白酒發酵過程中高級醇影響因素的研究

張小娜，宋翠穎，郭世鑫，姚孟琦，馬文瑞，張鳳杰，賈士儒*，李紅*

1(天津科技大學 生物工程學院，天津，300222)2(中國食品發酵工業研究院，北京，100015)3(國家酒類品質與安全國際聯合研究中心，北京，100015)

白酒是以糧食谷物為原料，以酒曲為糖化劑和發酵劑，經過糖化、發酵、蒸餾和勾兌而成的蒸餾酒[1]。高粱是制作白酒的主要原料，且不同產地高粱產出白酒酒體的風格不同[2]。白酒中含有豐富的風味物質，高級醇就是其中重要的一類，高級醇具有高沸點、強揮發性，其主要包括正丙醇、異丁醇、異戊醇、活性戊醇等，是2個碳以上的一元醇類物質的總稱，又被稱作雜醇油[3-4]。研究表明，高級醇的代謝包括埃里希(Ehrlich)途徑[5]和合成代謝(Harris)[6]途徑，Ehrlich代謝機制是在酵母細胞間氨基酸轉氨，再脫羧(去CO2)，最后生成比原氨基酸少1個碳原子的高級醇；Harris途徑是酵母利用糖以α-酮酸及醛為重要中間產物合成高級醇。

高級醇作為風味物質對酒體的貢獻很大[7]，高級醇的種類和含量決定了白酒的香氣特征[8]和口感[9]，適量的高級醇可以使得酒體更加協調、豐滿，高級醇含量過少則會使酒體過于單薄、不夠飽滿，然而過量的高級醇會破壞酒體質量，飲后會產生苦、澀等不愉快的感受，還會因不容易代謝而對神經造成難以修復的損傷，使人產生頭痛、惡心等上頭現象，對人們身體健康造成威脅[10]。因此，調控高級醇的含量對白酒的生產極其重要。

在白酒發酵過程中，白酒的發酵條件影響著雜醇油的含量，如氮源種類[11]、曲糧比例[12]、加糠量以及投糧量[13]等。白酒是通過多種微生物混合發酵、共同作用的產物，雜醇油是酵母發酵的副產物，其產量的多少與酵母代謝途徑息息相關[14]，通過調控微生物來控制高級醇含量也是一個潛在的突破點。因此，可通過工藝條件和微生物的優化來調控高級醇的含量。

本文通過模擬白酒工藝進行固態發酵，對比大曲和小曲對酒體高級醇的影響，進行液態發酵對比酒曲微生物利用葡萄糖發酵的能力，研究不同產地粳高粱、不同加曲量以及曲與釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、異常威克漢姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)、米曲霉(Aspergillusoryzae)3種菌協同合作對白酒高級醇含量的影響，以期為白酒釀造過程中高級醇產生量的調控提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 微生物菌株

釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)N-1、異常威克漢姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)J-1、米曲霉(Aspergillusoryzae)Q-1均為工業生產用優良菌株，中國食品發酵工業研究院實驗室保存。

1.1.2 原料

山西粳高粱、東北粳高粱、小曲、大曲，市售；α-淀粉酶(≥3 700活力單位/g)、糖化酶(≥10萬單位/g)，北京奧博星生物技術有限責任公司。

1.1.3 儀器

固相微萃取進樣器、固相微萃取柱(50/30 μm，DVB/CAR/PDMS)，美國Supelco公司；Clarus 600型GC-MS聯用儀、AutoSystem XL氣相色譜儀、CP-Wax 57CB毛細管色譜柱(50 m×0.25 mm×0.2 μm)，美國PerkinElmer公司。

1.2 測定方法

1.2.1 氣相色譜分析方法[15]

柱溫程序：起始溫度40℃，恒溫2 min，以10 ℃/min程序升溫至60 ℃，以20 ℃ /min程序升溫至120 ℃，以40 ℃/min程序升溫至220 ℃；載氣(高純N2)：流速8 mL/min，分流比1∶1；H2流速45 mL/min；空氣流速450 mL/min；檢測器溫度250 ℃；進樣器溫度240 ℃。

1.2.2 GC-MS對微量風味成分的定量分析[16]

將分析酒樣用超純水降度至10%，移取一定量稀釋后的酒樣于20 mL的頂空瓶中，加入NaCl至飽和后再加入內標儲備液，放入磁力攪拌轉，密封。插入萃取頭，纖維頭置于距離酒樣表面約20 mm的上部空間，攪拌約15 min，在50 ℃水浴溫度下萃取，先預熱15 min，萃取30 min后，取出手柄，直接進樣分析。

GC-MS條件：DB-WAX ETR型色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；柱溫箱升溫程序：初始溫度35 ℃，恒溫2 min，以4 ℃/min升至230 ℃，保持7 min。進樣口溫度250 ℃，載氣He，流速1.0 mL/min，不分流。電子轟擊(electron impact，EI)離子源，電子能量70 eV，傳輸線溫度240 ℃，離子源溫度240 ℃，質量掃描m/z55～500。

1.3 菌液及培養基的制備

1.3.1 酵母種子液制備[17]

一級種子液：從試管斜面接種一環酵母菌于5 mL YPD培養基的20 mL試管中，30 ℃、180 r/min培養12 h。

二級種子液：將1 mL一級種子液轉接入裝有100 mL YPD培養基的250 mL三角瓶中，30 ℃、180 r/min培養12 h，至菌液濃度為107CFU/mL左右。

1.3.2 米曲霉孢子懸浮液制備[18]

霉菌孢子懸浮液的制備：于活化的菌株斜面倒入10 mL無菌水，用接種環刮下斜面上孢子，將孢子打散混勻，用血球計數板計數，進行稀釋，至孢子濃度為108CFU/mL左右[15]。

1.3.3 高粱汁發酵培養基

高梁汁發酵培養基：稱取100 g粉碎高粱(粒度0.45 mm)加入800 mL自來水，蒸煮2 h，冷卻后加入1.35 g α-淀粉酶、0.05 g糖化酶進行糖化、液化處理，攪拌均勻放置于60 ℃水浴鍋中保溫2～3 h，期間使用稀碘液試紙不變藍，繼續加熱煮沸5 min，冷卻后過濾，調整糖度為7°Bx。115 ℃滅菌20 min備用。

1.4 發酵工藝

實驗室模擬白酒固態發酵采取陶罐發酵，工藝如下所示：

原料→粉碎→潤糧→蒸糧→攤晾加水→加曲→入缸發酵→出缸拌糠→裝甑蒸餾→風味檢測

工藝要點如下：將高粱粉碎，粉碎粒度至1.5 mm，稱取粉碎好的1 000 g高粱加入600 mL的85 ℃熱水潤糧24 h，第2天將高粱蒸煮80 min后，加入300 mL冷水，冷卻待溫度降到25～30 ℃時，添加160 g的大曲粉或者小曲粉，將曲和料拌勻后，裝入罐內發酵，將陶罐完全密封，發酵30 d后拌糠蒸餾[19]。

實驗室模擬液態白酒發酵采取三角瓶發酵，根據實驗設計將菌液或曲粉接種于含100 mL高粱汁發酵培養基的三角瓶中，30 ℃靜置培養數天，發酵結束后樣液用1.2.1方法測定高級醇含量，每個實驗重復3次。

1.4.1 小曲、大曲對固態發酵酒的影響

利用小曲、大曲2種酒曲分別按照實驗室模擬固態白酒發酵方法進行，用1.2.2方法檢測酒樣風味成分。

1.4.2 粳高粱產地對液態發酵小曲酒的影響

按照1.3.1方法分別制備山西粳高粱、東北粳高粱發酵培養基。加入清香小曲2 g，按照實驗室模擬液態白酒發酵方法發酵1～7 d后取樣分析。

1.4.3 加曲量對液態發酵小曲酒的影響

加曲量按曲糧比為(2%、4%、6%、8%、10%，質量分數，下同)分別按照1.4中實驗室模擬液態白酒發酵方法進行，發酵5 d后取樣分析。

1.4.4 曲與微生物對液態發酵大曲酒的影響

按照實驗室模擬液態白酒發酵方法進行，在高粱汁中接種大曲、異常威克漢姆酵母、釀酒酵母的二級種子液和米曲霉的孢子懸浮液按照表1添加量進行發酵。

表1 微生物接種量與大曲加樣量Table 1 Microbial inoculation and Daqu dosing

1.5 數據處理

實驗數據采用Origin、Excel 2019和SPSS 26.0進行數據處理和分析。

2 結果與分析

2.1 小曲、大曲對固態發酵酒的影響

小曲、大曲對固態發酵白酒的總高級醇、總醛、總酯含量如圖1所示，總酯是乙酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸異戊酯、油酸乙酯、亞油酸乙酯、乳酸乙酯、辛酸乙酯、己酸乙酯、棕櫚酸乙酯含量的總和;總高級醇為仲丁醇、正丁醇、異戊醇、異丁醇、正丙醇、活性戊醇、苯乙醇、正己醇8種高級醇的總和；總醛含量是乙醛、丙醛、異丁醛、乙縮醛、異戊醛、苯甲醛含量的總和。大曲酒總高級醇、總酯、總醛的含量均高于小曲酒，所以大曲酒相比較于小曲酒醇香馥郁、回味甘甜。由于二者中所富含的微生物種類、數量、性能不同，利用小曲、大曲釀出的酒的高級醇含量也有很大差異的，酒曲的種類不同會影響到白酒中高級醇的含量。

圖1 小曲、大曲酒的高級醇總和、總酯、總醛對比Fig.1 Comparison of the total higher alcohols, total ester and total aldehyde of Xiaoqu and Daqu Baijiu

小曲、大曲對固態發酵白酒的高級醇含量影響如表2所示，總高級醇含量是仲丁醇、正丙醇、異丁醇、正丁醇、活性戊醇、異戊醇、苯乙醇、正己醇的含量的總和。大曲酒的總高級醇含量為(1 099.47±113.71) mg/L，小曲酒總高級醇含量為(857.50±78.13) mg/L，高出了28.2%。大曲酒中正丙醇、異丁醇、異戊醇的含量高于小曲酒，而正丁醇、苯乙醇和活性戊醇的含量低于小曲酒。

表2 小曲、大曲對固態發酵白酒醇類物質的影響 單位：mg/LTable 2 Effects of Daqu and Xiaoqu on alcohols of solid fermented Baijiu

2.2 不同產地粳高粱對液態發酵小曲酒的影響

如圖2所示，同樣是粳高粱，小曲在不同產地的粳高粱汁中發酵時產高級醇的含量不同。隨著發酵時間的變化，小曲在山西粳高粱汁中發酵了2 d達到峰值后總高級醇含量呈遞減趨勢，到第5天時總高級醇含量升高后繼續下降，而在東北粳高粱汁中發酵時總高級醇含量呈遞減趨勢，東北粳高粱發酵1天所產高級醇含量比山西粳高粱高3.5倍，總高級醇含量相差最大。

圖2 液態發酵中不同產地粳高粱產總高級醇含量Fig.2 Content of total higher alcohol produced by japonica sorghum of different origins during liquid fermentation注：總高級醇為異戊醇、異丁醇、正丙醇3種主要高級醇的總和

造成此現象原因可能是不同高粱的淀粉結構和含量間的差異，東北粳高粱所含的淀粉更容易被微生物分解利用，同時產生酒精和副產物高級醇[20]。發酵前期可能由于淀粉含量較高，利用較充分，發酵到5 d時山西粳高粱中淀粉含量略高于東北粳高粱，也可能是由于不同高粱中的單寧含量不同從而對微生物種群產生了一定的影響[21]。

2.3 不同加曲量對液態發酵小曲酒的影響

以山西高粱為原料用小曲進行液態發酵，通過添加不同曲料比探究對高級醇含量的影響(圖3)。曲料比在4%時3種高級醇的含量最高，而曲料比在2%時產高級醇含量最少，曲料比在6%、8%、10%時3種高級醇的總含量相差不大。曲料比在2%時所產的3種高級醇含量的總和比曲料比在4%時低98.4%。造成該現象的原因可能是在曲料比為2%時，由于加曲量太少，富集的微生物含量過少從而產高級醇較少。在曲料比為6%、8%、10%時，由于加曲量過多從而富集微生物過多，導致微生物之間相互競爭進而生長受到抑制，最終導致產高級醇的微生物存活量較少，進一步減少了微生物分解氨基酸或利用葡萄糖過程中高級醇的生成。曲料比為4%時，各微生物之間可能達到平衡或互利模式，使得微生物的生長到達最適狀態，從而產高級醇較高。因此在工藝優化中可以通過調節曲料比來控制高級醇含量。

圖3 不同加曲量對產高級醇的影響Fig.3 Effect of Daqu content on the production of higher alcohols

2.4 曲與微生物對液態發酵大曲酒的影響

不同曲與菌種液態發酵的高級醇含量如圖4-a～圖4-c所示，在大曲、各菌種單獨發酵時，異常威克漢姆酵母J-1產異戊醇和異丁醇的能力低于釀酒酵母N-1，產正丙醇的能力高于釀酒酵母N-1。米曲霉Q-1高級醇產量最低，釀酒酵母N-1發酵產3種高級醇總含量最高(圖4-d)，說明釀酒酵母N-1充分利用高粱汁的碳源生成高級醇的能力最強。

a-異戊醇；b-異丁醇；c-正丙醇；d-3種高級醇總含量圖4 大曲和菌種液態發酵對高級醇的影響Fig.4 Effect of liquid fermentation of Daqu and strains on higher alcohols注：G-大曲；J-異常威克漢姆酵母J-1；N-釀酒酵母N-1；Q-米曲霉Q-1；不同字母表示差異顯著(P<0.05)

如圖4-d所示，大曲和米曲霉Q-1共同發酵時相對于大曲單獨發酵，高級醇含量有所提高，可能因為米曲霉Q-1與大曲中微生物協同產生了代謝產物高級醇[22]；大曲和釀酒酵母N-1共同發酵時，高級醇含量相比大曲單獨發酵時有顯著的上升，但比釀酒酵母N-1菌種單獨發酵時的產量低，可能由于其過度增殖，而大曲中的微生物與其有競爭關系，導致釀酒酵母N-1細胞量減少，從而降低了高級醇含量；大曲和異常威克漢姆酵母J-1共同發酵時產高級醇量相比大曲單獨發酵時低，是因為微生物間相互抑制，導致產高級醇的微生物存活率較低，降低了高級醇的含量。

酵母與大曲中產高級醇的微生物共同發酵時有抑制作用，大曲與釀酒酵母N-1、異常威克漢姆酵母J-1混合發酵時高級醇含量顯著低于大曲單獨發酵時。釀酒酵母N-1和異常威克漢姆酵母J-1共同發酵產高級醇的含量明顯要低于釀酒酵母N-1單獨發酵時，說明2種酵母共同發酵時存在競爭關系。

大曲與米曲霉Q-1、釀酒酵母N-1和異常威克漢姆酵母J-1共同發酵時比3種菌株混合發酵時產異戊醇、異丁醇和正丙醇的含量分別降低了53.88%、47.77%、88.57%，但比大曲和釀酒酵母N-1、異常威克漢姆酵母J-1混合發酵時的異戊醇和異丁醇含量分別增加了73.79%和60.30%，說明米曲霉Q-1產生的蛋白酶對大曲和釀酒酵母N-1、異常威克漢姆酵母J-1共同發酵時利用氨基酸產異戊醇和異丁醇起到了促進作用。米曲霉Q-1、釀酒酵母N-1和異常威克漢姆酵母J-1共同發酵時與釀酒酵母N-1和異常威克漢姆酵母J-1混合發酵時相比，所產異戊醇、異丁醇分別降低了5.17%和4.20%，正丙醇增加了1.96%，說明米曲霉Q-1對2種酵母混合發酵產高級醇沒有顯著影響。

3 結語

通過改變酒曲種類、產地釀酒原料、加曲量以及微生物等多個因素模擬白酒發酵實驗結果發現：利用小曲釀酒和大曲釀酒酯類和醇類物質產量差別較大，小曲發酵產高級醇含量較少，可能是因為小曲富含的微生物種類、數量、性能與大曲的不同，因此后期可通過篩選小曲中優良菌種再添加到大曲中進行發酵釀酒進而調控酒中高級醇含量。

隨著發酵時間的變化，小曲在山西粳高粱汁中發酵2 d時達到峰值后總高級醇含量呈持續遞減趨勢，到發酵5 d時總高級醇含量升高后繼續下降，而在東北粳高粱汁中發酵時總高級醇含量呈遞減趨勢，東北粳高粱發酵1 d所產高級醇含量比山西粳高粱高3.5倍，總高級醇含量相差最大。

曲料比的不同對高級醇含量有一定的影響，實驗發現曲料比為4%時3種高級醇的含量最高，曲料比在2%時產高級醇含量最少，曲料比在6%、8%、10%時3種高級醇的總含量相差不大，而曲料比在2%時所產的3種高級醇含量的總和比曲料比在4%時低98.4%。

與大曲單獨發酵時相比，大曲和米曲霉Q-1共同發酵、大曲和釀酒酵母N-1共同發酵時，產高級醇的量有所增加；大曲和異常威克漢姆酵母J-1共同發酵，大曲與釀酒酵母N-1、異常威克漢姆酵母J-1共同發酵的高級醇產量降低。米曲霉Q-1、釀酒酵母N-1和異常威克漢姆酵母J-1共同發酵時與釀酒酵母N-1和異常威克漢姆酵母J-1混合發酵時相比高級醇產量沒有顯著變化，說明米曲霉Q-1對2種酵母混合發酵產高級醇沒有顯著影響。米曲霉Q-1產生的蛋白酶對大曲和釀酒酵母N-1和異常威克漢姆酵母J-1發酵利用氨基酸產異戊醇和異丁醇起到了促進作用。