人參皂苷Rg3通過調節AMPK/mTOR信號通路提高骨質疏松老年大鼠骨密度及骨代謝

馬偉鳳，王亮，馬彥巧，謝媛媛，王天天，湯玉萌，陳文文，王云

（1.中國人民解放軍總醫院第八醫學中心老年醫學科，北京100091；2.北京朝陽醫院疼痛科，北京 100020）

骨質疏松癥（osteoporosis，OP）是一類以骨微結構退化、骨量減少和骨密度下降為特征的代謝性疾病，是老年人的常見病[1]。據報道，在我國50歲以上的中老年人OP的發病率約為30%[2]。由于OP發生的骨折病例不斷增加，其高致殘率和致死率嚴重影響患者的生活質量。目前，臨床常用的OP治療藥物為雙磷酸鹽、甲狀旁腺激素片和鈣劑等，但因其不同程度的耐藥性與不良反應，亟需尋找新的藥物改善現狀[3]。骨質疏松癥歸屬于中醫學“骨痿”“骨枯”“虛勞”范疇。人參為五加科植物人參Panax ginsengC.A.Mey.的干燥根和根莖，《神農本草經》記載：“人參，味甘，微寒。主補五臟，安精神，定魂魄，止驚悸，除邪氣，明目，開心益智。久服，輕身延年。”崔燎等[4]通過動物實驗發現，人參具有顯著地防治骨質疏松的藥理作用，提出人參可作為雌激素的代用品用于臨床各種骨質疏松癥的預防和治療，申請了國家發明專利并獲得授權。人參皂苷Rg3是提取自人參的有效活性成分，具有抗腫瘤、抗氧化活性和抗衰老等多種藥理作用[5-10]。既往有研究顯示，人參皂苷Rg3具有調控骨代謝，促進骨重塑的作用[11]。本研究擬通過對比OP老年大鼠與青年大鼠模型，探討人參皂苷Rg3對OP老年大鼠骨代謝的影響及其可能的作用機制，旨在為人參臨床防治OP及相關藥物開發提供參考依據，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物10只SPF級3月齡雌性SD大鼠，體質量220～250 g，30只23月齡SPF級雌性SD大鼠，體質量550～600 g，購自浙江維通利華實驗動物技術有限公司，動物質量合格證號：SCXK（浙）2019-0001。所有大鼠飼養于SPF級環境7 d，環境條件設置為溫度20～24℃，濕度（50±10）%，光暗周期為12 h/12 h。普通飼料與清潔水源充足供應。本實驗方案已經中國人民解放軍總醫院第八醫學中心倫理委員會批準，倫理號：No20211028KY。

1.2 藥物、試劑與儀器人參皂苷Rg3（分子式：C42H72O13，分子量：785.01328），分子結構如圖1所示，由上海西格瑪奧德里奇貿易有限公司生產，批號：SML0184。Ⅰ型前膠原羧基端前肽（PICP）和骨鈣素（BGP）酶聯免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（上海博湖生物科技有限公司）；兔抗βactin多克隆抗體、兔抗大鼠腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）多克隆抗體、兔抗大鼠哺乳動物雷帕霉菌靶蛋白（mTOR）多克隆抗體、兔抗大鼠磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（p-AMPK）多克隆抗體、兔抗大鼠磷酸化哺乳動物雷帕霉菌靶蛋白（p-mTOR）多克隆抗體、兔抗大鼠哺乳動物ATG6同源蛋白（Beclin-1）多克隆抗體和兔抗大鼠微管相關蛋白1輕鏈3（LC3-Ⅱ）多克隆抗體、山羊抗兔IgG（北京索萊寶科技有限公司）。viva CT40型micro-CT儀器（瑞士SCANCO Medical AG公司）；DYY-7C型電泳儀（北京六一儀器廠）；ELX-800型多功能酶標儀（美國Bio-Tek公司）。

圖1 人參皂苷Rg3分子結構Figure 1 Molecular structure of Ginsenoside Rg3

1.3 分組與給藥將30只23月齡大鼠隨機分為模型組及人參皂苷Rg3低、高劑量組，每組10只，另將10只3月齡大鼠設為對照組。參照文獻研究[12-13]，人參皂苷Rg3低、高劑量組大鼠給予灌胃10、20 mg/kg人參皂苷Rg3混懸液，對照組及模型組給予灌胃等體積生理鹽水，每日1次，連續12周。

1.4 樣本采集末次給藥后大鼠禁食12 h，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，仰臥位固定于手術臺上，腹主動脈采集血液，分離血清，-20℃保存。采血結束后處死大鼠，剝離大鼠股骨，去除周圍肌肉等軟組織，剪去骨干兩端，露出骨髓腔，使用預冷的PBS溶液反復沖洗骨髓腔，并收集沖出的骨髓組織裝入無菌凍存管內，-80℃保存備用。取部分股骨沖洗后放入多聚甲醛溶液中進行脫鈣、固定。

1.5 觀察指標與方法

1.5.1 骨顯微參數檢測取大鼠股骨樣本，使用micro-CT掃描儀檢測各組大鼠股骨骨密度（bone mineral density，BMD）和骨體積分數（BV/TV）。儀器調試為分辨率：18 mm；源電流：385 μA；旋轉步驟：0.7。再選取股骨遠端干骺區域，檢測大鼠骨小梁數量（number of trabeculae bone，TB.N）、骨小梁厚度（trabecular bone thickness，TB.Th）和骨小梁分離度（bone trabecular separation，TB.Sp）。

1.5.2 ELISA法檢測骨代謝指標PICP、BGP水平取出血清與PICP和BGP ELISA試劑盒，平衡至室溫后嚴格按照試劑盒說明書檢測各組大鼠血清中骨代謝指標PICP和BGP水平。應用酶標儀于450 nm波長處測定各組樣品吸光度值，根據標準曲線計算樣本濃度。

1.5.3 HE染色法觀察股骨組織病理變化將已完成脫鈣的股骨組織取出，梯度酒精溶液、二甲苯溶液脫水透明，使用石蠟進行包埋，待蠟液完全凝固時修整蠟塊，應用組織切片機制成5 μm薄片。將組織切片再次浸入二甲苯、梯度濃度酒精溶液脫蠟復水。浸入蘇木素染液5 min，流水沖洗，鹽酸酒精溶液分化5 s，氨水返藍，伊紅染液染色1 min，清水沖洗，常規脫水透明，滴加中性樹膠封存固片。于光學顯微鏡下觀察股骨組織病理變化并進行分析。

1.5.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）法檢測股骨骨髓組織AMPK、mTOR mRNA表達TRIzol法提取股骨骨髓組織總RNA，檢測其濃度與純度后使用逆轉錄試劑盒合成cDNA。按照試劑盒說明書配制反應體系（20 μL）：上、下游引物各0.4 μL，SYBR Premix Ex Tap 10 μL，cDNA 1 μL，RNase free ddH2O 8.2 μL。置于PCR儀器設置參數：95℃30 s，95℃5 s，60℃30 s，收集熒光信號，進行40個循環。以β-actin為內參，采用2-△△CT法計算各樣本基因mRNA相對表達水平。引物序列見表1。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences

1.5.5 Western Blot法檢測股骨骨髓組織中p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR、Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達提前取出裂解液室溫下融化，取適量股骨骨髓組織置于研缽內，加入裂解液冰上靜置，取上清液后用BCA蛋白試劑盒測定蛋白含量。組裝電泳裝置，配制聚丙烯酰胺凝膠，進行電泳，恒壓80 V電泳2.5 h。300 mA將蛋白轉至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。TBST緩沖液加入脫脂牛奶制備封閉液，將膜加入封閉液室溫封閉2 h，再分別加入p-AMPK、p-mTOR、Beclin-1和LC3-Ⅱ等一抗（均體積比1∶1 000稀釋），4℃孵育過夜。浸入TBST緩沖液中洗膜5 min，反復4次，加入二抗（體積比1∶5 000稀釋），室溫孵育60 min。洗膜后，加入增強化學發光（ECL）試劑顯色后，置于凝膠成像系統上進行成像。以β-actin為內參，采用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白與內參灰度值比值作為目的蛋白的相對表達量。

1.6 統計方法采用SPSS 23.0統計軟件分析數據，計量數據以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠骨密度比較表2結果顯示：與對照組比較，模型組大鼠股骨BMD和BV/TV水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，人參皂苷Rg3低、高劑量組大鼠股骨BMD和BV/TV水平升高（P＜0.05）；與人參皂苷Rg3低劑量組比較，人參皂苷Rg3高劑量組大鼠股骨BMD和BV/TV水平升高（P＜0.05）。

表2 各組大鼠骨密度比較Table 2 Comparison of bone mineral density among various groups of rats （±s）

表2 各組大鼠骨密度比較Table 2 Comparison of bone mineral density among various groups of rats （±s）

注：①P＜0.05，與對照組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與人參皂苷Rg3低劑量組比較

組別對照組模型組人參皂苷Rg3低劑量組人參皂苷Rg3高劑量組鼠數/只10 10 10 10 BMD/（g·cm-2）0.39±0.05 0.22±0.02①0.29±0.03②0.37±0.03②③（BV/TV）值/%72.45±4.04 46.71±3.24①54.19±3.68②68.23±3.90②③

2.2 各組大鼠骨形態學指標比較表3結果顯示：與對照組比較，模型組大鼠TB.N和TB.Th水平降低，TB.Sp水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，人參皂苷Rg3低、高劑量組大鼠TB.N和TB.Th水平升高，TB.Sp水平降低（P＜0.05）；與人參皂苷Rg3低劑量組比較，人參皂苷Rg3高劑量組大鼠TB.N和TB.Th水平升高，TB.Sp水平降低（P＜0.05）。

表3 各組大鼠骨形態學指標比較Table 3 Comparison of bone morphological indexes among various groups of rats （±s）

表3 各組大鼠骨形態學指標比較Table 3 Comparison of bone morphological indexes among various groups of rats （±s）

注：①P＜0.05，與對照組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與人參皂苷Rg3低劑量組比較

組別對照組模型組人參皂苷Rg3低劑量組人參皂苷Rg3高劑量組鼠數/只10 10 10 10 TB.N/（個·mm-2）5.40±0.37 3.07±0.26①3.82±0.21②4.69±0.28②③TB.Th/μm 78.44±4.28 46.84±2.62①59.55±2.91②72.53±3.52②③TB.Sp/mm 0.24±0.03 0.38±0.04①0.31±0.03②0.25±0.02②③

2.3 各組大鼠骨代謝指標水平比較表4結果顯示：與對照組比較，模型組大鼠血清PICP水平升高，BGP水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，人參皂苷Rg3低、高劑量組大鼠血清PICP水平降低，BGP水平升高（P＜0.05）；與人參皂苷Rg3低劑量組比較，人參皂苷Rg3高劑量組大鼠血清PICP水平降低，BGP水平升高（P＜0.05）。

表4 各組大鼠骨代謝指標水平比較Table 4 Comparison of levels of bone metabolic markers among various groups of rats（±s，ng·mL-1）

表4 各組大鼠骨代謝指標水平比較Table 4 Comparison of levels of bone metabolic markers among various groups of rats（±s，ng·mL-1）

注：①P＜0.05，與對照組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與人參皂苷Rg3低劑量組比較

組別對照組模型組人參皂苷Rg3低劑量組人參皂苷Rg3高劑量組鼠數/只10 10 10 10 PICP 41.82±3.56 68.36±5.19①52.09±4.17②44.29±3.12②③BGP 13.93±1.35 6.79±0.58①9.80±0.90②12.85±1.31②③

2.4 各組大鼠股骨組織病理學表現比較圖2結果顯示：與對照組比較，模型組大鼠股骨組織干骺端骨小梁數量明顯減少，結構破壞嚴重，骨小梁稀疏、排列紊亂，骨小梁變薄，間隙變寬，骨髓腔內空洞較多；人參皂苷Rg3低、高劑量組大鼠股骨組織可見骨小梁數量明顯增多，結構逐漸恢復正常，骨小梁排列緊密，骨小梁變厚，間隙恢復正常，且骨小梁之間的連接在一定程度上得到改善。

圖2 各組大鼠股骨組織病理學表現比較（HE染色，×10）Figure 2 HE staining results of femoral tissue in each group of rats（HE staining，×10）

2.5 各組大鼠股骨骨髓組織AMPK和mTOR mRNA表達比較表5結果顯示：與對照組比較，模型組大鼠股骨骨髓組織中AMPK mRNA表達水平降低，mTOR mRNA表達水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，人參皂苷Rg3低、高劑量組大鼠AMPK mRNA表達水平升高，mTOR mRNA表達水平降低（P＜0.05）；與人參皂苷Rg3低劑量組比較，人參皂苷Rg3高劑量組大鼠AMPK mRNA表達水平升高，mTOR mRNA表達水平降低（P＜0.05）。

表5 各組大鼠股骨骨髓組織AMPK和mTOR mRNA表達水平比較Table 5 Comparison of mRNA expression levels of AMPK and mTOR in femoral bone marrow tissue among various groups of rats （±s）

表5 各組大鼠股骨骨髓組織AMPK和mTOR mRNA表達水平比較Table 5 Comparison of mRNA expression levels of AMPK and mTOR in femoral bone marrow tissue among various groups of rats （±s）

注：①P＜0.05，與對照組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與人參皂苷Rg3低劑量組比較

組別對照組模型組人參皂苷Rg3低劑量組人參皂苷Rg3高劑量組鼠數/只10 10 10 10 AMPK mRNA相對表達量1.14±0.12 0.37±0.04①0.63±0.06②0.85±0.09②③mTOR mRNA相對表達量0.28±0.02 0.95±0.10①0.59±0.05②0.33±0.02②③

2.6 各組大鼠股骨骨髓組織AMPK和mTOR活化水平比較表6、圖3結果顯示：與對照組比較，模型組大鼠股骨骨髓組織中p-AMPK/AMPK比值降低，p-mTOR/mTOR比值升高（P＜0.05）；與模型組比較，人參皂苷Rg3低、高劑量組大鼠p-AMPK/AMPK比值升高，p-mTOR/mTOR比值降低（P＜0.05）；與人參皂苷Rg3低劑量組比較，人參皂苷Rg3高劑量組大鼠p-AMPK/AMPK比值升高，p-mTOR/mTOR比值降低（P＜0.05）。

表6 各組大鼠股骨骨髓組織p-AMPK/AMPK、p-mTOR/mTOR比值比較Table 6 Comparison of ratios of p-AMPK/AMPK and p-mTOR/mTOR in femoral bone marrow tissue among various groups of rats （±s）

表6 各組大鼠股骨骨髓組織p-AMPK/AMPK、p-mTOR/mTOR比值比較Table 6 Comparison of ratios of p-AMPK/AMPK and p-mTOR/mTOR in femoral bone marrow tissue among various groups of rats （±s）

注：①P＜0.05，與對照組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與人參皂苷Rg3低劑量組比較

組別對照組模型組人參皂苷Rg3低劑量組人參皂苷Rg3高劑量組鼠數/只10 10 10 10 p-AMPK/AMPK比值0.87±0.07 0.31±0.04①0.61±0.07②0.85±0.09②③p-mTOR/mTOR比值0.26±0.02 0.89±0.09①0.56±0.06②0.31±0.03②③

圖3 股骨骨髓組織AMPK和mTOR及其磷酸化蛋白Western Blot電泳圖Figure 3 Western Blot electrophoretogram of AMPK and mTOR as well as their phosphorylated proteins in femoral bone marrow tissue

2.7 各組大鼠股骨骨髓組織自噬蛋白Beclin-1和LC3-Ⅱ水平比較表7、圖4結果顯示：與對照組比較，模型組大鼠股骨骨髓組織中Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，人參皂苷Rg3低、高劑量組大鼠Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達水平升高（P＜0.05）；與人參皂苷Rg3低劑量組比較，人參皂苷Rg3高劑量組大鼠Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達水平升高（P＜0.05）。

圖4 股骨骨髓組織Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白Western Blot電泳圖Figure 4 Western Blot electrophoretogram of Beclin-1 and LC3-Ⅱproteins in femoral bone marrow

表7 各組大鼠股骨骨髓組織自噬蛋白Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達水平比較Table 7 Comparison of the protein expression levels of the autophagy proteins Beclin-1 and LC3-II in femoral bone marrow tissue among various groups of rats（±s）

表7 各組大鼠股骨骨髓組織自噬蛋白Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達水平比較Table 7 Comparison of the protein expression levels of the autophagy proteins Beclin-1 and LC3-II in femoral bone marrow tissue among various groups of rats（±s）

注：①P＜0.05，與對照組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與人參皂苷Rg3低劑量組比較

組別對照組模型組人參皂苷Rg3低劑量組人參皂苷Rg3高劑量組鼠數/只10 10 10 10 Beclin-1蛋白相對表達量0.78±0.08 0.24±0.03①0.49±0.04②0.83±0.07②③LC3-Ⅱ蛋白相對表達量0.73±0.07 0.33±0.03①0.54±0.05②0.87±0.09②③

3 討論

隨著年齡的增長，受多種因素干擾，骨形成與骨吸收之間平衡失調，導致過多的骨質流失[14]。本研究選用23月齡的雌性大鼠作為研究模型，模擬老年人骨質流失狀態，觀察人參皂苷Rg3對骨質疏松癥（OP）老年大鼠骨密度與骨代謝過程的影響。HE染色結果顯示，與對照組青年大鼠比較，模型組老年大鼠結構破壞嚴重，骨小梁稀疏、排列紊亂，骨小梁變薄，間隙變寬，分離度較高，骨髓腔內空洞較多。micro-CT掃描儀檢測發現，模型組老年大鼠股骨組織BMD與BV/TV水平降低，且TB.N和TB.Th水平降低，TB.Sp水平升高，與模型組老年大鼠病理結果相符。表明老年大鼠出現骨質流失情況，骨微結構受到嚴重破壞，提示OP模型建立成功。給予不同劑量的人參皂苷Rg3治療后老年大鼠股骨組織BMD和BV/TV水平均呈上升趨勢，呈現劑量依賴式，表明人參皂苷Rg3可提升OP老年大鼠骨密度，顯著促進OP老年大鼠骨形成。檢測大鼠血清中骨代謝指標PICP、BGP水平發現，人參皂苷Rg3低、高劑量組血清PICP水平降低，BGP水平升高。PICP是反映骨轉換率的主要標志物，也是公認的骨吸收重要指標；BGP是骨形成指標[15]。表明人參皂苷Rg3可以顯著降低老年大鼠的骨膠原代謝水平，使其高轉換的狀態逐漸降低，并促進骨形成，以保持骨代謝的動態平衡。

自噬是細胞維持穩態的重要機制，細胞通過自噬降解殘余蛋白和老化細胞器為其他生理活動提供能量，自噬常被認為是不良刺激和微環境失衡狀態下細胞的自我保護過程[16-18]。mTOR蛋白是一種非典型的絲/蘇氨酸蛋白激酶，是調控細胞自噬水平的重要通路之一[19]。研究表明，AMPK/mTOR信號通路在骨代謝過程中發揮著重要作用。在參與骨代謝中，mTOR作為AMPK的下游信號因子，受到AMPK水平的調控。在營養不足等應激條件下，AMPK感應到能量狀態的改變，進而以磷酸化的形式被激活，負反饋調節下游因子mTOR的活性。p-mTOR作為關鍵靶蛋白，對自噬水平進行調控[20]。本研究結果顯示，模型組老年大鼠股骨骨髓組織AMPK基因與蛋白表達水平均降低，且mTOR基因與蛋白表達水平升高，結合大鼠自噬蛋白Beclin-1和LC3-Ⅱ水平也呈降低趨勢，表明OP老年大鼠體內AMPK/mTOR信號通路活性受到影響，自噬水平降低。當給予人參皂苷Rg3治療后，OP老年大鼠股骨骨髓組織AMPK基因與蛋白表達水平均升高，且mTOR基因與蛋白表達水平降低，自噬蛋白Beclin-1和LC3-Ⅱ水平也逐漸升高，表明人參皂苷Rg3能夠調節骨髓組織AMPK/mTOR信號通路，促進骨細胞自噬，發揮積極的OP治療作用。

綜上所述，人參皂苷Rg3能夠提高OP老年大鼠骨密度，改善骨微結構，促進骨形成，其機制可能與調節AMPK/mTOR信號通路，提高骨細胞自噬發揮骨保護作用有關。