右旋糖酐40制備過程中細菌內毒素含量的影響因素

問清江, 慕 娟, 孫曉宇, 鄭巧霞, 丁 浩

(陜西省微生物研究所,陜西 西安 710043)

右旋糖酐40(Dextran 40)是臨床醫學最常用的血漿代用品,靜脈注射后可以提高血漿膠體滲透壓,吸收血管外的水分而增加血容量,從而維護血壓,擴充血容量,還可使已經聚集的紅細胞和血小板解聚,降低血液黏滯性,改善人體血液微循環,具有防止彌散性血管內凝血的作用,主要用于治療失血性休克[1-11]。細菌內毒素(Endotoxin)是革蘭陰性菌細胞壁的脂多糖(Lipopolysaccharde,LPS),主要由菌體死亡解體釋放。 內毒素是常見的外源性致熱原,屬于強免疫刺激因子,進入機體后能導致嚴重的炎癥級聯反應,從而引起一系列的病理生理反應,在極微量的情況下便可引起人體白細胞減少、微循環障礙、全身炎癥反應、發熱、低血壓、心動過速、多器官功能衰竭甚至死亡等嚴重不良反應。所以,在藥物尤其是注射劑的生產中,細菌內毒素的去除和嚴格控制非常重要,關乎人們的生命安全[12-14]。LPS是一個結構復雜的大分子物質,但是不同種類革蘭陰性菌的LPS均有共同組成部分。LPS分子結構大致分為O-特異性鏈(O-抗原)、核心多糖(核心區)、類脂A 三個部分(圖1)。類脂A 由氨基葡萄糖、磷酸和脂肪酸組成,是脂多糖不可缺少的組成部分,幾乎參與內毒素介導的所有生物活性。核心區和O-抗原具有親水性,類脂A具有疏水性。在水中分子量約為50～500 kDa。細菌內毒素的計量單位為活性單位(endotoxin units,EU)[16-17]。 目前,我國右旋糖酐40原料藥的產品標準中還沒有內毒素含量指標,但是美國、英國和歐洲的同類產品中具有內毒素指標(≤10 EU/g),因此造成我國的右旋糖酐40的產品質量與美國、英國和歐洲存在差距,使用藥物安全性存在隱患[18-20]。我們在改進右旋糖酐40原料藥生產新工藝研究過程中,將細菌內毒素也作為一個指標,對乙醇分級沉淀、超濾膜分離[21-28]及其他相關因素進行了研究,初步探索了細菌內毒素的結構、分子大小等與右旋糖酐40制備過程中的相互關系,最終使得右旋糖酐40原料藥的細菌內毒素含量達到國際標準。

圖1 細菌內毒素的典型結構示意[15]Fig.1 Schematic diagram of endotoxin structure[15]a：細菌內毒素結構;b：類脂A分子結構a：Endotoxin structure;b：Mdecular structure of lipid A

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 腸膜狀明串珠菌Leuconstocmesenteriodes-1226 (Lm-1226)由中國藥品生物制品檢定所提供。

1.1.2 主要試劑與儀器設備 白砂糖(一級,孟連昌裕糖業有限責任公司);右旋糖酐酶(Y200301,寧夏夏圣實業集團有限公司);鱟試劑(湛江博康海洋生物有限公司);細菌內毒素檢測用水(湛江博康海洋生物有限公司);其他試劑為市售分析純。生化培養箱(SPX-150BIII,天津泰斯特儀器有限公司);隔水式培養箱(GH-500,北京科偉永興儀器有限公司);實驗膜分離設備(LABSTAR UF5,北京安石環境工程有限公司);分光光度計(722,上海精密科學儀器有限公司);糖度計(WYT-J,成都豪創光電儀器有限公司);數顯恒溫磁力攪拌器(85-2,杭州儀表電機有限公司);電熱鼓風干燥箱(101,北京科偉永興儀器有限公司);高效液相色譜儀(2010A-HT,蘇州貝銳儀器科技有限公司);內毒素凝膠法測定儀 (ET-96,天津市天大天發科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 右旋糖酐的酶解 將腸膜狀明串珠菌Lm-1226的斜面種子接入種子培養基,25 ℃培養36 h,種子液接入發酵培養基培養28 h;發酵結束后直接加入右旋糖酐酶進行酶解(酶濃度0.19 IU/mL,溫度50 ℃,時間3.5 h);加入1%(質量分數)的活性碳繼續攪拌保溫40 min過濾,收集濾液為酶解待分離液。

1.2.2 乙醇沉淀分離純化右旋糖酐40的制備 取一定量的1.2.1中的酶解待分離液,按照42%～46%(體積分數)加入乙醇,攪拌均勻,40 ℃放置12 h,傾出大部分上清液,剩余部分離心分離,沉淀部分為大分子等雜質,收集上清液進一步乙醇沉淀分離純化;按照50%～60%加入乙醇,攪拌均勻,室溫放置24 h,傾出上清液,收集沉淀,用75%乙醇洗滌沉淀3次,60 ℃烘干,粉碎為右旋糖酐40成品備用。

1.2.3 右旋糖酐發酵液的預處理及酸水解 將稀釋后的右旋糖酐發酵液經板框過濾、陶瓷膜濾過及5 kDa 超濾截流濃縮為右旋糖酐發酵液處理液;然后在0.08%(質量分數)鹽酸,95～100 ℃條件下水解3.0 h;加入1%(質量分數) 的活性碳繼續攪拌保溫40 min過濾,收集濾液為待分離液。

1.2.4 超濾分離純化右旋糖酐40的制備 將1.2.3中的待分離液進行超濾分離純化。①100 kDa+5 kDa、100 kDa+10 kDa和100 kDa+20 kDa二膜組合超濾,首先經100 kDa膜超濾得截留液并制備成干品,濾過液繼續經5 kDa(或10、20 kDa)膜超濾,截留液制備成干品;②100 kDa+20 kDa+50 kDa三膜組合超濾,首先經過100 kDa膜超濾,截留液制備成干品,濾過液繼續經20 kDa膜超濾,截留液再經50 kDa膜超濾,截留液和濾過液均制備成干品。截留液用 60%乙醇沉淀、干燥、粉碎備用;濾過液通過減壓濃縮,用50%～60%乙醇沉淀,干燥,粉碎備用。

1.2.5 細菌內毒素的測定[18,29-30]根據公式 MVD=(c·L)/λ(MVD代表溶液最大稀釋倍數,c代表溶液濃度,L代表內毒素限值,λ代表鱟試劑靈敏度)計算出相應稀釋倍數,用內毒素檢查用水依次梯度進行稀釋,并及時用封口膜封住試管口。準確稱取適量待測右旋糖酐40固體樣品,加入細菌內毒素檢查用水進行超聲溶解,得右旋糖酐40樣品原液,將其適當稀釋后檢測,按照濃度計算限值(右旋糖酐固體樣品假設MVD=1)。

1.2.6 分子量與分子量分布[18]取右旋糖酐40樣品適量，加流動相溶解并稀釋制成每1 mL約含10 mg的溶液，振搖，室溫放置過夜作為供試品溶液。另取 4～5 個已知分子量的右旋糖酐對照品，依法檢查(2020 版《藥典》四部通則0514)，樣品 10%大分子部分重均分子量不得大于120 000，10%小分子部分重均分子量不得小于5 000。

2 結果與分析

2.1 乙醇沉淀分離純化右旋糖酐40

2.1.1 不同濃度乙醇沉淀分離純化右旋糖酐40對細菌內毒素含量的影響 右旋糖酐發酵液在右旋糖酐酶作用下,降解為一定分子量分布的酶解液,經活性炭吸附除雜并收集濾液,將濾液進行乙醇分級沉淀分離純化成右旋糖酐40,并對分離純化的樣品進行細菌內毒素檢測,同一待分離右旋糖酐溶液選擇不同濃度乙醇沉淀分離右旋糖酐40,乙醇濃度對右旋糖酐40細菌內毒素含量的影響見表1;乙醇分級沉淀分離純化右旋糖酐40采取一次沉淀除雜,二次沉淀右旋糖酐40的方法,由于出發右旋糖酐溶液不同導致相同乙醇濃度沉淀產品細菌內毒素含量不同(表2)。結果表明,同一待分離液選取不同濃度的乙醇進行分離純化,隨著乙醇濃度的增加,相應沉淀產品的細菌內毒素含量逐漸降低;在乙醇分步沉淀中,隨著乙醇濃度逐級提高,分離產品的細菌內毒素含量隨之降低。細菌內毒素是一種脂多糖,其由O-特異性鏈(O-抗原)、核心多糖(核心區)、類脂A 三個部分構成(圖1),核心區和O-抗原為親水性,類脂A為疏水性,在水溶液中呈聚集狀態。乙醇濃度的高低決定了細菌內毒素在溶液中的溶解性,乙醇濃度越高,溶液中的細菌內毒素含量越高,沉淀中的細菌內毒素含量越低。右旋糖酐是醇不溶性物質,隨著乙醇濃度的提高,溶解性降低;而且分子量越大,沉淀乙醇濃度越低,因此可以通過不同乙醇濃度逐級分離純化不同分子量的右旋糖酐。在保證右旋糖酐40重均分子量和分子量分布的前提下,可以通過乙醇再沉淀分離去除細菌內毒素,提高產品品質。

表1 乙醇濃度對右旋糖酐40細菌內毒素含量的影響

表2 乙醇分步沉淀對右旋糖酐40細菌內毒素含量的影響Table 2 Effect of ethanol step precipitation on endotoxin content of dextran 40

2.1.2 右旋糖酐40分離純化用水等對細菌內毒素含量的影響 將右旋糖酐40粗品加水溶解為10%溶液,按照乙醇濃度45%～50%一次沉淀除雜,再按照51%～59%二次沉淀制備右旋糖酐40。在分離純化過程中分離純化產品細菌內毒素沒有降低,反而出現雜亂升高的異常情況(表3)。分析這一現象首先從環境因素著手,如稱量樣品、溶解、乙醇沉淀、干燥等操作過程暴露于開放環境中的,空氣中的細菌落入試液和成品可能引入細菌內毒素;使用非潔凈的試驗器具,因器具污染也會引入細菌內毒素。因此,在非無菌環境中盡可能減少空氣中的暴露及污染等有可能造成細菌內毒素引入的發生,分離過程中盡可能避免環境影響(表3),以改善細菌內毒素含量雜亂的現象,明確了環境因素是引起分離純化細菌內毒素異常的原因之一;但是終產品的細菌內毒素仍然高于出發品,分析分離純化用水可能存在問題,于是對實驗室去離子水進行細菌內毒素含量檢測(表4),去離子水細菌內毒素含量最高<56.25 EU/mL(存放時間30 d),最低<3.125 EU/mL,按照后者計算,每1 g右旋糖酐粗品分離純化時因水引入細菌內毒素31.25 EU,純化用水會影響到右旋糖酐40分離純化中細菌內毒素的指標。因此右旋糖酐40分離純化時不僅要考慮環境因素,而且需要選擇細菌內毒素含量達標的純化用水。

表4 水中細菌內毒素含量

2.1.3 右旋糖酐40的分離純化 用細菌內毒素含量<0.125 EU/mL的娃哈哈純凈水替代實驗室去離子水進行右旋糖酐40的分離純化(表5),結果大大改善了細菌內毒素的去除效果,所有終產品的細菌內毒素含量均<6.00 EU/g,最低含量<3.00 EU/g,優于國際標準(≤10 EU/g);分離純化的右旋糖酐40的重均分子量和分子量均符合《中國藥典》(2020版二部)質量標準(重均Mr 32 000～42 000,10%大分子Mr≤120 000,10%大分子Mr≥5 000)。

表5 乙醇沉淀分離純化右旋糖酐40結果

2.2 超濾分離純化右旋糖酐40對細菌內毒素含量的影響

將右旋糖酐發酵液經過板框過濾、陶瓷膜微濾及超濾預處理,鹽酸水解和活性炭吸附除雜為待分離溶液。通過100 kDa+5 kDa、100 kDa+10 kDa和100 kDa+20 kDa二膜組合和100 kDa+20 kDa+50 kDa三膜組合超濾分離純化右旋糖酐40,對其相應成品進行內毒素檢測分析(表6、7)。100 kDa超濾膜與5 kDa、10 kDa和20 kDa分別組合成二次超濾,隨著第二次超濾膜截留分子量的增大,去除細菌內毒素的效果增強,分離純化的終產品中的細菌內毒素含量降低,100 kDa+20 kDa超濾分離純化的右旋糖酐40的細菌內毒素含量有望達到10 EU/g以下;100 kDa+20 kDa+50 kDa三膜組合超濾分離純化右旋糖酐40的細菌內毒素含量達到3 EU/g以下,重均分子量及分子量分布達到《中國藥典》(2020版二部)標準。超濾分離純化右旋糖酐40及細菌內毒素的去除與其分子量大小不同有關,右旋糖酐40的重均分子量為32 000～42 000,細菌內毒素的分子量為50～500 kDa,二者之間存在差異,通過對超濾膜進行組合,最終達到分離純化右旋糖酐40的目標,在重均分子量和分子量分布保證的前提下,細菌內毒素含量優于國際標準(≤10 EU/g)。右旋糖酐水解處理液經過100 kDa+20 kDa+50 kDa三膜組合超濾分離純化(首先經過100 kDa膜超濾,濾過液繼續經20 kDa膜超濾,截留液再經50 kDa膜超濾),其濾過液濃縮、乙醇沉淀制備成右旋糖酐40,細菌內毒素含量和分子量分布雙達標。

表6 二膜組合超濾分離純化對右旋糖酐40細菌內毒素含量的影響

表7 三膜組合超濾分離純化對右旋糖酐40細菌內毒素含量的影響

3 討 論

目前,我國右旋糖酐40分離純化主要采用乙醇分級沉淀法,為了與國際接軌,將細菌內毒素引入右旋糖酐40原料藥的質量標準。首先需要對乙醇分離純化過程中對細菌內毒素含量的影響因素進行探究。通過乙醇濃度對右旋糖酐40細菌內毒素含量的影響及乙醇分步沉淀對右旋糖酐40細菌內毒素含量的影響研究發現,細菌內毒素分子結構中疏水性類脂A決定了其水溶液中的聚集狀態及乙醇溶液中的溶解性,乙醇濃度越高,溶液中的細菌內毒素含量越高,沉淀中的細菌內毒素含量越低,可以通過不同乙醇濃度逐級分離純化不同分子量的右旋糖酐40而達到分離純化的目的,同時去除細菌內毒素,提高產品品質。針對分離純化過程中出現的細菌內毒素異常情況,通過進行環境因素和純化水對細菌內毒素的影響研究發現,二者均會影響細菌內毒素的去除,因此控制好這兩個方面從而保證右旋糖酐40的分離純化,使產品的分子量分布和細菌內毒素含量雙達標。選用細菌內毒素含量達標的純凈水進行右旋糖酐40的分離純化,產品的細菌內毒素含量均<6.00 EU/g,最低含量<3.00 EU/g,優于國際標準(≤10 EU/g),重均分子量和分子量均符合《中國藥典》(2020版二部)質量標準。超濾也用于右旋糖酐40的分離純化,根據分子量大小的不同,通過不同截留分子量的膜將右旋糖酐分離為不同分子量的產品,細菌內毒素是大分子的脂多糖(LPS)物質,其水中分子量約為50～500 kDa。首先通過100 kDa+5 kDa、100 kDa+10 kDa和100 kDa+20 kDa二膜組合超濾,產品細菌內毒素含量隨著二次超濾膜截留分子量的增大而減小,100 kDa+20 kDa超濾分離純化的右旋糖酐40的細菌內毒素含量有望達到10 EU/g以下。經過100 kDa+20 kDa+50 kDa三膜組合超濾分離純化,右旋糖酐40的細菌內毒素含量達到3 EU/g以下,重均分子量及分子量分布達到《中國藥典》(2020版二部)標準。總之,在現有的右旋糖酐40生產工藝路線基礎上,進行一些工藝條件的改善和控制,細菌內毒素含量可以作為右旋糖酐40原料藥質量指標,而且可以達到和超過國際最高標準,為右旋糖酐40大輸液制劑等的生產減少安全負荷,提高產品品質,降低藥物不良反應的潛在風險。