氧化應激對宰后獺兔肉肌肉品質、脂質及蛋白質氧化的影響

陳煉紅，王琳琳，張巖，簡文素，汪平*

1(西南民族大學 食品科學與技術學院，四川 成都，610041)2(西南民族大學 畜牧獸醫學院，四川 成都，610041)3(四川省草原科學研究院，四川 成都，610000)

獺兔是一種草食性皮肉兼用型經濟動物，其肉質蛋白質和多不飽和脂肪酸含量高，脂肪含量低，其他微量元素也較豐富，可預防心腦血管疾病，是一種營養較全面的動物性食品，市場應用前景較好[1-2]。宰后成熟過程中肌肉內部所發生的各種復雜生理生化反應導致肌肉品質和理化性質等發生改變，使動物胴體逐漸由肌肉轉變成可食用肉，是一種有效改善肉品質量的途徑[3]，獺兔肉與牛羊肉類似也可通過宰后成熟過程改善肌肉品質[4]。

本實驗以四川草業科學研究所培育的川白獺兔肉為實驗對象，用H2O2和N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)對宰后獺兔肉進行處理，建立肌肉氧化和還原模型，研究處理組和空白組獺兔肉食用品質、脂質氧化和蛋白質氧化在成熟過程中的變化規律，并探究肌肉中ROS的積累、清除和對照組之間脂質氧化和蛋白氧化之間的差異，最終明確氧化應激影響獺兔肉肌肉品質形成的可能機制，為提高獺兔肉品質及精深加工提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品處理及采集：選取150日齡獺兔，由四川草業科學研究所自主培育。以宰后獺兔后腿肉為試驗材料，剔除脂肪、筋和膜后，分割切塊。將肉塊隨機分成3組，做3種處理(50 mmol/L H2O2，50 mmol/L NAC，0.9%的鹽水)，按肉液比(10∶1,g∶mL)均勻注射，在冷藏條件下分別成熟6、12、24、72、120、168 h后在相應時間點取樣，測定相關指標。

試劑：硫代巴比妥酸、三氯乙酸、氯仿、丙酮、石油醚、硫酸亞鐵、H2O2、N-乙酰半胱氨酸、亞硫酸鈉、乙二胺四乙酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、濃鹽酸、濃硫酸、溴酚藍、乙酸乙酯、尿素、2，4-二硝基苯肼、5，5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)，以上均為分析純，成都市科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設備

pHS-3型pH計，上海日島儀器廠；CR-400型色差儀，日本Konica Minolta公司；U2800紫外分光光度計，日本日立高技術公司；DS-1高速組織搗碎機，上海標本模型廠；22K高速真空離心機，長沙英泰儀器有限公司；UV-6100型紫外分光光度計，上海美譜達儀器有限公司。

1.3 指標及測定方法

1.3.1 氧化應激水平

ROS水平：參照張玉林[15]的方法測定肌肉ROS含量。

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性用SOD活性檢測試劑盒測定[16]。用酶標儀在波長550 nm處測定吸光度值，以無添加肉樣的溶液為對照組；測定樣品的蛋白濃度，根據公式(1)計算酶活性。

(1)

1.3.2 食用品質

pH值參照GB 5009.237—2016《食品pH值的測定》。

肉色參照文獻[4]方法測定。選取肉樣的3個不同位置作為測量點，測定每個肉樣的紅色度a*值。

蒸煮損失參照李婉竹[17]方法。割掉肉中的筋、膜與脂肪，切成3 cm厚，稱重，質量記為m1，裝入保鮮袋中，將電子溫度計插入肉塊中心后扎緊袋口，80 ℃水浴加熱，溫度計顯示溫度達到70 ℃時取出冷卻至室溫，肉樣表面水分吸干，稱重記為m2。計算如公式(2)所示：

(2)

剪切力參照戴四發等[18]方法。將整塊肉裝袋，浸入溫度為80 ℃的恒溫水浴鍋中，溫度計插入肉塊中心，到溫度為70 ℃時取出，冷卻至室溫，吸干表面殘余水分。將肉塊用剪切力儀測定剪切力值。

1.3.3 肌肉新鮮度

過氧化值(peroxide value，POV)參照GB 5009.227—2016《食品中過氧化值的測定》。

硫代巴比妥酸反應物(thiobarbituric acid reactive substances，TBARS)含量參照FAUSTMAN等[19]方法測定。

揮發性鹽基氮(total volatile base nitrogen，TVB-N)參照GB 5009.228—2016《食品中揮發性鹽基氮的測定》。

1.3.4 蛋白氧化程度

肌原纖維蛋白(myofibrillar protein，MP)提取參照XIONG等[20]的方法。

濁度參照韓敏義等[21]的方法。取MP沉淀溶入磷酸鹽緩沖液(0.6 mol/L NaCl，50 mmol/L Na2HPO4，pH 6.25)中，制成蛋白質質量濃度為2.5 mg/mL的溶液，在室溫下放置20 min后，以磷酸緩沖液為空白溶液，在340 nm處測定吸光值，該吸光度值即為肌原纖維蛋白的濁度。

溶解度參照AGYARE等[22]的方法。取肌原纖維蛋白溶液在4 ℃條件下放置60 min后取出，在4 ℃，8 000 r/min條件下離心15 min，留上清液，測定其蛋白濃度，未加入蛋白的磷酸鹽緩沖溶液作空白組。溶解度計算如公式(3)所示：

(3)

羰基含量參照李學鵬等[23]方法測定;巰基含量按照THANNHAUSER等[24]方法測定。

表面疏水性參照CHELH等[25]方法。取1 mL 2.5 mg/mL蛋白質溶液和200 mL 1.0 mg/mL溴酚藍，加入離心管中，同時設置對照(0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液1.0 mL，1.0 mg/mL溴酚藍200 μL于離心管中)，室溫下振蕩10 min，在8 000 r/min條件下離心10 min，取400 μL上清液稀釋10倍，在波長595 nm處測定吸光度值，記作A樣品，空白為0.02 mol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖液，吸光度記作A空白。表面疏水基含量計算如公式(4)所示：

(4)

二硫鍵含量參照THANNHAUSER等[24]方法作適當修改。取0.5 mL 4.0 mg/mL的混合蛋白溶液，加入3.0 mL新配NTSB(2-nitro-5-thiosulfobenzoate)檢測溶液(pH 9.5)，混勻后在暗處反應25 min，波長412 nm處測定吸光值。二硫鍵含量按公式(5)計算：

(5)

式中：B,稀釋倍數，此處為1.46；ρ,混合蛋白溶液質量濃度,mg/mL。

1.4 統計分析

所有數據均為3次重復測定的平均值，結果用平均值±標準差表示。利用SPSS對數據進行統計分析獲得平均值和標準差，采用Duncan多重比較進行顯著性方差分析，顯著性水平P<0.05。采用Excel軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 H2O2、NAC處理對宰后獺兔肉成熟過程中氧化應激水平的影響

如圖1-a所示，H2O2處理組ROS水平呈先顯著上升后下降趨勢(P<0.05)；NAC處理組和空白組ROS水平呈先下降后上升趨勢，并分別在120 h和72 h達到最大值隨后顯著下降(P<0.05)。6～168 h，H2O2處理組ROS水平均顯著高于其他2組，空白組ROS水平也顯著高于NAC處理組(P<0.05)，此結果與張玉林[15]研究相一致，均說明H2O2處理可提高宰后肌肉ROS水平，而NAC作為一種ROS自由基清除劑使處理組ROS水平降低。

a-ROS水平；b-SOD活性圖1 H2O2、NAC處理對宰后獺兔肉成熟過程中氧化應激水平的影響Fig.1 Effects of H2O2 and NAC treatment on oxidative stress levels of rex rabbit meat注：不同小寫字母代表差異顯著，P<0.05(下同)

SOD的活性反應肌肉中的抗氧化能力，SOD通過將自由基轉化為H2O2，再被過氧化氫酶和氧化酶轉化為水，起到減少自由基保護細胞的作用[26]。由圖1-b可知，H2O2處理組SOD活性呈顯著下降趨勢(P<0.05)，原因可能是肌肉經處理后產生的過量ROS自由基，使其內部抗氧化系統遭到破壞并失去平衡，從而提高了肌肉的氧化應激水平；同時，整個成熟過程，H2O2處理組SOD活性均顯著低于空白組和NAC處理組；空白組和NAC處理組SOD活性均在24 h達到最大值，并存在顯著差異(P<0.05)。綜上所述，H2O2處理顯著提高了肌肉ROS水平，降低SOD活性，減弱了肌肉抗氧化能力，進而提高了肌肉的氧化應激水平，并可能進一步影響肌肉品質。

2.2 H2O2、NAC處理對宰后獺兔肉成熟過程中肌肉食用品質的影響

由圖2-a可知，3個處理組pH均呈先顯著下降后上升趨勢，原因是糖原的無氧酵解產生了乳酸以及能量降解反應產生了一些酸性離子，最終導致肌肉pH下降。6～24 h，H2O2處理組pH顯著下降，并顯著低于空白組和NAC處理組(P<0.05)，與文獻[27]報道類似。6～24 h，NAC處理組pH均顯著高于空白組(P<0.05)，但在72～120 h無顯著差異，說明NAC通過抑制肌肉的氧化，抑制了糖酵解反應減少乳酸產生從而提高了肌肉的pH。由圖2-b可知，3個處理組a*值整體均呈顯著下降趨勢(P<0.05)，原因是宰后肌肉中氧合肌紅蛋白不穩定，慢慢氧化成高鐵肌紅蛋白而使a*下降。6～168 h，NAC處理組和空白組a*值均高于H2O2處理組，并在6～72 h差異顯著(P<0.05)，說明H2O2處理介導的氧化應激不利于肌肉色澤穩定；12～ 24 h，NAC處理組a*值顯著高于空白組(P<0.05)，但在成熟后期無顯著差異，說明NAC的抗氧化作用在一定程度上對肉色起到保護作用。

a-pH；b-a*值；c-蒸煮損失；d-剪切力圖2 H2O2、NAC處理對宰后獺兔肉成熟過程中食用品質的影響Fig.2 Effects of H2O2 and NAC treatment on edible quality of rex rabbit meat

由圖2-c可知，3個處理組蒸煮損失均呈先增大后減小趨勢(P<0.05)。6～168 h，H2O2處理組蒸煮損失均顯著高于空白組和NAC處理組(P<0.05)；同時，空白組蒸煮損失也顯著高于NAC處理組(P<0.05)，與文獻[28]報道相一致，均說明氧化會加重肌肉蒸煮損失。原因可能是H2O2通過加劇肌肉的氧化應激，提高糖酵解速度而降低pH值，加快蛋白質的變性進而減弱了其對水分的結合力，加之肌肉中的骨架蛋白被慢慢降解，肌原纖維間隙增加，細胞外水重新滲入細胞內，使肌肉的持水力提高[29]。如圖2-d所示，3個處理組肌肉剪切力值均呈先增大后減小趨勢。成熟24 h時，H2O2處理組剪切力達到最大2 164.52 gf，顯著高于空白組和NAC處理組(P<0.05)，說明H2O2處理組獺兔肉比NAC處理組和空白組提前進入僵直階段；72～168 h，H2O2處理組剪切力值均顯著小于NAC處理組，且72～168 h時，NAC處理組剪切力值均顯著小于空白組(P<0.05)，說明H2O2處理可在一定程度上促進肌肉成熟，而抗氧化劑NAC起相反作用。

2.3 H2O2、NAC處理對宰后獺兔肉成熟過程中肌肉新鮮度的影響

由圖3-a可知，12～168 h，3個處理組POV總體均呈顯著上升變化(P<0.05)，且H2O2處理組POV的變化最為明顯，說明宰后成熟過程中肌肉中脂質氧化逐漸加大。6～168 h，H2O2處理組POV均顯著高于空白組和NAC處理組(P<0.05)；12～168 h(24 h除外)，NAC處理組POV均顯著低于空白組(P<0.05)，說明H2O2處理明顯提高了肉中POV，促進肌肉脂質氧化程度，原因在于ROS的促氧化作用，而NAC的抗氧化作用則顯著降低了肌肉的脂質氧化程度。

a-POV值；b-TBARS值；c-TVB-N值圖3 H2O2、NAC處理對宰后獺兔肉成熟過程中新鮮度的影響Fig.3 Effects of H2O2 and NAC treatment on freshness of rex rabbit meat

如圖3-b所示，6～24 h，3個處理組TBARS值均呈緩慢上升趨勢，72 h后顯著上升(P<0.05)。6～168 h，H2O2處理組TBARS值顯著高于NAC處理組和空白組(P<0.05)；同時，NAC處理組TBARS值顯著低于空白組。新鮮肉和肉制品的脂肪酸敗臨界值是0.5 μg/g，6～72 h H2O2處理組TBARS值在臨界值內；6～120 h NAC處理組TBARS值在臨界值內，說明ROS促進了脂肪的氧化，加快了脂肪的酸敗，而抗氧化劑NAC則與之相反，此結果與李興艷[30]研究相一致。

如圖3-c所示，24～120 h，H2O2處理組TVB-N值上升緩慢且與空白組接近；120 h后，3個處理組TVB-N值均明顯上升并顯著高于6～72 h的值(P<0.05)；6～168 h，H2O2處理組和空白組TVB-N值均顯著高于NAC處理組(P<0.05)，由于H2O2為弱酸性，促進了肉中蛋白質及其他物質的降解以及含氮物質的產生，進而提高了TVB-N值；但24 h時H2O2處理組和空白組TVB-N值無顯著差異，并在72～120 h，H2O2處理組TVB-N值顯著低于空白組(P<0.05)。以上結果說明，H2O2不僅加劇了脂質氧化程度還在一定程度上促進蛋白質和氨及氨類物質的分解，造成肌肉新鮮度的下降。

2.4 H2O2、NAC處理對獺兔肉宰后成熟過程中蛋白氧化程度的影響

由圖4-a可知，H2O2、NAC處理組和空白組MP濁度均呈先上升后緩慢下降變化并分別在24、72、72 h達到最大值，此時肉的pH接近MP的等電點，蛋白質容易發生變性聚集，致使溶液變渾濁，反之遠離等電點的MP濁度變小。成熟過程中(除72 h)，H2O2處理組蛋白質濁度整體顯著高于空白組，并顯著高于NAC處理組(P<0.05)。說明ROS介導的氧化應激促進了蛋白質的氧化降解，使其發生變性聚集，蛋白顆粒增大，溶液變渾濁，而NAC則抑制了蛋白質的聚集，減小了蛋白質濁度。如圖4-b所示，6～24 h，3個處理組MP溶解度呈顯著下降趨勢(P<0.05)，這與pH變化相似，均在24 h前呈顯著下降變化，原因是此過程中蛋白質因缺乏靜電相互作用而聚集和沉淀；成熟后期蛋白質溶解度緩慢下降的原因是pH回升導致靜電相互作用增大，產生了親水性和水合作用，蛋白質疏水基團發生聚集，減少了與水的接觸，而使蛋白質溶解度變化不明顯[5]。

a-濁度；b-溶解性；c-羰基含量；d-巰基含量；e-表面疏水性；f-二硫鍵含量圖4 H2O2、NAC處理對獺兔肉宰后成熟過程中蛋白氧化程度的影響Fig.4 Effects of H2O2 and NAC treatment on protein oxidation levels of rex rabbit meat

由圖4-c可知，3個處理組MP羰基含量呈顯著上升趨勢(P<0.05)。同時，6～168 h，H2O2處理組的MP羰基含量顯著高于空白組和NAC處理組(P<0.05)，且NAC處理組MP羰基含量顯著低于空白組(P<0.05)，說明H2O2處理會導致羰基含量的增加；而NAC則通過清除肌肉中的·OH，抑制肌肉蛋白質羰基的產生，從而減緩蛋白質氧化。此研究結果與崔文斌[5]研究相一致。如圖4-d所示，3個處理組MP巰基含量顯著下降(P<0.05)，說明隨著成熟進行肌肉內部MP發生降解，蛋白質的天然構象發生改變，活性巰基暴露而被氧化成二硫鍵，從而導致活性巰基數量減少。6～168 h，H2O2處理組MP巰基含量均顯著低于空白組和NAC處理組(P<0.05)，說明H2O2產生的自由基進攻含硫氨基酸的巰基，使其被氧化形成二硫鍵，導致巰基含量減少，而NAC通過清除一部分自由基，減緩了宰后肌肉中MP巰基的氧化。

由圖4-e可知，3個處理組MP表面疏水性呈先上升后平穩變化的趨勢，并分別在24、72、72 h時達到最大值(P<0.05)，原因是當肌肉pH值下降接近蛋白質等電點時，蛋白質容易發生聚集變性，引起疏水基團的暴露；同時因宰后肌肉僵直收縮，蛋白質結構發生變化，溶解度下降，蛋白質內部疏水基團暴露，最終使疏水性增加。6～168 h，H2O2處理組MP疏水性整體顯著高于空白組(P<0.05)，NAC處理組MP疏水性顯著低于空白組(P<0.05)，說明H2O2處理后顯著促進了MP的氧化，NAC則發揮相反作用。由圖4-f可知，3個處理組MP二硫鍵含量均隨著成熟時間的延長呈上升趨勢(P<0.05)。且在整個成熟過程中，H2O2處理組MP二硫鍵含量顯著高于NAC處理組和空白組(P<0.05)，NAC處理組MP二硫鍵含量最低，說明氧化修飾可顯著提高肌肉MP的氧化程度，并可能對肌肉品質造成影響。綜上所述，H2O2處理導致ROS水平增加并進一步介導肌肉發生氧化應激，并對MP氧化起促進作用，并可能進一步影響肌肉品質。

3 結論

H2O2處理顯著提高了肌肉ROS水平并降低SOD活性，從而降低了肌肉的抗氧化能力，并進一步提高了肌肉的氧化應激水平；成熟過程中，H2O2處理組pH值迅速下降，并顯著低于空白組和NAC處理組；H2O2處理后導致的氧化應激對肌肉色澤、保水性均產生不利影響，但對肌肉嫩化有一定積極作用。同時，H2O2介導的氧化應激顯著提高了肌肉的脂質過氧化，造成肌肉新鮮度下降，還對MP的氧化起促進作用。

綜上所述，宰后缺血缺氧環境導致獺兔肉內氧化應激水平升高，可能通過促進肌肉的脂質氧化和蛋白氧化最終導致獺兔肉食用品質的下降。