain)。最早從飛蝗Locustamigratoria中克隆獲得昆蟲的LpR基因,功能分析發現LpR充當 Lp 以內吞的形式進入細胞的受體蛋白[13]。隨后在其他昆蟲中陸續鑒定出LpR基因[14-16]。Lee等[17]在大蠟螟Galleriamellonella中發現20-羥基蛻皮酮(20E)和膽固醇均能誘導LpR的表達。Ciudad等[18]分別從德國小蠊Blattellagermanica的脂肪體和卵巢中鑒定出了L亞型和 S亞型的LpR,進一步分析表明不同亞型在卵黃發生期的表達模式存在差異,干擾LpR表達后卵母細胞中脂蛋白的含量顯著降低。此外,Parra-Peralbo等在黑腹果蠅Drosophilamelanogaster中也鑒定到兩種LpR基因,并發現其能夠介導卵母細胞對中性脂質的攝取[19]。Lu 等[20]敲除褐飛虱Nilaparvatalugens的LpR基因導致褐飛虱體內TAG含量降低,卵巢發育受阻以及生殖力下降。Qiao等[21]對豌豆蚜AcyrthosiphonpisumLpR進行RNA干擾,導致其成蟲生殖力顯著下降。上述研究表明LpR對雌蟲卵巢成熟至關重要。

棉鈴蟲Helicoverpaarmigera(Hübner)是我國重要的農業害蟲,其雌成蟲需要通過補充營養促使自身性成熟[22]。棉鈴蟲VgR調控卵母細胞對Vg的攝取,對卵子成熟和卵巢發育至關重要[23],幼蟲面臨饑餓脅迫會降低體內脂質和蛋白質的含量[24]。本文通過RT-PCR 和RACE技術克隆獲得棉鈴蟲HaLpR基因,分析其序列特征,進一步通過qRT-PCR檢測其在棉鈴蟲雌成蟲卵巢發育期間的表達情況,分析了饑餓脅迫對載脂蛋白受體基因表達的影響。本研究有助于闡明載脂蛋白受體參與棉鈴蟲卵巢發育過程中的脂類轉運及應對饑餓脅迫時的作用。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

棉鈴蟲種群于2018年9月采自河北廊坊中國農業科學院廊坊中試基地。幼蟲置于人工氣候箱用人工飼料飼養[25]。培養條件為溫度(27±2)℃,相對濕度(70±5)%,光周期 L∥D=14 h∥10 h。待其化蛹后,將雌雄蛹分開后分別置于養蟲籠(長40 cm、寬26 cm、高21 cm)中飼養。成蟲羽化后,飼喂10%蜂蜜水。

1.2 棉鈴蟲不同發育階段和組織的樣品準備

為了研究HaLpR在棉鈴蟲不同發育階段的表達情況,分別收集卵約200粒、1齡幼蟲50頭、2齡幼蟲10頭、3齡幼蟲5頭、4齡幼蟲3頭、5齡幼蟲3頭、6 齡幼蟲3頭、蛹3頭以及雌雄成蟲各3頭,設為1個生物學重復。另外,分別取羽化后1、2、3,4、5、7、8、9 d的雌成蟲各2頭,用于研究HaLpR在棉鈴蟲雌蟲發育階段的表達模式。取6頭2日齡棉鈴蟲雌成蟲,置于冰上解剖,分別收集頭、表皮、馬氏管、血淋巴、中腸、脂肪體和卵巢組織,用于分析HaLpR在棉鈴蟲雌蟲不同組織的表達情況,除血淋巴外的各組織均用預冷的無菌水清洗,濾紙吸干多余水分,上述所有樣品經液氮冷凍后迅速置于-80℃超低溫冰箱保存。試驗包含4個生物學重復。

選取剛羽化的棉鈴蟲雌成蟲各20頭,分別飼喂10%蜂蜜水和清水,設置為對照組和試驗組,飼喂24、48、72 h后每個處理隨機選取6頭成蟲,在冰上解剖收集其脂肪體和卵巢,用無菌水洗凈,濾紙吸干多余水分,經過液氮冷凍后置于-80℃冰箱保存,用于分析饑餓處理后HaLpR基因的表達差異,試驗包含4個生物學重復。

1.3 總RNA提取和cDNA合成

將棉鈴蟲樣品置于預冷的研缽內,加入液氮研磨成粉末后迅速轉移到1.5 mL的RNAase離心管中,然后采用TRIzol法提取總RNA,并使用超微量分光光度計和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的純度及完整性。取2 μg總RNA,使用PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser(北京天根生物有限公司)合成第一鏈cDNA,保存于-20℃冰箱備用。RACE擴增所需cDNA模板使用SMARTer?RACE 5′/3′ Kit(寶日醫生物技術有限公司)合成。

1.4 棉鈴蟲HaLpR基因的克隆

根據本實驗室所測的棉鈴蟲轉錄組結果,搜索棉鈴蟲轉錄組數據獲得載脂蛋白受體的基因片段,利用Premier 5.0軟件設計特異性引物進行驗證,然后設計5′ RACE和3′ RACE 引物(表1)通過Advantage?2 PCR Kit(寶日醫生物技術有限公司)分別擴增獲得3′端和5′端序列,具體操作按照試劑盒說明書進行。將PCR擴增片段切膠回收后,使用連接酶將其與pGM-T克隆載體(北京全式金生物技術有限公司)連接,轉至大腸桿菌感受態細胞DH5α中,經過熱激、復性、涂板及37℃過夜培養,挑選陽性菌落進行測序。然后將所得序列片段拼接得到cDNA全長序列。設計特異引物HaLpR-F 和HaLpR-R驗證開放閱讀框,PCR反應體系為cDNA模板1 μL,10 μmol/L上、下游引物各1 μL,PCR Master Mix 12.5 μL,ddH2O 9.5 μL。擴增條件:94℃預變性3 min；94℃變性30 s,58℃退火30 s,72℃延伸2 min,35個循環；72℃延伸5 min。

表1 本試驗使用的引物序列

1.5 棉鈴蟲HaLpR序列分析及系統發育樹的構建

利用ORF finder(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)查找完整的開放閱讀框,并利用ExPASy網站translate tool(https:∥web.expasy.org/translate/)對HaLpR基因的ORF序列進行翻譯,采用SignalP 4.1 軟件(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/)和TMHMM-2.0(https:∥services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0)預測信號肽和跨膜區,利用SMART軟件(http:∥smart.embl-heidelberg.de/)進行結構域分析。根據翻譯得到的氨基酸序列,運用NCBI的BLASTP工具搜索其他昆蟲的LpR序列,根據搜索到的其他昆蟲中同源性高的LpR氨基酸序列,利用ClustalX和Genedoc軟件進行多重比較,使用MEGA 11軟件采用鄰位相接法(neighbor joining, NJ)構建系統發育樹,進行1 000次重復構建。用于結構域分析及進化樹構建的昆蟲載脂蛋白基因及登錄號見表2。

表2 構建進化樹所使用的不同種類昆蟲載脂蛋白受體基因及登錄號

1.6 利用實時熒光定量qRT-PCR技術對HaLpR進行表達量分析

根據獲得的棉鈴蟲HaLpR的cDNA序列,設計一對熒光定量引物q-HaLpR-F/R,以棉鈴蟲β-actin基因為內參基因(表1),進行擴增效率驗證后,利用qRT-PCR檢測HaLpR在棉鈴蟲不同發育階段和不同組織的表達量。qRT-PCR采用SYBR Green 法,25 μL反應體系:2×qPCR Master Mix 12.5 μL，cDNA模板2 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，ddH2O 8.5 μL。反應在Bio-rad CFX96熒光定量PCR儀中進行,反應程序為:95℃預變性1 min;95℃變性5 s,60℃退火30 s,循環40次;熔解曲線95℃ 15 s,60℃ 15 s,95℃ 15 s。qRT-PCR結果用 2-△△Ct法進行分析[26]。

1.7 數據統計與分析

不同發育階段和不同組織間的基因表達量差異顯著性采用單因素方差分析(One-way ANOVA),并采用Fisher’s LSD檢驗進行多重比較(α=0.05)。對照組和饑餓處理組的基因表達量采用配對t-test法進行差異顯著性分析。數據分析使用SPSS 17.0軟件。

2 結果與分析

2.1 棉鈴蟲載脂蛋白受體基因基本特征

棉鈴蟲LpR基因命名為HaLpR(基因登錄號KU355886.1),序列全長 3 117 bp,包含25 bp的5′非編碼區和449 bp的3′非編碼區,開放閱讀框為2 643 bp,編碼880個氨基酸。預測其蛋白質分子量為98.67 kD,等電點為5.01,預測其編碼的蛋白質在N-末端含有1個信號肽,剪切位點位于第31和第32殘基。氨基酸結構域分析發現HaLpR基因編碼的蛋白包含典型的低密度脂蛋白受體結構域:8個富含半胱氨酸的配體結合域、3個表皮生長因子結構域、5個低密度脂蛋白受體YWTD結構域、1個跨膜域(795-817位氨基酸)以及一個網格蛋白包被的凹陷內化基序FDNPVY(832-837位氨基酸)。

2.2 棉鈴蟲載脂蛋白受體HaLpR序列相似性及系統進化樹

棉鈴蟲HaLpR與其他昆蟲LpR基因編碼的氨基酸序列比對表明,LpR 氨基酸序列在不同物種間的保守性較高,都包含低密度脂蛋白受體配體結合域(LDLa)、表皮生長因子結構域(EGF)、低密度脂蛋白受體YWTD 結構域(LY)等結構域(圖1)。棉鈴蟲的HaLpR與斜紋夜蛾Spodopteralitura的LpR氨基酸序列相似性為94.4%,與螟蛾科Pyralidae臍橙螟Amyeloistransitella和大蠟螟LpR的氨基酸序列相似度分別為88.7%和87.5%,與蠶蛾科Bombycidae家蠶、蓖麻蠶SamiariciniLpR的相似度分別為85.2%和87.8%,與黑脈金斑蝶Danausplexippus、玉帶鳳蝶Papiliopolytes、金鳳蝶P.machaon和柑橘鳳蝶P.xuthus等鱗翅目蝶類昆蟲LpR的相似度在83.1%～85.5%之間,與其他非鱗翅目昆蟲的氨基酸序列的相似性在59.5%～72.4%之間(圖1)。

圖1 棉鈴蟲及其他昆蟲LpR氨基酸序列的結構分析與比較

進化樹顯示,棉鈴蟲HaLpR與斜紋夜蛾的LpR親緣關系最近,與臍橙瞑、大蠟螟、家蠶、蓖麻蠶等昆蟲LpR的親緣關系較近,而與黑脈金斑蝶、玉帶鳳蝶及柑橘鳳蝶等昆蟲的親緣關系較遠。總體趨勢是親緣關系越近,同源性越高,與氨基酸序列比對結果一致(圖2)。

圖2 不同昆蟲物種LpR氨基酸序列的系統進化關系分析

2.3 HaLpR在棉鈴蟲不同發育時期和組織的表達

HaLpR在卵和雌成蟲體內高表達,在幼蟲和雄成蟲體內表達量較低(圖3a)。HaLpR在雌成蟲各個日齡均有表達,表達量在雌成蟲羽化后第3天到達高峰,隨后逐漸降低,在羽化后第9天降到最低水平(圖3b)。HaLpR在脂肪體和卵巢中高表達,在血淋巴中次之,而在中腸、表皮、馬氏管和頭部等組織中表達量較低(圖3c)。

圖3 HaLpR 在棉鈴蟲不同發育階段(a)、雌蟲不同日齡(b)及雌蟲不同組織(c)的表達情況

2.4 饑餓處理對HaLpR表達的影響

棉鈴蟲雌成蟲經饑餓處理后,卵巢和脂肪體中HaLpR基因的表達量都受到抑制。與飼喂10%蜂蜜水的對照組相比,飼喂清水的饑餓處理組卵巢中HaLpR的表達量整體呈現下降的趨勢,24 h和48 h的表達量分別是對照組的115.3%和66.9%,而到72 h時其表達量顯著低于對照組,僅為對照組表達量的41.9%(t=3.7,df=3,P=0.03)(圖4a)。另一方面,饑餓處理降低HaLpR在脂肪體中的表達,在饑餓處理 24 h,其表達量是對照組的82.18%,差異不顯著(t=1.16,df=3,P=0.33),在饑餓48 h和72 h后,其表達量分別是對照組的37.5%和24.8%,顯著低于對照組(48 h:t=4.7,df=3,P=0.018;72 h:t=4.7,df=3,P=0.018)(圖4b)。

圖4 饑餓對棉鈴蟲雌成蟲卵巢(a)和脂肪體(b)組織中HaLpR 基因表達量的影響

3 結論與討論

遷飛昆蟲羽化時卵巢并未發育成熟,雌成蟲通常需要補充包括糖、蛋白、脂肪等營養物質促進其卵巢發育及胚胎成熟[27]。昆蟲卵母細胞中積累的蛋白質在脂肪體內合成后通過受體介導的內吞作用轉運至卵母細胞,大量研究表明VgR是將 Vg 輸送到生長中的卵母細胞的關鍵因子,對昆蟲卵巢成熟起著重要的促進作用[3-5],除此之外,昆蟲卵母細胞發育也需要積累脂類物質,而載脂蛋白受體LpR能與相應的載脂蛋白結合,以內吞作用介導細胞對脂質的攝取與代謝[8-9]。本研究通過RT-PCR與RACE技術克隆得到棉鈴蟲HaLpR的全長序列,發現其具有該基因家族的典型結構域(圖1),通過對多種昆蟲LpR氨基酸序列結構對比發現,不同物種在低密度脂蛋白受體配體結合域富含半胱氨酸的重復序列存在差異(圖1),然而已有研究表明配體結合域LDLa的第6-8重復域在與配體結合時不發揮作用[28],因此我們推測不同昆蟲的受體與配體結合力無差異。

HaLpR基因時空表達譜分析表明,HaLpR在棉鈴蟲雌成蟲中高表達,推測LpR可能與棉鈴蟲雌蟲的生殖行為相關,該推測與德國小蠊和褐飛虱的研究結果一致[18-20]。而豌豆蚜ApLpR在成蟲體內的表達量低于幼蟲,但在胚胎時期表達量顯著高于其他齡期[21],同樣的,HaLpR也在棉鈴蟲卵內高表達,這可能與脂質作為胚胎發育期的重要營養消耗物質相關。另外組織表達譜分析發現棉鈴蟲HaLpR在2日齡雌蟲的脂肪體和卵巢內高表達,從側面證實昆蟲的LpR可能參與脂肪體和卵巢組織的脂質運輸和攝取。類似表達模式在其他昆蟲中也有報道,例如褐飛虱的NlLpR在脂肪體和卵巢內高表達,而在頭部、表皮和中腸的表達量相對較低[20]。飛蝗的LmLpR-S在卵巢的表達量顯著高于其他組織,而飛蝗中的另一個LpR亞型LmLpR-L除了在卵巢內高表達外,還在翅芽中高表達[29]。豌豆蚜的ApLpR在腹部角質層中高表達,并且通過RNAi 抑制ApLpR的表達會降低豌豆蚜表皮羥基化合物和內部碳氫化合物的含量,進而增加對干燥的敏感性[21]。另外,家蠶中的LpR-4亞型在其腦部及腦神經細胞中特異性地表達[16],果蠅的LpR-S亞型在幼蟲的腦神經高表達,并與星形膠質細胞衍生的載脂蛋白相互作用,介導神經膠質細胞脂質穿梭[30]。由于基因的階段性或者組織特異性表達往往與其在組織或者階段的生命活動相關,這表明LpR除了參與成蟲卵巢發育相關的脂質轉運外,還參與了表皮層及神經細胞的脂質運輸。

昆蟲的繁殖力與成蟲期的營養息息相關,饑餓處理顯著降低成蟲期有營養需求的昆蟲的產卵量[31-33],卵母細胞內積累的脂類是維持胚胎發育的主要能量來源,在致倦庫蚊Culexquinquefasciatus中發現卵母細胞發育所需的能量90%以上來自于脂類[34],果蠅中95%的脂類主要依靠血淋巴內的載脂蛋白轉運[35]。甜菜夜蛾Spodopteraexigua經饑餓處理后體內脂肪含量顯著降低[36],本研究通過實時熒光量PCR檢測發現棉鈴蟲經饑餓處理后HaLpR基因無論在脂肪體還是卵巢組織內表達量都顯著降低,這說明饑餓處理抑制了HaLpR的表達,我們推測饑餓處理導致昆蟲產卵量降低可能跟載脂蛋白受體基因表達受到抑制有關。Lu等利用RNAi技術發現干擾NlLpR基因后褐飛虱體內的甘油三酯含量和Vg含量都顯著降低,進而導致褐飛虱的產卵量和孵化率顯著降低[20]。此外,沉默魚虱Lepeophtheirussalmonis的LsLpR,其后代數量下降為對照組的25%[37]。然而在德國小蠊中,干擾LpR顯著降低雌蟲脂肪體內的脂質含量,但LpR干擾組和對照組的生殖力無明顯差異[18]。然而在棉鈴蟲中,饑餓處理降低了雌蟲的生殖力,但饑餓24、48、72 h后棉鈴蟲雌蟲體內脂肪含量無顯著變化(數據未發表),由于載脂蛋白與組織細胞之間的相互作用可能需要多種組分的參與,棉鈴蟲HaLpR對卵巢發育的具體影響仍需要RNAi或者基因編輯技術進一步研究。