蛇床子素對髓核致神經根炎性痛大鼠脊髓背角Wnt3a/β-catenin信號通路的影響

楊琳，張嘉明，何仲賢，劉苑婷，魯楊，孫來保，江偉航

（1.廣州市番禺區中心醫院，廣東廣州511400；2.中山大學附屬第六醫院，廣東廣州510655；3.中山大學附屬第一醫院，廣東廣州 510080）

椎間盤突出髓核的生化致炎特性和對脊髓背角神經元及膠質細胞的作用是引發周圍神經根炎癥反應并引起腰腿痛的重要原因[1]。蛇床子素（osthole）又名甲氧基歐芹酚（化學結構見圖1），具有抗炎鎮痛作用。本課題組前期研究發現，在髓核致炎神經根痛大鼠硬膜外腔注射蛇床子素可抑制炎性痛的外周及中樞敏化，從而達到緩解痛覺過敏的作用[2-4]，但其具體作用機制尚不完全明確。脊髓背角神經元及膠質細胞中Wnt3a/β-catenin信號通路的激活是導致炎性疼痛和神經病理性疼痛的關鍵因素之一[5]。因此，本研究觀察蛇床子素對Wnt3a/β-catenin信號通路及相關分子的影響，進一步探討蛇床子素的鎮痛作用及機制，以期為其臨床應用于腰腿痛的治療提供新的實驗依據，現將研究結果報道如下。

圖1 蛇床子素的化學結構Figure 1 Chemical structure of osthole

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級成年雄性SD大鼠，體質量200～280 g，由中山大學動物實驗中心提供，動物生產許可證號：SCXK（粵）2016-0029。實驗單位為中山大學附屬第一醫院，動物使用許可證號：SYXK（粵）2020-0233。飼養環境：分籠飼養，自由進食，室溫（23±2）℃，相對濕度55%～65%，維持12 h循環晝夜節律。本研究動物實驗方案已經中山大學附屬第一醫院倫理委員會審核通過，倫審號：[2010]94號。本實驗所有過程步驟均嚴格按照中山大學動物實驗中心的操作相關指南進行。

1.2 藥物、試劑與儀器蛇床子素（C15H16O3，MW=244.29，美國Selleckchem公司生產，批號：S2337）。10%二甲基亞砜（DMSO，美國Sigma公司）；兔抗Wnt3a抗體、兔抗β-catenin抗體、兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體、山羊抗兔IgG、Alex-488標記的驢抗兔IgG、Alex-594標記的驢抗兔IgG（美國Abcam公司）；白細胞介素18（IL-18）酶聯免疫吸附分析（ELISA）試劑盒、腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA試劑盒（深訓欣博盛生物科技公司）；逆轉錄試劑盒、聚合酶鏈反應（PCR）擴增試劑盒（TaKaRa公司）。Von Frey纖毛測痛儀（美國Stoelting公司）；熱痛覺測試儀（美國IITC Life Science公司）；醫用顯微手術電鉆（XSZ-G-1型，上海光電技術有限公司）；倒置熒光顯微鏡（美國Leica公司）；電泳及轉膜系統（美國Bio-Rad公司）；PE-10導管（英國Smiths Medical公司）。

1.3 分組與處理將54只大鼠隨機均分為3組，即假手術組、模型組、治療組，每組18只。除假手術組外，模型組和治療組構建髓核致炎模型。術后2 d，治療組經硬膜外導管給予20 g·L-1蛇床子素50 μL（給藥劑量參考文獻研究[4，6]），模型組和假手術組經硬膜外導管給予100 mL·L-1的DMSO 50 μL。所有大鼠術前3、1 d及術后1、3、7、10、14 d均進行疼痛行為學指標50%機械性撤足閾值（MWT）和熱傷害性撤足潛伏期（TWL）測定，于術后7 d（即硬膜外給藥后第5天）取術側脊髓背角組織進行指標檢測。

1.4 造模方法參考Sasaki等[7]的方法建立大鼠髓核致炎模型：用10 g/L戊巴比妥鈉麻醉大鼠后俯臥位固定在動物用手術操作臺上，背部區域備皮后消毒鋪巾，以兩側髂嵴點連線中點切開約2.5 cm。逐層暴露組織肌肉直至看清L4～L5半椎板。取醫用顯微手術電鉆在半椎板中央鉆孔，暴露出左側背根神經結。將PE-10導管經孔向頭側輕柔置入（3～4 mm），并將PE-10導管固定好。導管的另一端經皮下從大鼠兩耳之間引出約3 cm并固定，回抽確認無血和腦脊液后，用灼燒法封閉導管。模型組和治療組從尾椎取出約0.4 mg髓核組織，放置于已經暴露好的背根神經結表面，而假手術組取出大鼠尾部自體髓核，但不放置自體髓核組織于背根神經上，其余步驟相同。逐層縫合傷口，并用抗感染的聚維酮碘藥膏擦拭皮膚傷口，所有手術操作后的大鼠均單籠飼養。術后將撕咬肢體、下肢運動功能障礙和大小便失禁的大鼠剔除，并通過導管注射2%利多卡因10 μL，觀察30 s內是否出現雙后肢麻痹驗證導管位置。

1.5 觀察指標與方法

1.5.1 機械性撤足閾值（MWT）測定測試前，將大鼠放置于有機透明玻璃測試盒內至少30 min，使動物習慣于測試環境。待其安靜后，使用直徑約0.2 mm均勻尖端圓柱形探針垂直刺激大鼠患側后爪的足底，力度由弱至強，當大鼠患側后肢出現迅速撤回、抬起或舔足等躲避應激行為時，記錄該壓力數值。每只大鼠刺激5次，通過5個讀數的平均值計算每只動物的50%MWT。

1.5.2 熱傷害性撤足潛伏期（TWL）測定測試前，將大鼠放入有機透明玻璃盒子內約15 min以適應環境，并置放于裝有溫度控制的透明玻璃板上（厚度為3 mm）。將輻射熱源聚焦在大鼠患側后爪足底皮膚上，當后爪出現迅速撤回、抬起或舔足等躲避應激行為時，關閉熱源開關，并記錄時間數值。每只大鼠患側后足底以5 min的時間間隔測試熱刺激3次，取平均值作為TWL。

1.5.3 定量聚合酶鏈反應（Q-PCR）法檢測脊髓背角組織Wnt3a、β-catenin mRNA表達水平采用20 g/L戊巴比妥鈉（60～80 mg/kg）深麻醉大鼠后，在冰面上迅速取出大鼠L5節段脊髓背角組織，按TRIzol抽提法提取脊髓背角總RNA，測定RNA濃度和純度。以RNA為模板應用逆轉錄試劑盒獲得cDNA，進行PCR擴增。引物序列見表1。反應條件：95℃變性30 s，55℃復性30 s，72℃延伸1 min，變性到延伸總共35個循環。計算每個樣本的循環閾值（Ct值），運用Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀配套的Bio-Rad CFX Manager Software 1.6數據分析軟件進行分析，采用2-ΔΔCt法計算Wnt3a和β-catenin的mRNA相對表達量。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences

1.5.4 Western Blot法檢測脊髓背角組織Wnt3a、β-catenin蛋白表達水平將大鼠L5節段脊髓背角組織用顯微剪剪成小碎片，加入含有蛋白酶抑制劑的組織裂解液，依次進行超聲波勻漿、水浴及離心后取上清。選用10%十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE），用Bio-Rad半干轉儀將蛋白轉至聚偏氟乙烯（PVDF）膜后用50 g/L脫脂牛奶室溫封閉2 h，分別與Wnt3a一抗（體積比1∶1 000稀釋），β-catenin一抗（體積比1∶1 000稀釋），GAPDH一抗（體積比1∶1 000稀釋）置于4℃冰箱孵育過夜，然后與山羊抗兔二抗（體積比1∶500稀釋）室溫下孵育2 h。將PVDF膜與增強化學發光（ECL）試劑反應后即刻顯影，用ImageJ 6.0軟件分析PVDF膜條帶的灰度值。實驗重復3次，將各樣品中Wnt3a和β-catenin灰度值分別與相應內參GAPDH灰度值相除作為相應目的蛋白的相對表達量。

1.5.5 免疫熒光染色法檢測脊髓背角組織Wnt3a、β-catenin蛋白表達水平取出大鼠L5節段脊髓背角組織，40 g/L多聚甲醛固定后，進行脫水及冰凍切片（厚度為20 μm）。然后將冰凍切片漂洗3次，每次10 min，再用含有5%（V/V）驢血清和0.3%TritonX-100的溶液均勻覆蓋組織，室溫封閉切片1 h。隨后用濾紙吸干封閉液，滴加對應的一抗，放入濕盒中4℃輕搖孵育過夜。次日取出切片于常溫復溫1 h并吸去一抗。漂洗3次，每次10 min。加入二抗，在避光及室溫條件下孵育1 h，再用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗3次，每次10 min。最后封片，在熒光顯微鏡下觀察，并采用CCD攝像頭拍攝圖像。

1.5.6 ELISA法檢測脊髓背角組織炎癥因子IL-18、TNF-α水平將大鼠L5節段脊髓背角組織剪成小碎片，加入含有蛋白酶抑制劑的組織裂解液。按100 μL/孔加入稀釋后的Cytokine Standard至標準品孔，然后各加入100 μL待測樣品至樣品孔，用Dilution Buffer R（1×）代替樣品和標準品，設置空白孔。封孔后避光搖床孵育1.5 h。甩除孔內液體，封孔后孵育90 min，再在每孔加入100 μL稀釋后的Streptavidin-HRP（1×），孵育30 min。最后于顯色后終止反應后的10 min內，置于450 nm波長處檢測吸光度，計算待測樣品的濃度。

1.6 統計方法采用SPSS 22.0統計軟件進行數據分析，采用GraphPad Prism 7.0軟件作圖。各組計量資料以均數±標準差（±s）表示。行為學數據結果，采用重復測量的方差分析，然后用Turkey Post Hoc Test法檢測組間差異或使用T檢驗進行組間差異比較分析。Western Blot、ELISA以及免疫熒光染色結果的數據比較則采用單因素方差分析（One-way ANOVA），2組間比較采用Student-test檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠機械痛閾值比較圖2結果顯示：與假手術組比較，模型組和治療組術后出現50%MWT下降及TWL潛伏期縮短（P＜0.05或P＜0.01），表明髓核致神經根性疼痛動物模型建立成功。治療組術后3 d出現50%MWT上升及TWL潛伏期延長，并持續到術后第14天，與模型組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。

圖2 各組大鼠機械性撤足閾值（MWT）變化（A）與熱傷害性撤足潛伏期（TWL）變化（B）比較（±s，n=6）Figure 2 Comparison of the change in mechanical withdrawal threshold（A）and the change in thermal withdrawal latency（B）among various groups of rats（±s，n=6）

2.2 各組大鼠脊髓背角中Wnt3a、β-catenin的mRNA表達比較圖3結果顯示：術后7 d，與假手術組比較，模型組大鼠脊髓背角Wnt3a、β-catenin的mRNA表達水平均顯著升高（P＜0.01）；而治療組Wnt3a、β-catenin的mRNA表達水平降低，與模型組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。

圖3 各組大鼠脊髓背角中Wnt3a、β-catenin的mRNA相對表達量比較（±s，n=6）Figure 3 Comparison of the relative mRNA expressions of Wnt3a and β-catenin in the spinal dorsal horn among various groups of rats（±s，n=6）

2.3 各組大鼠脊髓背角中Wnt3a、β-catenin的蛋白表達比較圖4結果顯示：術后7 d，與假手術組比較，模型組大鼠脊髓背角Wnt3a、β-catenin的蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.01）；而治療組Wnt3a、β-catenin的蛋白表達水平均明顯降低，與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖4 各組大鼠脊髓背角中Wnt3a、β-catenin的Western Blot電泳條帶（A）及其蛋白相對表達量（B）比較（±s，n=6）Figure 4 Comparison of Western Blot electrophoretic band of Wnt3a and β-catenin in the spinal dorsal horn（A）and their relative protein expressions（B）among various groups of rats（±s，n=6）

2.4 各組大鼠脊髓背角中Wnt3a、β-catenin的熒光蛋白表達比較圖5結果顯示：術后7 d，與假手術組比較，模型組大鼠脊髓背角組織Wnt3a、β-catenin的熒光蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.01）；而與模型組比較，治療組Wnt3、β-catenin的熒光蛋白表達水平均降低（P＜0.05）。

圖5 各組大鼠脊髓背角中Wnt3a、β-catenin的免疫熒光染色結果（A）（比例尺：50 μm）及其半定量（B）比較Figure 5 Comparison of immunofluorescence staining results of Wnt3a and β-catenin in the spinal dorsal horn（A）（Scale bar：50 μm）and their semi-quantification（B）among various groups of rats

2.5 各組大鼠脊髓背角中炎癥因子IL-18、TNF-α水平比較圖6結果顯示：術后7 d，與假手術組比較，模型組大鼠脊髓背角中炎癥因子IL-18、TNF-α水平均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，治療組大鼠脊髓背角IL-18、TNF-α水平均明顯降低（P＜0.05）。

圖6 各組大鼠脊髓背角炎癥因子IL-18（A）與TNF-α（B）水平比較（±s，n=6）Figure 6 Comparison of the levels of inflammatory factors IL-18（A）and TNF-α（B）in the spinal dorsal horn among various groups of rats（±s，n=6）

3 討論

腰腿痛屬于慢性疼痛疾病，其最常見的病因是腰椎間盤突出癥（lambar disc hemiation，LDH）[8-9]。腰椎間盤突出的髓核組織可作為抗原被人體的免疫系統識別，誘發自身免疫反應，導致炎性物質增加過度，引起神經根腫脹，加重腰腿疼痛的反應，而有效控制炎癥能夠明顯降低根性痛的發病率及嚴重程度，這正成為國內外腰腿痛研究的熱點與方向[10]。

Wnt是一種約40 kDa控制發育的分泌蛋白，其作用包括細胞轉運極化及遷移等，Wnt信號通路的異常與許多疾病的發生有關[11-12]。既往研究表明，該通路參與了神經免疫及炎癥系統疾病的病理生理過程[13-14]。Wnt3a/β-catenin是經典的Wnt信號通路，Wnt3a為激活劑，在神經病理性疼痛中，Wnt3a蛋白在脊髓水平顯著地增加，其受體在脊髓背角神經元上表達增多，進而引起Wnt信號通路下游分子β-catenin長時程地表達。β-catenin是影響神經發育的重要分子[15]。近期研究發現，β-catenin可干預白細胞介素18（IL-18）及腫瘤壞死因子α（TNF-α）等重要炎癥因子的形成和釋放[16]。在坐骨神經壓迫和骨癌痛2種疼痛模型中，Wnt信號通路在脊髓背角中被激活，通過刺激炎癥物質的產生，使實驗動物的疼痛行為學發生相關改變[17]。課題組前期研究發現，髓核致炎模型大鼠術后脊髓背角中出現Wnt3a、β-catenin mRNA及蛋白表達明顯增強，而硬膜外給予Wnt3a抑制劑后則出現50%MWT、TWL的 上 升 和Wnt3a、β-catenin mRNA及蛋白表達的下降，提示Wnt3a/β-catenin信號通路可能參與了髓核致神經根炎性痛的發生發展。與前期研究結果相符，本研究結果亦顯示，模型組在術后1 d即出現50%MWT及TWL的持續下降，術后7 d模型組脊髓背角中Wnt3a、βcatenin mRNA和蛋白的表達及炎癥因子IL-18、TNF-α的含量較假手術組明顯升高，表明異常活化的Wnt信號可能通過激活下游通路，進而上調炎性因子的表達而發揮作用，誘發大鼠的痛覺過敏。

蛇床子素是獨活寄生湯的主要藥用活性成分，其對椎間盤突出癥導致的下腰痛和坐骨神經痛有顯著療效。研究發現，蛇床子素除了具有良好的抗心律失常、抗骨質疏松、抗腫瘤等作用外，其抗炎鎮痛作用也非常突出。在HIV gp120誘發的周圍神經病理痛模型中，蛇床子素可通過抑制神經元P2X3R等相關受體，抑制炎性反應及疼痛的程度[18]。更有研究發現，蛇床子素可在不同時期通過下調組織炎癥反應對神經系統發揮保護作用[19-20]。本課題組前期研究發現，在髓核致炎大鼠模型中，通過硬膜外腔注射蛇床子素可明顯提高大鼠50%MWT和TWL，即減輕了大鼠的機械痛敏及熱痛敏[6，21-23]。但蛇床子素是否通過干預Wnt3a/β-catenin信號通路達到鎮痛效應尚不明確。本研究結果顯示，治療組大鼠術后2 d經硬膜外腔給予蛇床子素后，在術后3 d出現50%MWT上升及TWL潛伏期延長，術后7 d脊髓背角Wnt3a、β-catenin mRNA及蛋白的表達明顯下調，IL-18和TNF-α的表達也明顯下降，與模型組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。因此，認為蛇床子素干預髓核致炎模型后，可以通過抑制脊髓背角中Wnt3a/β-catenin信號通路活化，下調炎性因子表達，從而減輕疼痛的程度。

綜上所述，Wnt3a/β-catenin信號通路在脊髓背角參與了髓核致炎大鼠神經根性疼痛的發展過程，蛇床子素可通過下調Wnt3a神經遞質的釋放，阻斷β-catenin信號通路的活化，進而抑制IL-18和TNF-α的表達，緩解炎性疼痛的中樞敏化，起到抗炎鎮痛的作用。