中紅側溝繭蜂對棉鈴蟲核型多角體病毒的傳播作用

查 萌, 田志強, 李建成, 路子云, 李 貞, 張松斗, 劉小俠*

(1.中國農業大學植物保護學院, 北京 100193; 2.河北省農林科學院植物保護研究所, 保定 071000)

棉鈴蟲Helicoverpaarmigera(Hübner)作為多食性害蟲,嚴重為害棉花、小麥和玉米等多種糧食和經濟作物,給農業生產造成了巨大的損失[1]。傳統化學藥劑防治帶來了環境污染、害蟲抗藥性等一系列問題[2]。生物防治是棉鈴蟲綠色防控的重要手段之一[3-4]。中紅側溝繭蜂Microplitismediator(Halidag)是一種獨居性內寄生蜂,可寄生棉鈴蟲低齡幼蟲,通過抑制幼蟲取食而使其失去為害能力,是田間害蟲生物防控的重要因子[5-8]。棉鈴蟲核型多角體病毒(Helicoverpaarmigeranucleopolyhedrovirus, HearNPV)作為一種重要的害蟲病原微生物,由于其安全、高效,且對非靶標生物低毒等特點而被廣泛應用于農業和林業害蟲防治[9-11]。

寄生性天敵與微生物源農藥協同應用,在害蟲綜合治理中仍然面臨著較多挑戰。有研究表明,寄生蜂攜帶并傳播病毒對病毒在宿主種群中的流行以及對害蟲種群的控制起到重要作用。例如繭蜂科寄生蜂Microplitiscroceipes(Cresson)可以傳播3種野生型昆蟲病毒,有效提高煙芽夜蛾Heliothisvirescens(Fabricius)的感毒率[12];黑腿絨繭蜂Apantelesmelanoscelus(Ratzeburg)先在感毒寄主體內產卵再寄生健康寄主時,能夠將舞毒蛾核型多角體病毒(Lymantriadisparnecleopolyhydrovirus, LdNPV)傳播至健康宿主種群;黑唇姬蜂Campoletissonorensis(Cameron)通過產卵器傳播煙芽夜蛾核型多角體病毒的效率高達40%[13];菜粉蝶絨繭蜂Apantelesglomeratus(Linnaeus)傳播菜粉蝶顆粒體病毒(Pierisrapaegranulovirus, PrGV)的效率能達到81%～95%[14]。此外,對于一些不能經口感染的病毒,如囊泡病毒(Ascovirus, AV),只能依賴于寄生蜂的產卵行為將病毒注射到宿主血淋巴來進行侵染[15-16]。

寄生蜂的傳毒方式對傳毒效率有重要影響,例如寄生蜂在感染病毒的寄主體內產卵使產卵器攜帶病毒,隨后通過產卵將病毒傳播至健康宿主體內,從而實現病毒的水平傳播[17]。同時寄生蜂通過爬行等活動將體表攜帶的病毒沾染到寄主昆蟲的生境內,也能夠使病毒在宿主種群中水平傳播[18]。此外,給寄生蜂飼喂含有病毒的蜂蜜水或用病毒懸浮液浸泡蜂繭也能傳播一定量的病毒,但具體的傳毒機制尚不明確[19-20]。

中紅側溝繭蜂與棉鈴蟲核型多角體病毒均能夠對棉鈴蟲的種群數量起到較好的控制作用。但當二者同時使用時,中紅側溝繭蜂能否充當病毒的傳播載體,在棉鈴蟲種群內部傳播病毒尚未見相關研究報道。探究不同方式下中紅側溝繭蜂對HearNPV的傳毒效率以及具體的傳播機制,將會為協同利用寄生蜂和昆蟲病毒防治棉鈴蟲提供一定的參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1 供試材料

棉鈴蟲:來自中國農業大學有害生物綜合治理實驗室。幼蟲、蛹、成蟲均飼養在人工光照培養箱中,光周期L∥D=14 h∥10 h, 溫度(26±1)℃,相對濕度(70±10)%。幼蟲用人工飼料飼喂[21]。羽化為成蟲后每天用10%蜂蜜水飼喂,雌成蟲產卵后使用0.5% 84消毒液對卵布進行消毒處理,隨后使用清水沖洗干凈。

中紅側溝繭蜂:由河北省農林科學院植物保護研究所提供。將200頭中紅側溝繭蜂的蜂繭置于指形管中羽化,羽化后的成蟲放入樹脂蜂箱(80 cm×80 cm×80 cm)中飼養并進行交配,將蜂箱放在人工氣候培養箱里,培養條件為:光周期L∥D=14 h∥10 h, 溫度(26±1)℃,相對濕度(70±10)%。每天提供10%蜂蜜水作為成蟲營養源。成蜂羽化并自由交配2～3 d后進行寄生繁育子代。

病毒:棉鈴蟲核型多角體病毒(Helicoverpaarmigeranucleocapsid nucleopolyhedrovirus,HearNPV)干粉,每克含包涵體數量為5×1011個(5×1011OBs/g),購買于河南濟源白云實業有限公司。

1.2 中紅側溝繭蜂不同帶毒方式的傳毒效率測定

1.2.1體表噴灑病毒的寄生蜂傳毒試驗

選取羽化后2～3 d的中紅側溝繭蜂雌蜂(羽化后2～3 d是中紅側溝繭蜂的交尾高峰期),用小噴瓶均勻噴灑2.5×107OBs/mL HearNPV懸浮液至寄生蜂體表,每頭蜂單頭處理,噴灑3泵的量。自然晾干10 min后讓其寄生健康棉鈴蟲,具體方法為:將蜂引入放有單頭3齡初棉鈴蟲的培養皿(d=10 cm),觀察到寄生蜂有產卵行為后將棉鈴蟲取出單頭飼養,繼續放入下一頭棉鈴蟲,每只寄生蜂寄生5頭健康棉鈴蟲,連續寄生3 d,觀察50頭帶毒寄生蜂在帶毒第1天(處理當天)、第2天、第3天的寄生行為,分別統計棉鈴蟲的染毒率。棉鈴蟲蟲體發白、行動遲緩、最終液化死亡為典型的染毒死亡癥狀,據此可判定棉鈴蟲死亡由病毒引起。染毒率=染毒棉鈴蟲/處理的棉鈴蟲總數×100%。

1.2.2在染毒棉鈴蟲體內產卵的寄生蜂傳毒試驗

讓棉鈴蟲2齡初幼蟲取食滴加有2.5×107OBs/mL HearNPV懸浮液的小塊飼料,取食24 h后更換紫外照射30 min的新鮮人工飼料,取食帶毒飼料3 d后讓充分交配的中紅側溝繭蜂雌蜂寄生染毒的棉鈴蟲幼蟲,方法為:將10頭染毒的棉鈴蟲放入培養皿(d=10 cm),再引入1頭雌蜂,觀察到寄生蜂產卵1次后立即取出,繼續引入下一頭雌蜂。共引入50頭雌蜂作為染毒蜂用于后續試驗。讓寄生過染毒棉鈴蟲的寄生蜂連續3 d寄生健康的3齡初棉鈴蟲幼蟲。寄生方法同1.2.1。統計棉鈴蟲的染毒率。

1.2.3飼喂含毒蜂蜜水的寄生蜂傳毒試驗

用10%的蜂蜜水配制HearNPV懸浮液,濃度為2.5×107OBs/mL,讓充分交配3 d的中紅側溝繭蜂雌蜂取食1 d后寄生健康的3齡初棉鈴蟲幼蟲。寄生方法同1.2.1,連續寄生3 d,統計棉鈴蟲的染毒率。

1.2.4蜂繭浸毒的寄生蜂傳毒試驗

取1日齡的中紅側溝繭蜂蜂繭,于2.5×107OBs/mL HearNPV懸浮液中浸泡10 s,自然晾干后單個繭放入指形管中,置于人工氣候箱[光周期L∥D=14 h∥10 h, 溫度(26±1)℃,相對濕度(70±10)%]中羽化,羽化后蜂放到一起充分交配3 d,然后讓雌蜂寄生健康3齡初棉鈴蟲。寄生方法同1.2.1,連續寄生3 d,統計棉鈴蟲染毒率。

1.2.5從染毒棉鈴蟲體內發育而來的寄生蜂傳毒試驗

讓羽化后充分交配的中紅側溝繭蜂雌蜂寄生棉鈴蟲2齡末幼蟲。方法為:將1頭雌蜂引入放有10頭健康2齡初棉鈴蟲幼蟲的培養皿(d=10 cm)中,共寄生100頭棉鈴蟲,寄生2 d后給棉鈴蟲飼喂滴加有10 μL 104OBs/mL的HearNPV懸浮液的小塊人工飼料,收集棉鈴蟲體內發育而來的寄生蜂蜂繭,單個置于指形管中羽化,羽化后充分交配3 d,再讓其寄生健康的3齡初棉鈴蟲幼蟲。寄生方法同1.2.1,連續寄生3 d,統計棉鈴蟲的染毒率。

對照組(CK)采用不進行任何病毒處理的中紅側溝繭蜂雌蜂,羽化后充分交配3 d再進行試驗。處理組和對照組的寄生蜂每頭寄生5頭健康的棉鈴蟲幼蟲。采用單頭觀察法,將寄生蜂和單頭未染毒的棉鈴蟲幼蟲同時放入培養皿(d=10 cm)中,觀察到寄生蜂產卵后立即將棉鈴蟲幼蟲取出,單頭放入指形管中加入新鮮人工飼料飼養,供試的健康棉鈴蟲幼蟲為體型基本一致的3齡初幼蟲,每種帶毒方式測試50頭中紅側溝繭蜂雌蜂。處理組和對照組的50頭雌蜂寄生的棉鈴蟲主要表現為染毒、被寄生、未被寄生(正常狀態)、不明原因(非染毒和寄生的癥狀),統計每種情況的比例。

1.3 不同帶毒方式下寄生蜂體內病毒量檢測

1.3.1構建HearNPV拷貝數與Ct值的標準曲線制作

給2齡棉鈴蟲飼喂滴加10 μL 2.5×107OBs/mL HearNPV懸浮液的小塊飼料,待棉鈴蟲發育至3齡時提取DNA。以提取的DNA樣品為模板,用HearNPV的polyhedrin基因引物(序列:F:5′-CAAACCGAACCGTTGTTACC-3′,R:5′-TGCAA-GTTCATAACGGGAC-3′)進行PCR擴增[21],polyhedrin基因片段連接到載體pMD18-T上,再轉化至大腸桿菌Escherichiacoli感受態細胞DH5α中,挑取單克隆提取質粒,以10倍梯度稀釋為1.21×104～1.21×109拷貝/μL的質粒作為模板,以polyhedrin基因的引物進行實時熒光定量RT-PCR,每濃度設3個重復,生成Ct值與拷貝數之間的標準曲線,根據標準曲線可以求出待測樣品的拷貝數。

1.3.2不同傳毒方式下中紅側溝繭蜂攜帶的病毒量檢測

取1.2中不同帶毒方式處理的中紅側溝繭蜂雌蜂,提取單頭蜂的DNA,以提取的DNA為模板,用病毒polyhedrin基因引物進行熒光定量PCR,根據標準曲線計算寄生蜂攜帶的病毒含量[20]。每組處理分別檢測10頭。

1.3.3飼喂含毒蜂蜜水的中紅側溝繭蜂雌蜂卵巢病毒檢測

由1.2中不同帶毒方式下的中紅側溝繭蜂傳毒效率結果得出,飼喂含毒蜂蜜水的方式寄生蜂的傳毒效率較高,為了進一步探究寄生蜂是否經消化系統、生殖系統進行傳毒,解剖了飼喂含毒蜂蜜水1 d后的寄生蜂的卵巢,并提取DNA檢測病毒量,對照組為未接觸病毒的中紅側溝繭蜂雌蜂卵巢。病毒陽性對照為2.5×107OBs/mL HearNPV懸浮液。

1.4 數據統計

利用SPSS 25.0軟件對試驗數據進行統計分析,應用Duncan氏多重比較法對不同傳毒方式處理下寄生蜂攜帶的病毒含量、卵巢病毒含量進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 中紅側溝繭蜂不同帶毒方式的傳毒效率

如圖1所示,中紅側溝繭蜂體表帶毒(圖1a)和飼喂含毒蜂蜜水(圖1b)的方式下,處理組和對照組80%左右的棉鈴蟲表現為被寄生的癥狀,在寄生蜂連續傳毒的3 d內,處理組均有棉鈴蟲染毒死亡,且隨著寄生蜂攜毒時間的延長,染毒率呈下降趨勢。在染毒寄主體內產卵、蜂繭浸毒、繁育寄主帶毒方式下,除了蜂繭浸毒在傳毒第1 天和繁育寄主帶毒后傳毒第1 天棉鈴蟲染毒率分別為1.2%、5.7%以外,其余傳毒時間棉鈴蟲的染毒率均為0(圖2)。表明在上述3種情況下中紅側溝繭蜂不能傳播病毒。

圖1 寄生蜂體表帶毒(a)、飼喂含毒蜂蜜水(b)傳毒方式下棉鈴蟲癥狀的比例

圖2 在染毒寄主體內產卵、蜂繭浸毒、繁育寄主帶毒方式下棉鈴蟲癥狀的比例

統計分析顯示(表1),中紅側溝繭蜂體表噴灑病毒以及飼喂含毒的蜂蜜水2種帶毒方式下的傳毒效率相對較高,在傳毒的第1、2、3天分別為15.1%、9.1%～9.3%、2.4%～4%,隨著傳毒時間的延長,傳毒效率逐漸降低。其他方式下的傳毒效率幾乎為0。

表1 不同帶毒方式下中紅側溝繭蜂寄生后棉鈴蟲的染毒率

2.2 不同帶毒方式下寄生蜂攜帶的病毒量檢測

由Ct值與HearNPV拷貝數得出Ct值與HearNPV拷貝數對數的線性關系為y=-3.4254x+ 39.786(x表示Ct值,y表示HearNPV拷貝數的對數),圖中(圖3)數據顯示,處理組中紅側溝繭蜂雌蜂的病毒拷貝數顯著高于對照組(F=9.271,df=5,P<0.05)。其中寄生蜂體表噴灑病毒的處理方式攜帶病毒量最多[lg(HearNPV拷貝數)≥3],在染毒棉鈴蟲體內產卵的寄生蜂攜帶病毒量相對較少[lg(HearNPV拷貝數)為2.3]。為探究飼喂含毒蜂蜜水時中紅側溝繭蜂是否通過生殖系統進行傳播,檢測了飼喂含毒蜂蜜水的中紅側溝繭蜂卵巢中的病毒含量,得出病毒拷貝數的對數為0.27(圖4),對照組病毒拷貝數的對數為0.34,同對照組無顯著差異,說明取食含毒蜂蜜水后,卵巢中基本不含有病毒。

圖3 不同帶毒方式下的寄生蜂病毒含量

圖4 飼喂含毒蜂蜜水的中紅側溝繭蜂卵巢病毒含量

3 結論與討論

本試驗結果表明,幾種不同的帶毒方式下,中紅側溝繭蜂對HearNPV的傳播效率均較低,為0～15%。其中,飼喂含有病毒的蜂蜜水、蜂體表噴灑病毒懸浮液的傳毒效率相對較高,在傳毒的第1天達到15.1%。而蜂繭帶毒、繁育寄主帶毒和在染毒寄主體內產卵的方式幾乎不能傳播病毒,傳毒效率第1天不超過6%,后2 d傳毒效率為0。

本研究得出寄生蜂通過不同的處理方式能夠攜帶部分病毒,但帶毒量與傳毒效率并非成正相關,例如雌蜂從感染病毒寄主體內發育而來、蜂繭浸毒的攜毒量與飼喂含毒蜂蜜水的攜毒量相當,但是傳毒效率卻相差較大,原因可能是:從感毒棉鈴蟲體內發育而來的雌蜂以及蜂繭浸毒的雌蜂雖然攜帶一定量病毒,但其攜帶的病毒無法直接傳播至棉鈴蟲體內或周圍的環境,導致傳毒效率低,飼喂含毒蜂蜜水是將雌蜂直接暴露于含有病毒蜂蜜水的棉球,蜂體表易沾染上病毒,在寄生時可以將病毒傳播至寄主的體表或周圍的環境和食物中,更容易經口攝入,增加了染毒的概率。

通常情況下,寄生蜂在田間傳播病毒有兩種方式,一種是通過產卵行為將病毒注射到寄主血淋巴內;另一種是寄生蜂體表攜帶病毒,在寄主搜尋和寄生過程中將病毒帶到宿主生存的環境或宿主體表使宿主染毒[23-24]。本研究發現體表噴灑病毒和飼喂含毒蜂蜜水的傳毒效率較高,且在連續傳毒的3 d內,這2種方式的傳毒效率幾乎相等,并無顯著差異。飼喂含毒蜂蜜水的雌蜂卵巢中的病毒量與對照無顯著差異,說明病毒不是經過寄生蜂的生殖系統進行傳播。給中紅側溝繭蜂飼喂含有病毒的蜂蜜水、蜂體表噴灑病毒懸浮液表現較高的傳毒效率,說明很可能是通過體表沾染病毒來傳播,寄生蜂在取食含毒蜂蜜水的過程中體表沾染了病毒,在寄生過程中將體表的病毒帶到棉鈴蟲體表或生境中,進而實現病毒的傳播。Stoianova等將病毒懸浮液噴灑在寄生蜂體表,病毒的傳播率明顯高于在染毒寄主體內產卵而帶毒的方式,主要原因為體表沾染病毒后,寄生蜂既可以通過產卵將病毒引入寄主體內,也可以將病毒傳播至寄主昆蟲的食物上使其取食染毒,增加了病毒進入寄主體內的途徑,因此傳毒率相對較高[25]。Young等也認為通過體表帶毒將病毒引入寄主體內的概率要高于在染毒寄主體內產卵的傳毒方式[18]。

在不同的寄生蜂-病毒-寄主系統中,寄生蜂能否傳播病毒以及具體的傳毒效率均有差異[19]。Zhang等測試了淡足側溝繭蜂Microplitispallidipes(Szepligeti)4種不同的帶毒方式——在染毒主體內產卵、繁育寄主帶毒、蜂體表帶毒、給寄生蜂飼喂含毒蜂蜜水下對甜菜夜蛾核型多角體病毒(Spodopteraexiguamultiple necleopolyhydrovirus, SeMNPV)的傳播效率,結果表明不同帶毒方式傳毒效率相差較大,體表帶毒方式下傳毒效率顯著高于其他幾種方式[20]。影響病毒傳播效率的因素還包括供毒寄主本身攜帶的病毒載量。有研究結果表明寄生蜂只有在寄主染毒癥狀表現十分明顯時才能將其體內的病毒傳播到健康的寄主,且傳毒效率隨著供毒寄主感染病毒濃度的升高而增加[26-28]。本研究只是初步統計了單一病毒濃度下的中紅側溝繭蜂傳毒效率,且采用的供毒寄主是染毒2 d的棉鈴蟲,可能棉鈴蟲體內病毒量不高導致寄生蜂產卵器上未攜帶足量病毒,限制了傳毒效率。因此,還可以進一步探究以飼喂不同濃度病毒或染毒不同天數的棉鈴蟲作為供毒寄主時中紅側溝繭蜂的傳毒效率。

本研究明確了給中紅側溝繭蜂飼喂含毒蜂蜜水和體表噴灑病毒方式下傳毒效率相對較高,中紅側溝繭蜂在染毒宿主體內產卵、從染毒宿主體內發育、蜂繭浸泡病毒3種方式幾乎不能傳播病毒。總體來說,中紅側溝繭蜂對HearNPV的傳播效率有限,后續可以探索開發新的寄生蜂傳播病毒的策略。