印防己毒素對中年雌雄小鼠焦慮水平及學習記憶能力影響

段 夢 思， 項 楚 欽， 李 鏡 嬌， 亢 婷， 施 艷 芬， 付 玉

( 昆明理工大學 醫(yī)學院， 云南 昆明 650504 )

0 引 言

學習記憶能力的損傷是衰老過程中常見的大腦認知功能障礙，早期未得到正確有效的治療則會發(fā)展為更嚴重的神經系統(tǒng)疾病，如輕度認知障礙(mild cognitive impairment，MCI)與阿爾茲海默病(Alzheimer disease，AD)，嚴重影響老年人的健康生活．中年是很多老年性疾病的萌發(fā)期，行為上也許表現(xiàn)多樣，但其內在神經機理可能已經受到衰老過程的影響．例如，中年獼猴視皮層神經元的視覺反應特性有好有壞，但其神經元信噪比等卻表現(xiàn)出一致退化[1]．因而，研究中年階段的認知損傷過程對揭示老年階段出現(xiàn)的認知障礙機理具有積極意義．

學習記憶損傷受多種因素調控，如突觸可塑性、神經遞質、外界環(huán)境因素等．其中，對神經遞質的研究較多，大腦中神經遞質主要分為兩種：以谷氨酸為代表的興奮性神經遞質和以γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)為代表的抑制性神經遞質[2]，通過抑制神經傳遞來降低神經元興奮性，實現(xiàn)中樞神經系統(tǒng)興奮/抑制平衡．GABAA受體在前額葉皮層、紋狀體等腦區(qū)中均有分布，被激活后可以引起神經元超級化，進而抑制神經信號的傳遞[2]．GABA系統(tǒng)與學習記憶有著密切的關系，可參與調節(jié)突觸可塑性、長時程增強、認知過程等[3]．該系統(tǒng)紊亂也是衰老與AD等神經退行性疾病的重要表現(xiàn)[4]．反之，通過調節(jié)GABA系統(tǒng)，進而恢復興奮/抑制平衡是衰老及AD等神經退行性疾病干預與治療的潛在靶標之一[5]．

印防己毒素(picrotoxin，PTX)是一種GABAA受體拮抗劑，可調控GABAA受體的異構位點[6]．在過去的研究中，PTX經常作為一種工具藥，用于探討衰老及相關疾病的藥理或物理干預是否與GABA系統(tǒng)調節(jié)有關[7]．Fu等的前期研究發(fā)現(xiàn)，GABA受體調節(jié)能夠影響衰老認知，如蠅蕈醇[8]、荷包牡丹堿[8]、巴氯芬[9-10]等能夠增強或損傷中老年小鼠的空間記憶能力．此外，也有文獻報道，PTX可恢復海馬依賴性學習記憶損害小鼠的長時程增強[11]，以及非癲癇劑量的PTX可以逆轉AD模型小鼠的記憶缺陷[12]．但有關PTX作為GABAA受體的拮抗劑是否影響衰老小鼠認知的研究報道非常有限．并且，文獻顯示PTX對GABAA受體的拮抗具有性別差異[13]，然而，關于PTX對衰老認知的影響是否具有性別差異，目前幾乎沒有文獻報道．

本研究主要探討PTX對中年雌雄小鼠認知的影響，實驗通過腹腔注射PTX，采用曠場實驗、Y迷宮實驗、Morris水迷宮實驗等行為學范式檢測PTX組小鼠與對照組小鼠焦慮水平及學習記憶能力之間的差異．

1 材料與方法

1.1 實驗動物、藥物、儀器

實驗動物為8～11月齡的C57BL/6野生型(wild type，WT)小鼠(昆明理工大學實驗動物中心)，雌鼠10只(n(PTX)=5，n(生理鹽水對照組)=5)，雄鼠19只(n(PTX)=9，n(生理鹽水對照組)=10)．小鼠在自然晝夜節(jié)律(12 h光/12 h暗)下飼養(yǎng)于33 cm×20 cm×14 cm(長×寬×高)的飼養(yǎng)籠中，每籠5～6只．平均體質量31.36 g，喂食標準飼料(由蘇州雙獅實驗動物飼料科技有限公司提供)及滅菌純水(由昆明理工大學實驗動物中心提供)，飼養(yǎng)間環(huán)境溫度22～26 ℃，環(huán)境濕度55%～65%，小鼠從SPF級飼養(yǎng)間轉移到普通飼養(yǎng)間適應環(huán)境4 d后開始進行實驗．所有實驗動物的操作均符合中華人民共和國《實驗動物管理條例》(2017年3月1日修訂版)相關規(guī)定．

實驗藥物及儀器為PTX(ChemeGen公司)，生理鹽水(昆明南疆制藥有限公司)，一次性使用1 mL無菌注射器(江蘇治宇醫(yī)療器材有限公司)，實驗室自制水迷宮、Y迷宮、正方體敞箱．

1.2 分組及給藥方法

實驗分為4組，分別是雄性PTX實驗組、雄性生理鹽水對照組、雌性PTX實驗組、雌性生理鹽水對照組．經查閱相關文獻，得到0.18 mg/kg為小鼠長期注射PTX的低劑量[7，13]．實驗前將PTX溶于0.9%氯化鈉注射液中配制0.18 mg/mL的藥品20 mL備用，每次實驗前，用注射器吸取1 mL PTX溶液定容至10 mL，得到0.018 mg/mL的注射液．每只小鼠的藥物注射量為(體質量(g)×0.01) mL．對照組小鼠注射(體質量(g)×0.01) mL的生理鹽水．

1.3 行為學測試方法

1.3.1 曠場實驗 曠場(open field，OPF)實驗，又稱敞箱實驗，主要用來觀察嚙齒類動物的自發(fā)性探索運動活性和焦慮行為[14]．本研究將通過OPF實驗查看PTX的急性注射劑量是否影響小鼠的通常活動力．在不影響小鼠活動力的情況下，才進一步研究PTX對認知的影響．OPF實驗中，小鼠總運動距離反映其活動水平，直立次數(shù)是其探索能力的指標，糞便顆粒、小鼠在中心區(qū)運動的距離及在中心區(qū)的停留時間反映其焦慮緊張行為．在本實驗中，每只小鼠接受一次測試，將小鼠面壁放入黑色開口正方體箱(40 cm×40 cm×40 cm)任意一角中，規(guī)定箱子中心(20 cm×20 cm)區(qū)域為中心區(qū)，其余為外周區(qū)，攝像頭固定于箱子正上方，允許小鼠自由探索5 min．每只小鼠測試完成后記錄小鼠糞便顆粒數(shù)，之后用75%酒精擦拭箱子底部清理干凈排泄物，去除上一只鼠留下的痕跡，避免影響下一只鼠的實驗結果．實驗過程中，用攝像頭全程記錄運動軌跡，以便后期分析其各項指標．

1.3.2 Y迷宮實驗 Y迷宮(Y-maze)實驗是檢驗嚙齒類動物空間識別記憶能力的經典范式[15]．其總穿梭次數(shù)、行走距離等指標也可用來反映PTX長期注射對小鼠活動力的影響．本文Y迷宮由完全相同的3個臂(30 cm×8 cm×15 cm)組成，實驗前將墊料放入Y迷宮中并在3個臂貼入不同的標識，以便小鼠學習記憶．Y迷宮中，以小鼠在3個臂的探索時間、移動距離、探索次數(shù)和總探索次數(shù)為檢測指標．本實驗分為訓練期和檢測期．首先用擋板將新異臂隔開，將小鼠從起始臂面壁放入，讓其自由探索10 min，間隔一段時間后，檢測小鼠的記憶能力，取消新異臂的擋板，將小鼠從起始臂面壁放入，讓其自由探索5 min．每只小鼠訓練或檢測完成后，將墊料混勻，避免小鼠殘留氣味影響下一只鼠的實驗結果．實驗過程中，用攝像頭全程記錄運動軌跡，以便后期分析其各項指標．

1.3.3 Morris水迷宮實驗 Morris水迷宮(Morris water maze，MWM)實驗是檢驗嚙齒類動物空間學習記憶能力的經典范式[16]，本實驗采用直徑100 cm、高40 cm的水迷宮，將其分為完全相同的4個象限，用遮光布圍擋起來并在遮光布和水迷宮內壁貼上不同的標志圖案，以便小鼠學習記憶．水面下的隱藏平臺直徑為10 cm，將其放在任意一個象限，在水迷宮中注水使水面高于平臺1.0～1.5 cm，向水中倒入100～150 g鈦白粉，使水呈不透明狀態(tài)．本實驗分為適應期、訓練期和檢測期．實驗時將水加熱并維持在22～25 ℃．適應期1 d，將小鼠從任意位置面壁放入水中，使其自由游泳，找到平臺后讓小鼠在平臺上停留15 s，適應平臺安全區(qū)，若60 s小鼠仍未找到平臺，則用木棍將小鼠引導上平臺，并讓其停留15 s．訓練期5 d，每天進行4次訓練，將小鼠從非平臺象限面壁放入水中，讓其尋找平臺，記錄小鼠的逃逸潛伏期(到達平臺所需時間)，60 s為最大逃逸潛伏期，小鼠60 s內未找到平臺則用木棍將其引導上平臺，每次訓練間隔15～20 min．檢測期1 d，移除平臺，將小鼠從目標象限的對側面壁放入水中，讓其自由游泳60 s，記錄逃逸潛伏期、目標象限的穿梭次數(shù)、在目標象限的停留時間作為分析指標．實驗流程如圖1所示．

圖1 實驗流程圖

1.4 統(tǒng)計方法

曠場實驗和Morris水迷宮實驗檢測期用獨立樣本t檢驗分析組間差異．Y迷宮單個臂水平與隨機水平33.3%對比使用單樣本t檢驗．Y迷宮3個臂之間的差異使用重復測量方差分析．首先進行整體分析，重復因子(組內因素)是臂，有3個水平，組間因素是藥，有2個水平．若組內因素出現(xiàn)顯著性，就進一步分析每一組的組內因素是否顯著，此時采用的也是重復測量方差分析，臂是主效應，主效應若是顯著，進一步使用Post-hoc分析臂之間的差異，主要看新異臂與其他臂之間的差異．Morris水迷宮訓練期采用的也是重復測量方差分析，重復因素為時間，有5個水平；組間因素是藥，有2個水平．若組內出現(xiàn)顯著性，就進一步分析每一組的組內因素是否顯著．分析統(tǒng)計的軟件為SPSS V10.0，作圖軟件為GraphPad Prism7.0．“*”表示有顯著差異(0.01≤P<0.05)，“**”表示有極顯著差異(0.001≤P<0.01)，“***”表示有非常顯著差異(P<0.001)．Y迷宮相關圖中，“^”表示與隨機水平33.3%之間有差異．圖中所有誤差線值均為標準誤．

2 實驗結果

2.1 PTX對小鼠探究行為和緊張度的影響

曠場實驗結果顯示，雌性小鼠及雄性小鼠的活動水平和探索行為無差異，表現(xiàn)在小鼠于曠場中的總運動距離(雌性：t(8)=-0.405，P>0.05；雄性：t(17)=1.51，P>0.05)(圖2(a))、直立次數(shù)(雌性：t(8)=1.516，P>0.05；雄性：t(17)=1.868，P>0.05)(圖2(b))無顯著性差異，即PTX對小鼠的運動行為能力無影響．但PTX顯著降低了雄性小鼠在曠場中心區(qū)的停留時間(雄性：t(17)=2.954，P<0.01)(圖2(e))，即增加了雄性小鼠的焦慮行為．

2.2 PTX對小鼠空間識別記憶能力的影響

Y迷宮實驗結果顯示，PTX對小鼠的運動行為能力無影響．表現(xiàn)在PTX不影響小鼠在3個臂的總穿梭次數(shù)(雌性：t(8)=0，P>0.05；雄性：t(17)=0.769，P>0.05)(圖3(d))．且能夠顯著增加雌性小鼠的空間識別記憶能力，表現(xiàn)在雌性PTX組在新異臂的探索時間(t(4)=4.328，P<0.05^)及探索次數(shù)(t(4)=6.509，P<0.01^^)相對于隨機水平33.3%有顯著性差異(圖3(a)、(b))，雌性生理鹽水組與隨機水平33.3%有差異(t(4)=3.208，P<0.05^)，說明雌性中年小鼠具有識別能力，但雄性生理鹽水組與隨機水平33.3%無差異，說明其已經有損傷．PTX組可增強雌性小鼠的這項差異，使其與其他兩個臂之間也有顯著性差異．PTX對雌性小鼠記憶的增強還表現(xiàn)在雌性PTX組在新異臂的探索時間(雌性：臂，F(xiàn)(2，16)=14.068，P<0.001(Post-hoc：生理鹽水，F(xiàn)(2，8)=3.764，P>0.05；PTX，F(xiàn)(2，8)=11.069，P<0.01)；雄性：臂，F(xiàn)(2，34)=2.203，P>0.05)和探索次數(shù)(雌性：臂，F(xiàn)(2，16)=9.12，P<0.01(Post-hoc：生理鹽水，F(xiàn)(2，8)=2.675，P>0.05；PTX，F(xiàn)(2，8)=28.921，P<0.001)；雄性：臂，F(xiàn)(2，34)=1.619，P>0.05)與第三臂之間有顯著差異(圖3(a)、(b))．

2.3 PTX對小鼠空間學習記憶能力的影響

Morris水迷宮實驗結果顯示，PTX不影響小鼠的游泳速度(雌性：t(8)=-0.219，P>0.05；雄性：t(17)=-0.023，P>0.05)(圖4(d))，即不影響小鼠的運動能力．PTX對小鼠的學習能力無影響(時間，雌性：F(4，32)=2.394，P>0.05；雄性：F(4，68)=2.297，P>0.05)(圖4(a))，但其增強了雌性小鼠的記憶能力，表現(xiàn)在雌性PTX組檢測期小鼠逃逸潛伏期的縮短(t(8)=4.226，P<0.01)和目標象限穿梭次數(shù)的增加(t(8)=-3.025，P<0.05)(圖4(b)、(c))．

2.4 長期注射PTX對小鼠空間識別記憶能力的影響

Y迷宮實驗結果顯示，長期注射PTX影響了雄性小鼠的運動能力，使其活動性降低，表現(xiàn)在雄性小鼠于Y迷宮中在3個臂的總探索次數(shù)的減少(雌性：t(8)=0.884，P>0.05；雄性：t(17)=3.226，P<0.01)(圖5(d))．同時也顯著增加了雌雄小鼠的空間識別記憶能力，表現(xiàn)在雌雄小鼠PTX組在新異臂的探索距離百分比相對于隨機水平33.3%有顯著性變化(雌性，PTX：t(4)=4.055，P<0.05^；雄性，PTX：t(8)=2.654，P<0.05^)(圖5(a)、(c))，且PTX組在新異臂的探索距離與其他兩個臂之間有顯著性差異(雌性：臂，F(xiàn)(2，16)=7.695，P<0.01(Post-hoc：生理鹽水，F(xiàn)(2，8)=2.762，P>0.05；PTX，F(xiàn)(2，8)=14.122，P<0.01)；雄性：臂，F(xiàn)(2，34)=7.480，P<0.01(Post-hoc：生理鹽水，F(xiàn)(2，18)=2.597，P>0.05；PTX，F(xiàn)(2，16)=4.723，P<0.05))．

3 實驗結果討論

當前社會的醫(yī)療水平逐漸增強，人類的壽命也得到了有效的延長，這便加劇了社會的老齡化，各種老年相關疾病如阿爾茲海默病的患病率呈上升趨勢，這些疾病往往伴隨著學習記憶能力的下降，不僅降低了老年人的生活質量，也造成了老齡化家庭的沉重負擔．現(xiàn)代醫(yī)學仍未找到能有效增強衰老認知障礙人群學習記憶能力的治療方法，因而實現(xiàn)健康老齡化，延緩或避免老年相關疾病的發(fā)生是目前全人類的共同愿望．

GABA是由GABA神經元釋放并可與GABAA和GABAB受體特異性結合的抑制性神經遞質，目前已有多種GABA系統(tǒng)藥物被證明對學習記憶有積極影響，如GABAA激動劑毒蠅蕈醇(muscimol)[8]、GABAA拮抗劑荷包牡丹堿(bicuculline)[8]、GABAB激動劑巴氯芬(baclofen)[9-10，17]、GABAB拮抗劑CGP35348[18]等均可以改善認知缺陷大小鼠的學習記憶損傷．GABAA受體是控制氯離子通道的離子型受體，是一種大分子蛋白質，主要在外周和中樞神經系統(tǒng)中表達，包含GABA、印防己毒素、巴比妥酸鹽及麻醉類固醇的特異性結合位點[19]．GABAA受體通常是由α-、β-和γ-亞基組合而成，最常見的組合形式為α1β2γ3．而GABAA受體的β亞基被認為是PTX位點的必要條件[20]．PTX作為GABA系統(tǒng)拮抗劑，經常被用于研究其與學習記憶能力的關系．本研究以此為基礎，研究PTX的作用效果，檢測了PTX對中年雌雄小鼠焦慮水平及學習記憶能力的影響，結果發(fā)現(xiàn)，PTX對雌雄小鼠的焦慮行為和學習記憶能力的影響存在明顯的性別差異．PTX能有效增強雌性小鼠的空間識別學習記憶能力，但也增加雄性小鼠的焦慮行為，長期注射PTX也能提高雄性小鼠的學習記憶能力，但會影響小鼠的自發(fā)性探索活動力．

此前已有研究通過高架十字迷宮(elevated plus maze，EPM)證明，PTX可以增加小鼠的焦慮行為[21]．由于EPM處于高空，會使小鼠本身的恐懼增加，產生焦慮，故本文采用開放性曠場實驗來檢測小鼠的焦慮行為，這樣可以減少小鼠本身的恐懼效應，同時也可以檢測PTX急性注射對小鼠活動力的影響．本文得出的結果與其相一致，PTX顯著增加了雄性小鼠的焦慮行為，但急性注射PTX不會影響小鼠的活動能力．

在檢測空間識別記憶方面，本文采取了自發(fā)狀態(tài)的Y迷宮實驗，該迷宮由嚙齒類動物與生俱來的好奇心驅動小鼠探索從未訪問過的區(qū)域，同時避免了獎賞和懲罰制度對小鼠空間識別記憶的影響，是評價小鼠短期記憶能力的重要范式[22]．在第一次注射PTX后，進行了間隔1 h的Y迷宮實驗，發(fā)現(xiàn)PTX能夠顯著增加雌性小鼠的空間識別記憶能力，但對雄性小鼠的記憶能力無影響．由于使用的小鼠年齡較大，已經出現(xiàn)了記憶損傷，對照組小鼠也不能很好地識別新異臂，故降低了Y迷宮的間隔期．在其余行為學實驗進行完后，又進行了一次間隔30 min的Y迷宮實驗，同時也可以評價長期注射PTX對小鼠空間識別記憶能力的影響，發(fā)現(xiàn)長期注射PTX可以顯著增加雌雄小鼠的空間識別記憶能力，也影響了雄性小鼠的探索能力．

在檢測長期空間學習記憶方面，采取了具有強迫游泳性質的Morris水迷宮實驗[23]，依靠水迷宮內壁及其周圍遮光簾上的遠端線索，小鼠從起始位置開始定位水下逃生平臺，通過重復實驗評估其空間學習記憶水平，水迷宮實驗可以有效減少氣味追蹤的干擾．進行了為期5 d的水迷宮訓練，并未發(fā)現(xiàn)學習上的差異，但在記憶能力的檢測上發(fā)現(xiàn)，PTX可以增加雌性小鼠的記憶能力且小鼠的游泳速度并未受到影響．

4 結 語

本研究表明GABAA受體在學習記憶過程中起著重要作用．GABAA系統(tǒng)拮抗劑對小鼠的影響具有性別差異．在行為學水平上發(fā)現(xiàn)，PTX能有效增強雌性小鼠的短期和長期記憶能力，長期注射PTX也能增強雄性小鼠的短期記憶能力，但PTX會增加雄性小鼠的焦慮行為，且影響其活動水平．這可能是PTX的劑量依賴性造成的，因為PTX對雌性小鼠的半數(shù)有效劑量(ED50)比雄性小鼠大[13]，除此之外，性腺激素也會影響PTX的敏感性[24]．未來將進一步尋找PTX改善雌雄小鼠記憶能力的最佳劑量及注射周期，并在神經電生理水平上探究檢測PTX對小鼠興奮/抑制平衡的影響．在后續(xù)研究探討PTX認知干預的機制時需要更加注意該藥作用的性別差異．