醋醅中優良醋酸菌的分離篩選及性能研究

馮荊舒，張榮，高獻禮，代春華，何榮海*，馬海樂

1(江蘇大學 食品與生物工程學院，江蘇 鎮江，212013)2(江蘇大學 食品物理加工研究院，江蘇 鎮江，212013)

食醋作為我國傳統的食品調味品，是由糧食蔬果在多種微生物的作用下，通過淀粉糖化、酒精發酵和醋酸發酵制成[1]，其營養價值豐富，含有多酚[2]、黃酮[3]等物質，具有殺菌消炎[4]、降血壓、降血脂[5]、預防癌癥、心血管疾病[6]等功效。

醋酸菌為革蘭氏陰性好氧菌，可將乙醇轉化成乙酸[7]，產生獨特風味，進而影響產品的品質[8]。醋酸菌作為醋酸發酵這一過程的“主力菌”，在食醋的生產發酵過程中不可或缺，其發酵性能很大程度地影響食醋企業的生產發展[9]，篩選高產酸且具有良好耐受性的醋酸菌菌株始終是食醋產業的研究方向。楊杰等[10]采用傳統分離培養的方法從廣西民間釀醋作坊的醋醅中分離1株產酸量高且具有一定耐熱和耐乙醇性能的醋酸桿菌。王超敏等[11]從山西老陳醋醋醅中分離篩選出18株巴氏醋桿菌、2株醋化醋桿菌，其中巴氏醋桿菌SAV-CP 1884性能最好。趙馨儀等[12]從山西老陳醋醋醅中篩選出7株產酸菌，其中有3株產酸量高且耐受性良好，分別為巴氏醋桿菌SAV-1、植物乳桿菌SAV-7和SAV-8。

鎮江香醋作為我國四大名醋之一，以優質糯米為原材料，采用多菌混合式固態分層發酵的方法，其醋醅中蘊藏著較為豐富的菌種資源。因此，本實驗以鎮江香醋發酵過程中的醋醅為樣品，分離篩選出優良醋酸菌，并進行生理生化及16S rDNA分子生物學鑒定試驗，以期篩選出優良菌株，豐富菌種資源，為食醋行業的發展奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

醋醅，鎮江恒順香醋有限公司；酵母粉、葡萄糖、瓊脂、MgSO4·7H2O、KH2PO4、NaOH、溴甲酚紫，國藥集團化學試劑有限公司。

HVE-50滅菌鍋，日本Hirayama公司；OptiClean1300垂直流潔凈工作臺，瑞士Kuhnrikon公司；SPX250B-Z生化培養箱，上海博迅醫療生物儀器公司；HYL-C3組合搖床，太倉強樂實驗設備有限公司。

1.2 培養基

分離培養基(g/L)：葡萄糖10，酵母膏10，0.04%(體積分數)溴甲酚紫50 mL，瓊脂20，121 ℃滅菌20 min，待溫度降約70 ℃時加入30 mL無水乙醇。

種子培養基(g/L)：葡萄糖10，酵母膏10，pH 5.5，121 ℃滅菌20 min，待溫度降約70 ℃時加入30 mL無水乙醇。

發酵培養基(g/L)：酵母膏10，葡萄糖10，KH2PO40.1，MgSO4·7H2O 0.1，pH 5.5，121 ℃滅菌20 min，待溫度降約70 ℃時加入60 mL無水乙醇。

1.3 分離及鑒定流程

醋醅樣品→稀釋涂布→分離純化→革蘭氏染色→定性試驗→定量試驗→培養單菌落→形態觀察→生理生化試驗→分子生物學鑒定→斜面保藏

1.3.1 分離

稱取10 g樣品置于含有90 mL無菌生理鹽水的三角燒瓶，振蕩30 min，梯度稀釋后涂平板，置于30 ℃培養箱倒置培養2 d。從中挑選變色圈大而清晰，且長勢較好的單菌落進行后續試驗。

1.3.2 純化

將上述單菌落純化培養3次，確認形態一致后，挑選其中長勢較好、變色圈大而清晰的單菌落保藏[13]。

1.3.3 革蘭氏染色

對篩選菌株進行革蘭氏染色，并借助顯微鏡觀察其細胞形態[14]。

1.3.4 產酸定性試驗

取5 mL種子液，離心去除菌體，用0.1 mol/L NaOH溶液調節pH為7.0，加入5～6滴質量分數5% FeCl3溶液，離心取上清液，若水浴加熱5 min有紅褐色沉淀，則初步認定為產醋酸菌。離心分離沉淀后加入1 mL濃硫酸，沉淀溶解，再加1 mL無水乙醇，若加熱沸騰產生乙酸乙酯香味，則為醋酸菌[15]。

1.3.5 初篩

根據革蘭氏染色和產酸定性試驗初步篩選出醋酸菌。

1.3.6 復篩

將初篩得到的菌株接種至發酵培養基，30 ℃、200 r/min搖床培養6 d，采用酸堿滴定法測定發酵液總酸度[16]，并根據結果篩選出產量較高的菌株。酸堿滴定法[17]：將2 mL發酵液加至50 mL蒸餾水中，加入3～5滴0.5%(體積分數)酚酞酒精溶液，用0.1 mol/L NaOH溶液滴定至淺粉色。發酵產酸量的計算如公式(1)所示：

(1)

式中：L，產酸量，g/L；V，發酵液樣品消耗NaOH溶液的體積，mL；V0，對照組(空白培養基)消耗NaOH溶液的體積，mL；c，NaOH溶液的濃度，mol/L；60，醋酸的摩爾質量，g/mol；V1，樣品的體積，mL。

1.3.7 菌種鑒定

1.3.7.1 生理生化鑒定

根據《伯杰細菌鑒定手冊》(第八版)[18]與《常見細菌系統鑒定手冊》[19]對菌株進行生理生化鑒定。

1.3.7.2 分子生物學鑒定

由于上述方法不夠精準，因此采用分子生物學鑒定方法進一步鑒定菌株[20]。按照DNA提取試劑盒的說明提取DNA。選取通用引物27F和1492R(27F：5′-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3′，1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)對菌株的DNA序列進行PCR擴增[21]。純化后送至上海生工測序。根據檢測結果，在美國國家生物技術信息中心數據庫檢索同源序列，找到與目標菌株同源性最大的模式菌株，利用MEGA7.0對DNA序列進行多序列比對[22]，并采用鄰接法構建系統發育樹[23]，以確定篩選菌株的種屬[24]。

1.4 生長發酵性能的測定

1.4.1 生長曲線的測定

菌株活化后接至種子液培養基，置于30 ℃、200 r/min搖床培養，以空白培養基作對照，每2 h測定樣品在600 nm處的吸光度值OD600，并繪制生長曲線。

1.4.2 乙醇對菌株生長發酵的影響

將活化的菌株分別接入加有3%、9%、12%、15%(體積分數)無水乙醇的發酵培養基中，在培養0、12、24、36、48、72 h分別取樣，測定醋酸菌在600 nm下的吸光度值OD600，并測量培養72 h的產酸量。

1.4.3 乙酸對菌株生長發酵的影響

將活化的菌株分別接入加有1、2、3、4%(體積分數)乙酸的發酵培養基中，在培養0、12、24、36、48、72 h分別取樣，測定醋酸菌在600 nm下的吸光度值OD600，并測量培養72 h的產酸量。

1.5 數據處理

所有試驗重復3次，試驗結果用平均值±標準偏差表示。運用統計分析軟件處理數據，顯著性水平設定值為0.05，P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 分離篩選結果

2.1.1 分離純化

溴甲酚紫在pH為5.2～6.8內，顏色會由黃色變成紫色。1992年BOARD等[25]利用該特性分離產酸菌。由于產酸菌代謝產酸，菌落在紫色的平板上就會呈現出黃色的變色圈，挑取其中長勢較好的98個單菌落分離純化。

2.1.2 初篩

通過革蘭氏染色和產酸定性試驗，剔除部分革蘭氏陽性及不產醋酸的菌株，初步篩選出41株醋酸菌。

2.1.3 復篩

通過產酸定量試驗，復篩出其中產酸量較高的5株菌。如圖1所示，各菌株的產酸量隨時間的增加而不斷增高，發酵1～4 d，產酸量均迅速增加，而發酵4～6 d，產酸量緩慢增加并趨于平緩。菌株H3的產酸量始終高于其他菌株，最高為44.16 g/L。

圖1 各菌株的產酸曲線Fig.1 Acid production curves of each strain

然后對其遺傳穩定性進行研究，如表1所示，各菌株每代的產酸量均發生不同程度的變化。其中菌株H3各代的產酸量之間沒有顯著性差異，遺傳性能穩定。結合圖1和表1，選擇菌株H3為目的菌株。

表1 各菌株傳代培養產酸量的測定 單位：g/LTable 1 Determination of acid production of each strain in subculture

2.2 菌株鑒定結果

2.2.1 形態特征

如圖2所示，菌株H3的菌落在溴甲酚紫顯色培養基上呈米黃色，不透明，圓形，邊緣規整，有凸起，質地稀軟，表面光滑；革蘭氏染色后呈革蘭氏陰性且短桿狀，單個或成對、成鏈排列，無芽孢。

a-菌落形態;b-細胞形態圖2 菌株H3的菌落形態和細胞形態圖Fig.2 Colony morphology and cell morphology of strain H3

2.2.2 生理生化鑒定

接觸酶試驗陽性；不產生水溶性棕色色素；不產纖維素；不水解淀粉；生酮試驗菌落周圍有紅色沉淀生成；在乙酸、乳酸氧化試驗中菌落周圍產生乳白色的暈圈；產葡萄糖酸試驗中菌落周圍產生透明圈。根據《伯杰細菌鑒定手冊》(第八版)和《常見細菌系統鑒定手冊》，初步確定菌株H3屬于醋桿菌屬(Acetobacter)。

2.2.3 分子生物學鑒定

2.2.3.1 基因片段提取和PCR擴增結果

將提取的DNA片段擴增后，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶如圖3所示，可以看出菌株H3的16S rDNA序列長度約1 500 bp，與預計的片段大小相符，表明DNA提取擴增成功，可進行后續操作。

圖3 菌株H3的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.3 Agarose gel electrophoresis of strain H3

2.2.3.2 核苷酸序列分析

將菌株H3的16S rDNA序列上傳到數據庫中比對，結果如表2所示，通過比對發現H3與序列號為KF030784.1的Acetobacterpomorum的同源性最高，相似度達到99.86%。因而可確定篩選菌株屬于果實醋桿菌(Acetobacterpomorum)。

表2 菌株H3的序列比對結果Table 2 Sequence alignment results of strain H3

2.2.3.3 系統發育樹

通過構建系統發育樹分析菌株H3的親緣關系，結果如圖4所示，菌株H3與A.pomorum處于同一分支，表明親緣關系最近。綜合上述分析結果，最終將菌株H3鑒定為果實醋桿菌(A.pomorum)。

圖4 菌株H3的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain H3

2.3 生長發酵性能的測定

2.3.1 生長曲線的測定

如圖5所示，菌株H3在接種后至10 h生長較為遲緩，處于生長延滯期；在10～20 h生長曲線呈現直線增長的趨勢，處于指數生長期；在20～28 h生長狀態趨于穩定，處于穩定期；而后呈現出略微下降的趨勢，逐步進入衰退期。

圖5 菌株H3的生長曲線Fig.5 Growth curve of strain H3

2.3.2 乙醇對菌株生長發酵的影響

不同體積分數的乙醇對菌株的影響如圖6所示，在發酵產酸方面，菌株H3的產酸量隨乙醇濃度的升高而呈現先升高后下降的趨勢，體積分數6%時產酸量最大，為40.5 g/L；在生長量方面，體積分數3%的乙醇能促進醋酸菌的生長；當乙醇體積分數為9%時，生長量略微下降；而體積分數12%～15%的乙醇則會抑制菌株生長。這種現象可能是由于乙醇體積分數較低時可為醋酸菌提供營養，利于其生長代謝，而體積分數過高，則會損傷醋酸菌的細胞膜，不利于細胞生長。綜合分析，菌株H3可耐受體積分數9%的乙醇。

a-產酸量;b-生長量圖6 不同乙醇含量對菌株產酸量和生物量的影響Fig.6 Effect of different ethanol content on acid production and biomass of strain注：不同小寫字母表示各組之間存在顯著性差異(P<0.05)(下同)

2.3.3 乙酸對菌株生長發酵的影響

不同體積分數的乙酸對菌株的影響如圖7所示。

a-產酸量;b-生長量圖7 不同乙酸含量對菌株產酸量和生物量的影響Fig.7 Effect of different acetic acid content on acid production and biomass of strain

在發酵產酸方面，菌株H3的產酸量隨著乙酸體積分數的增高而呈現出先升高后下降再升高的變化趨勢，體積分數4%時產酸量最大，為70.2 g/L，由于乙酸使發酵液酸度增加，因而測得總酸量包含乙酸的添加量。在生長量方面，隨著乙酸含量的增加，醋酸菌的生長受到不同程度的抑制，這種現象可能是由于酸性環境會影響醋酸菌的相關酶活性，從而影響菌株的生長發酵。綜合分析，菌株H3可耐受體積分數3%的乙酸。

3 結論

本實驗以發酵過程中的醋醅為樣品，利用溴甲酚紫顯色平板結合初篩復篩試驗，篩選出一株產酸量較高、耐受性良好且遺傳性穩定的優良醋酸菌，通過形態觀察、生理生化以及16S rDNA分子生物學鑒定，最終確定該菌株為果實醋桿菌(Acetobacterpomorum)。該菌株在發酵第5天產酸量最高，為44.16 g/L；能夠耐受體積分數9%的乙醇和體積分數3%的乙酸。本實驗由于采用的是自然發酵過程中的醋醅，相較于純種AS1.41和滬釀1.01，篩選菌株的產酸及耐受能力還有待提高，在后續研究中可采用物理或化學誘變的方法進一步選育優良醋酸菌，推動純種液態發酵的食醋工業化生產的發展。