電針改善缺血性卒中模型小鼠認知障礙的作用機制研究

潘友燦，劉彥宜，尹雷，孫健

（1.廣東省中醫院芳村醫院傳統療法科，廣東廣州510380；2.廣州中醫藥大學期刊中心，廣東廣州510006；3.廣東省中醫院腦病六科，廣東廣州 510120）

目前，卒中（cerebral stroke，CS）已成為主要的全球性公共衛生問題。2020年發布的《中國卒中報告》顯示：我國卒中患病率為1 114.8/10萬，死亡率為149.49/10萬[1]。在全球范圍內，我國已經成為卒中終身風險最高和疾病負擔最重的國家[2]。卒中后認知障礙（post-stroke cognitive impairment，PSCI）是卒中常見的并發癥。近期大型國際隊列研究報道，卒中幸存者10年內PSCI的患病率為61%[3]，而且卒中后認知功能障礙患者的死亡率明顯高于無認知障礙患者，卒中后癡呆患者的5年生存率僅為39%，而同齡無癡呆癥狀的卒中患者生存率為75%[4]。因此，PSCI已成為影響我國經濟社會發展的重大公共衛生健康問題和社會問題。在治療方面，西醫主要以多奈哌齊類膽堿酯酶抑制劑為主，但該類藥物只能夠短期改善臨床癥狀，不能長期延緩病情的進展[5]。針灸治療PSCI具有其獨特的優勢。“通督調神”針刺法是許能貴教授以百會、大椎穴為主穴，治療缺血性中風及其并發癥的治療方案。本課題組前期臨床試驗證實，電針“百會”“大椎”穴可有效改善缺血性卒中患者認知障礙、延緩病程進展[6]。盡管該針刺方案治療卒中后認知障礙臨床療效確切，但其機制尚不清楚，從而限制了其臨床的推廣與運用。因此，進一步探討該方案治療卒中后認知障礙的機制對本病的有效防治具有重要的臨床意義。

大量研究發現，在缺血性卒中患者和模型動物的海馬和丘腦等與認知功能密切相關的大腦結構中，出現β淀粉樣蛋白（amyloid-β，Aβ）沉積[7]。Aβ沉積導致神經元信號通路的破壞，從而影響神經元形態和功能，導致記憶和行為缺陷是學術界公認的卒中后認知障礙的重要原因[8]。有研究顯示，針刺對實驗動物腦組織中Aβ沉積及其前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）表達具有調節作用[9]。基于以上文獻分析與前期試驗結果，我們假設：電針百會、大椎穴可能通過抑制Aβ的沉積、減少神經元損傷，從而發揮改善認知障礙的作用。為了證實這一科學假設，本研究通過大腦中動脈栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）法誘導建立缺血性卒中動物模型，并觀察電針百會、大椎穴對其學習記憶能力的影響，著重研究針刺對海馬神經元保護和Aβ蛋白沉積的調控作用，探討針刺治療卒中后認知障礙的可能機制，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

8周齡健康雄性SPF級C57BL/6小鼠45只，由廣州中醫藥大學動物中心提供，動物生產合格證號：SCXK（粵）2013-0024，體質量21.3～22.6 g。所有實驗程序嚴格按照中華人民共和國科技部實驗動物使用指南執行。小鼠在食物充足、12 h暗/光循環的環境中飼養。

1.2 主要儀器與試劑

中研太和牌針灸針（北京中研太和醫療器械有限公司產品，規格：0.2 mm×13 mm）；單絲縫合線（5-0 mm，美國Doccol公司）；6805-I型電針治療儀（青島鑫升實業有限公司提供）；新物體識別實驗裝置（上海欣軟信息科技有限公司）；水迷宮實驗裝置（上海欣軟信息科技有限公司）；冰凍切片機（英國賽默飛公司）。超敏ECL化學發光試劑盒（P0018，上海碧云天公司）；FD Rapid GolgiStain試劑（美國FD NeuroTechnologies公司，貨號：PK401）；抗APP抗體（英國賽默飛公司，批號：512700）、抗Aβ抗體（美國Biolegend公司，批號：803017）；抗GRPDH抗體（美國Cell Signaling Technology公司，批號：517400）。

1.3 分組與模型建立

將45只雄性C57BL/6小鼠隨機選取33只進行造模，作為MCAO手術組，其余12只設為假手術組。按照Rousselet等[10]報道的使用MCAO方法誘導缺血性卒中模型：采用5%的異氟醚對小鼠進行深度麻醉后放置在保溫墊上，體溫維持在37℃，手術暴露右側頸總動脈、頸內動脈和頸外動脈。結扎頸外動脈，然后將涂硅5-0單絲縫合線通過頸外動脈殘端插入頸內動脈，在距插入點9～10 mm處栓塞大腦中動脈。MCAO 2 h后，拆線開始再灌注。假手術組小鼠在沒有閉塞大腦中動脈的情況下接受相同的方案。小鼠蘇醒后使用Longa評分評估MCAO模型是否成功建立[11]。造模過程中小鼠死亡8只，死亡率為24.2%（8/33），另有2只手術后未出現明顯偏癱，故剔除，造模成功率為69.7%（23/33）。造模成功小鼠被隨機分為模型組11只、電針組12只。

1.4 電針方案

造模成功1周后，將小鼠固定在約束器中馴化1周，確保針刺過程中無掙扎以避免應激反應導致的實驗誤差。腧穴定位參考李忠仁主編的《實驗針灸學》[12]常用實驗動物針灸穴位。取百會、大椎穴，直刺2～3 mm，接通電針儀。電針參數根據我們前期實驗經驗[13]設置為：電流1～2 mA，頻率4～20 Hz，強度以引起穴位周圍組織輕微顫動為度。每日1次，每次20 min，連續15 d。

1.5 觀察指標與檢測方法

1.5.1 新物體識別實驗

在針刺治療結束后第1天進行新物體識別實驗，觀察各組小鼠記憶形成能力。實驗方法[14]如下：在熟悉階段，將小鼠放置在裝有兩個完全相同物體的40 cm×40 cm的正方形盒子中10 min。10 min結束后，立即將小鼠放回原來飼養的鼠籠里，待小鼠休息1 h后進入測試階段，其中一個物體被同一位置的新物體替換，每只小鼠探索該領域5 min。兩次試驗之間用75%乙醇徹底清潔盒子和物體以消除嗅覺線索。以小鼠前爪搭在物體上、鼻子嗅物體、舔物體視為探索行為。實驗過程中記錄每只小鼠在熟悉和測試階段探索對象所花費的時間。以探索新物體的時間和總探索時間的比值（認知指數）作為觀察指標。

1.5.2 水迷宮實驗

在針刺治療完成后第2天進行水迷宮實驗，觀察各組小鼠對空間位置感和方向感的學習記憶能力。根據Gawel等[15]論述，該實驗在一個直徑80 cm、高31 cm的圓形水池中進行。水池中放入全脂牛奶因而水面不透明，水面下隱藏一直徑5 cm、高14 cm逃生平臺。水池被平均劃分為東、西、南、北四個象限。首先，進行定位航行實驗，將小鼠頭朝池壁從任一象限放入水池中，記錄小鼠尋找到隱藏在水面下平臺的時間（逃離潛伏期）。在前幾次訓練中，如果小鼠70 s內未找到隱藏平臺，則引導小鼠至平臺上并停留10 s。每只小鼠每天訓練3次，每次訓練間隔15～20 min，連續4 d。水迷宮實驗第5天移除平臺后進行空間探索實驗，將小鼠由原平臺象限的對側放入水中，記錄小鼠在70 s內穿越原平臺的次數（平臺穿越次數）和平臺象限滯留時間占總時間的比例，以獲得訓練中逃離潛伏期和對位探查訓練中平臺穿越次數與平臺象限滯留時間比為觀察指標。

1.5.3 高爾基染色

在針刺治療完成后第7天進行高爾基染色實驗觀察各組小鼠海馬神經元形態，根據FD Rapid GolgiStain試劑盒說明書及本課題組前期實驗經驗[16]進行操作。小鼠深度麻醉后頸椎脫位處死，立即提取腦組織，采用0.9%氯化鈉溶液沖洗后使用FD Rapid GolgiStain試劑盒中A液和B液1∶1混合溶液中避光浸漬2周，轉移腦組織到C溶液保存48 h后在冰凍切片上切片。將切片放置在涂有明膠涂層的載玻片上，C液浸泡，室溫中干燥、脫水后用二甲苯溶液洗脫，中性樹膠封片。每組每只小鼠觀察4個海馬CA1區錐體神經元。在顯微鏡下，選擇靠近切片中心的錐體細胞，在40倍鏡下繪制在二維平面上。采用Sholl分析軟件以神經元胞體為圓心畫一系列同心圓，同心圓半徑以20 μm逐漸擴大，得到離胞體距離變化的神經元樹突與同心圓交點個數（交叉點數量）和樹突分枝數量。以交叉點數量和樹突分枝數量為觀察指標。

1.5.4 蛋白質免疫印跡實驗

根據蛋白質提取試劑盒說明提取小鼠海馬蛋白質，常規配制濃縮膠和分離膠，蛋白加樣，與電泳加樣緩沖液混勻，分離等體積的蛋白質，并轉移到聚偏二氟乙烯膜上。將膜在5%脫脂牛奶中封閉1 h，然后加入一抗（Aβ所用濃度1∶1 000，APP所用濃度1∶800，GRPDH所用濃度1∶5 000）4℃孵育過夜。用含有Tween 20緩沖鹽水沖洗膜3次，然后將膜與HRP偶聯的二抗孵育2 h。采用超敏ECL化學發光試劑盒顯色后，顯影和定影拍照。重復3次實驗，并使用ImageJ軟件通過光密度分析確定蛋白質的定量。

1.6 統計學處理

運用SPSS 19.0軟件對實驗數據進行處理。首先對所有數據進行正態性檢驗、方差齊性檢驗，經檢驗所有數據均呈正態分布。計量資料以均數±標準差（±s）表示，采用單因素重復測量方差分析或者雙因素重復測量方差分析。當P＜0.05時定義差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠在新物體識別實驗中偏好指數比較

為了驗證電針百會、大椎是否能夠改善缺血性卒中模型小鼠的認知功能，進行新物體識別實驗，觀察小鼠記憶形成能力差異。表1結果顯示：在熟悉階段，各組小鼠對相同物體的偏好指數差異無統計學意義（P＞0.05），排除了小鼠空間偏向對實驗結果的影響。在實驗階段，模型組小鼠對新物體偏好指數顯著減少，與假手術組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；電針組小鼠對新物體偏好指數顯著增加，與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表1 各組小鼠偏好指數比較Table 1 Comparison of the preference index among various groups of mice （±s，%）

表1 各組小鼠偏好指數比較Table 1 Comparison of the preference index among various groups of mice （±s，%）

注：①P＜0.05，與假手術組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別假手術組模型組電針組鼠數/只12 11 12熟悉階段51.16±12.84 50.42±6.83 48.92±10.19實驗階段70.25±7.97 55.42±11.08①66.25±11.02②

2.2 各組小鼠逃避潛伏期比較

為了進一步驗證電針百會、大椎對缺血性卒中模型小鼠認知功能的改善作用，進行水迷宮實驗，觀察各組小鼠對空間位置感和方向感的學習記憶能力差異。表2結果顯示：在定位航行實驗中，模型組小鼠第3、4天逃避潛伏期延長，與假手術組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；電針組小鼠第4天逃避潛伏期縮短，與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表2 各組小鼠逃避潛伏期比較Table 2 Comparison of the escape latency among various groups of mice （±s，s）

表2 各組小鼠逃避潛伏期比較Table 2 Comparison of the escape latency among various groups of mice （±s，s）

注：①P＜0.05，與假手術組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別假手術組模型組電針組鼠數/只12 11 12第1天66.17±3.43 65.58±2.84 66.67±2.90第2天54.58±9.74 61.67±9.59 57.33±6.17第3天43.00±14.51 56.92±9.89①47.42±11.84第4天30.58±8.35 46.92±10.75①32.25±10.66②

2.3 各組小鼠平臺穿越次數和平臺象限滯留時間比比較

表3結果顯示：在空間探索實驗中，模型組小鼠平臺穿越次數和平臺象限滯留時間比均顯著減少，與假手術組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；電針組小鼠平臺穿越次數和平臺象限滯留時間比均顯著增加，與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表3 各組小鼠平臺穿越次數和平臺象限滯留時間比比較Table 3 Comparison of the platform crossings times and plateau quadrant retention time ratios among various groups of mice （±s）

表3 各組小鼠平臺穿越次數和平臺象限滯留時間比比較Table 3 Comparison of the platform crossings times and plateau quadrant retention time ratios among various groups of mice （±s）

注：①P＜0.05，與假手術組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別假手術組模型組電針組鼠數/只12 11 12平臺穿越次數/次3.25±0.75 2.08±0.67①3.08±0.79②平臺象限滯留時間比/%38.08±5.45 28.67±4.23①34.25±6.11②

2.4 各組小鼠海馬CA 1區神經元形態比較

鑒于認知障礙和與神經元的病理性改變有關，我們利用Golgi staining觀察各組小鼠神經元形態差異（如圖1所示）。表4結果顯示：模型組小鼠海馬神經元樹突與同心圓交叉點數量減少，與假手術組比較，模型組同心圓與胞體的距離為100、140、180 μm時，差異有統計學意義（P＜0.05）；電針組小鼠海馬神經元樹突與同心圓交叉點數量增加，與模型組比較，電針組同心圓與胞體的距離為100、140、180 μm時，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表4 各組小鼠神經元樹突與同心圓交叉點數量比較Table 4 Comparison of the number of neuronal dendrites and concentric circle crossings among various groups of mice （±s，個）

表4 各組小鼠神經元樹突與同心圓交叉點數量比較Table 4 Comparison of the number of neuronal dendrites and concentric circle crossings among various groups of mice （±s，個）

注：①P＜0.05，與假手術組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別假手術組模型組電針組鼠數/只12 11 12同心圓與胞體的距離/μm 20 2.66±1.37 2.50±1.31 3.00±1.76 60 10.50±2.11 8.67±1.67 9.58±1.98 100 13.58±1.88 10.00±2.30①13.50±1.88②140 15.25±1.82 10.00±1.75①14.91±2.27②180 12.42±2.78 6.50±3.71①11.83±2.16②200 7.00±4.02 3.50±3.55 6.00±2.04

圖1 高爾基染色實驗分析各組小鼠海馬CA1區神經元形態變化Figure 1 Morphological changes of neurons in the CA1 region of the hippocampus in various groups of mice analyzed by Golgi staining experiment

表5結果顯示：模型組小鼠樹突分支數量顯著減少，與假手術組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；電針組小鼠樹突分支數量顯著增加，與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表5 各組小鼠樹突分支數量比較Table 5 Comparison of the number of dendritic branches among various groups of mice（±s）

表5 各組小鼠樹突分支數量比較Table 5 Comparison of the number of dendritic branches among various groups of mice（±s）

注：①P＜0.05，與假手術組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別假手術組模型組電針組鼠數/只12 11 12樹突分枝數量/個46.83±11.44 35.08±10.04①45.25±7.99②

2.5 各組小鼠海馬組織Aβ斑塊沉積和APP表達比較

Aβ斑塊沉積可導致突觸衰竭、樹突和軸突受損[17]。Golgi staining實驗發現，電針改善了神經元形態受損，因此，我們研究了這種作用是否可以改善卒中后認知障礙小鼠腦組織中的Aβ沉積。圖2結果顯示：模型組小鼠腦組織中Aβ沉積增加，與假手術組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；電針組小鼠海馬組織中的Aβ沉積減少，與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。APP是導致Aβ斑塊形成的前體蛋白。本研究發現，模型組小鼠腦組織中APP表達增加，與假手術組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；電針組小鼠海馬組織中的APP表達減少，與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖2 各組小鼠腦組織Aβ、APP蛋白表達水平比較Figure 2 Comparison of protein expression levels of Aβ，APP among various groups of mice（±s）

3 討論

3.1 電針百會、大椎穴能夠有效改善缺血性卒中模型小鼠認知障礙

“通督調神”針刺法是許能貴教授基于《難經·二十八難》記載的“督脈者，起于下極之俞，并于脊里，至風府，入于腦”。《素問·骨空論》記載督脈的分支“貫脊，屬腎”“如循膂，絡腎”“上貫心”及心主神明，腦為元神之府的理論構架提出的治療缺血性腦病及其并發癥的針刺方案。該方案主要取穴為百會、大椎穴，《太平圣惠方》和《針灸資生經》把該二穴記載在“中風七穴”之中。現代研究結果顯示，百會、大椎穴具有提升椎基底動脈和大腦中動脈腦血流速度[18]和緩解急性、亞急性腦缺血再灌注損傷的作用[19]。本課題組前期臨床試驗已證實，“通督調神”針刺法可以有效改善血管性癡呆患者日常生活能力水平和神經功能缺損[4]。本次動物實驗，考慮MCAO手術后小鼠肢體功能障礙可能會對新物體識別實驗、水迷宮結果造成影響，但在預實驗中，礦場實驗結果顯示：各組小鼠運動速度、運動距離、休息時間等自發活動差異無統計學意義，排除了MCAO手術導致的肢體功能障礙對認知行為學結果的影響。在接下來的新物體識別實驗、水迷宮試驗中MCAO誘導卒中后認知障礙模型小鼠顯示出明顯的認知障礙。然而，電針可以有效地改善認知功能障礙，進一步證明電針百會、大椎穴可以改善卒中后認知功能障礙。

3.2 電針百會、大椎穴能夠保護受損神經元、促進神經功能恢復

海馬在記憶的獲取和儲存過程中發揮重要作用[20]，海馬神經元樹突密度和學習記憶能力相關，當腦組織缺血缺氧造成神經元凋亡、樹突密度降低，學習記憶能力將下降[21]。前期動物實驗研究表明，MCAO誘導卒中后認知障礙模型動物樹突密度降低。本實驗中，卒中后認知障礙模型小鼠在高爾基染色實驗中表現出同心圓交叉數量和樹突分枝數量減少，再次證實，卒中后認知障礙模型小鼠存在神經元受損。同時，本研究發現，電針可有效改善神經元受損，證明電針百會、大椎穴能夠保護受損神經元、促進神經功能恢復。

3.3 電針百會、大椎穴能夠減少模型小鼠腦組織Aβ斑塊沉積

有研究顯示，Aβ沉積在卒中后認知障礙發生發展過程中發揮重要作用。動物研究發現，大腦中動脈閉塞后7 d內，梗死周圍區域的APP出現了上調，隨著APP分解Aβ肽逐漸增加并轉化為致密的斑塊樣沉積[22]。Aβ沉淀聚積具有強神經毒性，可導致神經元樹突密度降低和突觸可塑性受損，從而造成認知障礙是卒中后認知障礙產生的重要機制[23]。抑制小鼠海馬區Aβ沉積和APP表達可減輕海馬神經元損害、改善認知障礙[24]。因此，本實驗以Aβ和APP為觀察指標，研究結果表明，電針百會、大椎穴能夠抑制缺血性腦卒中小鼠海馬組織中Aβ過度沉積和APP異常表達。

綜上所述，電針百會、大椎穴可能是通過抑制卒中后認知障礙模型小鼠海馬區Aβ沉積發揮神經元保護作用，從而改善認知功能障礙，為臨床運用提供了實驗證據。然而，本研究尚存在一定的局限性，比如電針對Aβ的作用點何在？是直接阻斷其神經毒效應，還是阻礙其聚集沉積，或加速降解清除？其確切機制尚有待于進一步的研究。