朱砂根葉綠體全基因組解析及系統(tǒng)發(fā)育分析

劉雄偉 劉暢 曾憲法 楊小英 俸婷婷 趙杰宏 周英

（貴州中醫(yī)藥大學藥學院 藥食兩用資源應(yīng)用與開發(fā)研究中心，貴陽 550025）

朱砂根為紫金牛屬植物朱砂根（Ardisia crenata）的干燥根或根莖，至今有多年的民間藥用歷史，其含有三萜類、黃酮類、香豆素類等多種化學成分，具有清熱解毒、散瘀止痛功效，主要用于治療咽喉腫痛、扁桃體炎等病癥。對本草著作中紫金牛屬藥物進行基原考，《本草綱目》及《圖考》記載的“朱砂根”是指葉背紅色的紅涼傘，其鮮根斷面皮部有多個朱砂色小點［1］。紅涼傘（Ardisia crenatavar.bicolor）與朱砂根在植株外形上無大差別，僅葉背、花梗、花芬及花瓣均帶紫紅色而有所不同，F(xiàn)lora of China中紅涼傘已合并至朱砂根，但僅僅是從形態(tài)學方面判斷紅涼傘為朱砂根的變種尚缺乏科學的依據(jù)。對朱砂根和紅涼傘進行性狀鑒別、顯微鑒別、DNA條形碼、遺傳變異等研究［2-5］，表明朱砂根和紅涼傘親緣關(guān)系較近，但已有DNA 條形碼序列分辨率較低，并不能很好地明確物種界限，未能理清朱砂根和紅涼傘的進化演變，對其起源、擴張和遷移的過程，種內(nèi)遺傳變異空間分布與環(huán)境條件關(guān)系等尚不清楚，其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系尚不明朗。

葉綠體基因組序列的結(jié)構(gòu)、大小和順序相對穩(wěn)定，并且突變率較緩慢［6］，是系統(tǒng)發(fā)育研究和物種鑒定有效工具之一［7］，其突變熱點區(qū)域已經(jīng)被用于物種及物種以下水平（品種）親緣關(guān)系研究［8-9］。隨著第二代測序技術(shù)（next generation sequencing）的興起，葉綠體基因組在解析植物系統(tǒng)進化發(fā)育關(guān)系研究中得到廣泛應(yīng)用，如青牛膽［10］、白頭翁［11］、牛蒡［12］、罌粟［13］等已經(jīng)完成了葉綠體基因組分析，對其系統(tǒng)發(fā)育和親緣關(guān)系進行研究。針對紫金牛屬物種系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系尚不清楚的問題，對紫金牛屬百兩金Ardisia crispa、走馬胎Ardisia gigantifolia、紐子果Ardisia polysticta、朱砂根A.crenata、紫金牛Ardisia japonica、虎舌紅Ardisia mamillata、雪下紅Ardisia villosa、皺葉紫金牛Ardisia bullata等進行葉綠體基因組測序，解析其物種進化關(guān)系，同時發(fā)現(xiàn)紫金牛屬與長柱金牛屬親緣關(guān)系較近［14-17］。但關(guān)于紫金牛屬歸屬于紫金牛科還是報春花科尚且存在爭議［14-17］，同時2020 版《中國藥典》認為藥材朱砂根為紫金牛科植物朱砂根的干燥根。植物化學方面研究表明紫金牛科與報春花科在親緣關(guān)系上是相近的科（http://www.iplant.cn/info/Primulaceae），將紫金牛屬合并到報春花科，這種分類方法是否科學合理尚缺乏科學依據(jù)。

因此，本研究對不同地區(qū)朱砂根A.crenata、紅涼傘A.crenatavar.bicolor3 個紫金牛屬物種的新鮮葉片進行葉綠體基因組測序，解析其葉綠體基因組序列與結(jié)構(gòu)特征，篩選種間高變異序列；同時下載紫金牛科和報春花科代表性葉綠體全基因組序列信息，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，進而為紫金牛屬藥用植物的分類鑒定、遺傳進化關(guān)系及資源開發(fā)利用等提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

朱砂根（貴州）和紅涼傘新鮮葉片采自貴州中醫(yī)藥大學種質(zhì)資源圃，朱砂根（江西）新鮮葉片采自江西武功山，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學魏升華教授鑒定為朱砂根A.crenata、紅涼傘A.crenatavar.bicolor。取新鮮健康葉片，用無菌水沖洗干凈，晾干后置于-80℃冰箱保存。通過NCBI 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）檢索報春花目的紫金牛科和報春花科的23 個葉綠體全基因組序列信息，共檢索到紫金牛科紫金牛屬14 個種、蠟燭果屬1 個種、酸藤子屬2 個種、鐵仔屬3 個種及報春花科報春花屬3 個種的信息（表1）。

表1 紫金牛科和報春花科物種的葉綠體基因組GenBank 登記號Table 1 Chloroplast GenBank accession numbers of the species in Myrsinaceae and Primulaceae

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA 提取與測序 利用植物基因組DNA 提取試劑盒（TIANGEN，北京）提取總DNA，0.8%瓊脂糖電泳檢測DNA 樣品是否有降解及雜質(zhì)，Nanodrop 分光光度計檢測樣品濃度及純度。檢測合格的DNA 樣品根據(jù)Illumian DNA 文庫構(gòu)建流程，構(gòu)建插入片段大小為350 bp 的雙末端測序文庫。對質(zhì)檢合格測序文庫，利用Illumina Novaseq6000 高通量測序平臺進行測序。測序結(jié)果經(jīng)CASAVA 軟件進行堿基識別（base calling）后轉(zhuǎn)化為原始測序序列（raw reads），利用NGS QC ToolKit 軟件對raw reads 進行質(zhì)控，過濾去除接頭和低質(zhì)量序列，得到高質(zhì)量序列（clean reads）。

1.2.2 葉綠體全基因組序列組裝、拼接與注釋 采用SPAdes v.3.15.2 軟件（http://cab.spbu.ru/software/spades/）對葉綠體基因組序列進行拼接組裝，利用CpGAVAS［18］和ORF Finder 對葉綠體基因組進行注釋。對注釋的初步結(jié)果，運用Blastn 和Blastp 的方法與已報道的近緣物種葉綠體基因組編碼蛋白和rRNA 進行比對，驗證結(jié)果的準確性并進行修正。tRNA 的注釋采用ARWEN［19］軟件進行注釋，生成tRNA 二級結(jié)構(gòu)圖。利用OGDRAW［20］軟件繪制葉綠體基因組環(huán)狀結(jié)構(gòu)圖。

1.2.3 SSR 和重復序列分析 利用MISA 在線軟件（https://webblast.ipk-gatersleben.de/misa/index.php）分析微衛(wèi)星序列（SSR）［21］，參數(shù)閾值設(shè)置為：1、2、3、4、5、6，核苷酸參數(shù)為8、4、4、3、3、3，且兩個SSRs 之間的距離不小于100 bp，并對SSRs 的類型、數(shù)量等進行分析。利用REPuter（https://bibis erv.cebitec.uni-bielefeld.de/reputer）在線工具對長重復序列進行分析［22］。

1.2.4 葉綠體全基因組比較及共線性分析 利用mVISTA 軟 件（https://genome.lbl.gov/vista/mvista/submit.shtml）在Shuffle-LAGAN（全局比對模式）下［23］，以本研究新獲得的朱砂根葉綠體基因組為參考，對紫金牛屬其它物種葉綠體全基因組序列同源性進行比較分析；采用 Geneious10.2.2 軟件中Mauve多重基因組比對法檢測紫金牛物種的葉綠體基因組的重排和共線性［24］，包括月月紅A.faberi、虎舌紅A.mamillata、雪下紅A.villosa、走馬胎A.gigantifolia和酸苔菜A.solanacea。

1.2.5 系統(tǒng)進化分析 選擇已發(fā)表的紫金牛科葉綠體基因組為內(nèi)類群和與紫金牛科親緣關(guān)系較近的3個報春花科植物鐘花報春P.sikkimensis、鄂報春P.obconica、騰沖燈臺報春P.chrysochlora為外類群，構(gòu)建最大似然（maximum likelihood，ML）系統(tǒng)發(fā)育樹。利用MAFFT 7（https://mafft.cbrc.jp/alignment/server/）在線軟件對其葉綠體基因組進行全基因組比對［25-26］，采用IQ-TREE 2.0.5（http://www.iqtree.org/）軟件［27］，基于最大似然法，通過比較不同樣本葉綠體基因組序列的差異構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，25 條序列共包含8 867 個簡約性信息位點（parsimonyinformative），6 759 個自裔位點（singleton sites），136 494 個不變位點（constant sites），構(gòu)樹參數(shù)設(shè)置為：-s .fasta -st DNA -m TEST -bb 1 000 -alrt 1 000-abayes，優(yōu)構(gòu)樹模型為：TVM+F+I+G4。

2 結(jié)果

2.1 朱砂根及紅涼傘葉綠體基因組基本特征

葉綠體基因組圖譜顯示朱砂根及紅涼傘葉綠體基因組均為雙鏈環(huán)形結(jié)構(gòu)（圖1），包括大單拷貝區(qū)（large single copy region，LSC）、小單拷貝區(qū)（One small single copy region，SSC）、反向重復區(qū)（reverse repeat regions，IRa）和反向重復區(qū)（reverse repeat regions，IRb）4 個邊界區(qū)，4 個邊界區(qū)長度大小基本一致，GC 含量無差異（表2）。相比于LSC 和SSC區(qū)，IR 區(qū)的GC 含量最高，可能是由于IR 區(qū)含有高GC 含量的RNA 基因造成。

表2 朱砂根及紅涼傘葉綠體基因組基本信息統(tǒng)計Table 2 Basic information statistics of chloroplast genomes between A.crenata and A.crenata var.bicolor

圖1 葉綠體基因組圖譜Fig.1 Chloroplast genome map

2.2 朱砂根及紅涼傘葉綠體基因組功能及分類

在朱砂根和紅涼傘葉綠體全基因組序列中注釋得到132 個基因（表3），包括87 個蛋白編碼基因、37 個tRNA 基因和8 個rRNA 基因，主要分為光合作用基因、復制基因、未知功能基因以及乙酰輔酶A 羧化酶亞基（accD）、成熟酶基因（matK）、其他基因。有 10 個蛋白質(zhì)編碼基因ndhB、rpl2、rpl23、rps12、rps7、ycf15、ycf2，7 個 tRNA 編碼基因及4個 rRNA 編碼基因位于 IR 區(qū)。

表3 朱砂根及紅涼傘葉綠體基因組分類Table 3 Chloroplast genome classification between A.crenata and A.crenata var.bicolor

對葉綠體基因內(nèi)含子進行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，共有15 個基因含有內(nèi)含子，其中ycf3和clpP蛋白質(zhì)編碼基因含有 2 個內(nèi)含子。

2.3 朱砂根及紅涼傘葉綠體基因組長重復序列及簡單重復序列分析

利用REPuter 在線工具對的長重復序列進行分析。朱砂根和紅涼傘均有50 個長重復序列，包括正向重復（forward，F(xiàn)）、回文重復（palindrome，P）、反 向重復（reverse，R）和互補重復（complement，C），但其類型個數(shù)稍有不同（表4）。簡單重復序列（simple sequence repeat，SSRs）分析表明（表5），朱砂根共有207 個SSRs 位點，紅涼傘有205 個SSRs位點，均為未發(fā)現(xiàn)六核苷酸重復基序。

表4 朱砂根及紅涼傘葉綠體基因組長重復序列分析Table 4 Analysis of long repeats of chloroplast genome between A.crenata and A.crenata var.bicolor

表5 朱砂根及紅涼傘葉綠體基因組SSR 分析Table 5 Analysis of SSR of chloroplast genome between A.crenata and A.crenata var.bicolor

2.4 朱砂根及紅涼傘葉綠體基因組IR-LSC/SSC 區(qū)的收縮和擴張分析

邊界分析顯示紫金牛屬葉綠體基因組雖然在序列長度、基因組成以及GC 含量等方面相對穩(wěn)定保守，但4 個邊界區(qū)的過渡區(qū)域卻存在有多樣性（圖2）。紫金牛屬8 個物種的IRb-LSC 邊界均位于rps19的編碼區(qū)。走馬胎、月月紅、雪下紅、酸苔菜、虎紅舌、朱砂根（貴州）IRb-SSC 邊界均位于ndhF編碼區(qū)，朱砂根（江西）距ndhF編碼區(qū)5 bp。紫金牛屬8 個物種IRa-SSC 邊界，除了紅涼傘位于ndhF編碼區(qū)外，其他種均位于ycf1基因內(nèi)。走馬胎、月月紅、雪下紅IRa-LSC 邊界均位于rpl2和tRNA 基因間區(qū)內(nèi)，酸苔菜、紅涼傘、朱砂根（江西）位于rpl2和trnH間區(qū)內(nèi)，朱砂根（貴州）位于rps1和trnH基因編碼區(qū)，虎紅舌位于rps19和trnH基因編碼區(qū)。

圖2 葉綠體基因組IR 與 SC 邊界Fig.2 Chloroplast genome IR and SC boundary

2.5 朱砂根及紅涼傘葉綠體基因組序列變異分析

以朱砂根（貴州）作為參考基因組，采用mVISTA 軟件檢測基因重排和倒位的全局比對模式（Shuffle-LAGAN），對紅涼傘、朱砂根（江西）、月月紅、虎紅舌、雪下紅、走馬胎和酸苔菜葉綠體全基因組序列同源性進行比較研究（圖3）。結(jié)果表明，紫金牛屬物種葉綠體基因組LSC、IRa、SSC、IRb四個區(qū)域排列順序較為一致、保守性較高，非基因編碼區(qū)變異程度較高，其中 SSC 區(qū)的變異程度最高；基因編碼區(qū)差異不明顯。紫金牛屬葉綠體基因組中psaB、psbA、psbC、matK、atpA、atpB、rpoC2、rpoC1、ropB、ndhD、ndhF、ndhK、rbcL、accD、ropA等基因的編碼區(qū)存在差異。此外，朱砂根與紅涼傘葉綠體基因組相比，psbA、matK、rpoC2、ropB、ndhK、accD、ndhF、ndhD、ndhH及ycf1等基因的編碼區(qū)存在差異，這些位點為紅涼傘的分子鑒定提供了新的位點資源。

圖3 葉綠體基因組全局比對圖Fig.3 Chloroplast genome global alignment map

2.6 朱砂根及紅涼傘葉綠體基因組共線性分析

采用 Mauve 多重基因組比對法檢測紅涼傘、朱砂根（貴州）、朱砂根（江西）、月月紅、虎紅舌、雪下紅、走馬胎和酸苔菜8 個物種的葉綠體基因組的重排和共線性。通過多重基因組比對法檢測出 8 個物種的葉綠體基因組之間有 5 個局部共線塊（locally collinear block,LCB）（圖4），這表明8 個物種之間的基因組具有高度的相似性。葉綠體全基因組序列的比對顯示，葉綠體基因組之間沒有重排或倒置，從葉綠體基因組4 個組分上看，IR 區(qū)序列變異最低，SSC 區(qū)的變異程度最高。

圖4 葉綠體基因組的共線性分析Fig.4 Covariance analysis of the chloroplast genome

2.7 朱砂根及紅涼傘系統(tǒng)發(fā)育分析

選擇已發(fā)表的紫金牛科葉綠體基因組為內(nèi)類群和與紫金牛科親緣關(guān)系較近的3 個報春花科植物鐘花報春P.sikkimensis、鄂報春P.obconica、騰沖燈臺報春P.chrysochlora為外類群，構(gòu)建ML 系統(tǒng)發(fā)育樹。在系統(tǒng)發(fā)育樹中（圖5），可確定為不包括外類群物種的3 個主要類群：蠟燭果屬和杜莖山屬為一個類群，酸藤子屬為一個類群，紫金牛屬為一個類群，支持率為100%，酸藤子屬和紫金牛屬可能是在蠟燭果屬和杜莖山屬基礎(chǔ)上進化的。這與前人研究略有不同，Xie 等［14］認為紫金牛屬與長柱金牛屬親緣關(guān)系較近。基于系統(tǒng)進化樹發(fā)現(xiàn)朱砂根與紐子果親緣關(guān)系較近，與已有研究結(jié)果一致［14］。進一步分析發(fā)現(xiàn)，朱砂根與紅涼傘親緣關(guān)系最密切，從分子水平為紅涼傘作為朱砂根變種提供了科學解釋。系統(tǒng)進化樹結(jié)果表明，葉綠體基因組構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹可用于紫金牛屬物種植物的鑒定。

圖5 葉綠體基因組序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree constructed from chloroplast genome sequence

3 討論

本研究對不同地區(qū)朱砂根及變種紅涼傘進行葉綠體基因組測序，測序結(jié)果表明三者葉綠體基因組均具有典型的環(huán)狀四分體結(jié)構(gòu)，包括 LSC、SSC、IRa 和IRb 四個區(qū)，其序列總長度、CG 含量、基因數(shù)量基本一致，且IRs 區(qū)序列GC 含量最高。葉綠體基因組包括蛋白編碼區(qū)和非編碼區(qū)，編碼區(qū)包含100-120 類不同的基因,涉及光合作用、復制等作用［28］，朱砂根和紅涼傘葉綠體全基因組序列中注釋得到132 個基因，包括87 個蛋白編碼基因、37 個tRNA 基因和8 個rRNA 基因。葉綠體基因組的突變不是隨機的，而是存在突變熱點區(qū)域，這些突變熱點區(qū)域已經(jīng)被用于物種及物種以下水平（品種）親緣關(guān)系研究［8-9］。通過對變異位點的分析，發(fā)現(xiàn)psaB、psbA、psbC、matK、atpA、atpB、rpoC2、rpoC1、ropB、ndhD、ndhF、ndhK、rbcL、accD、ropA、ccsA、ycf2及ycf1等基因的編碼區(qū)存在差異，為該屬的分子鑒定奠定了基礎(chǔ)。

葉綠體基因標記物，如簡單重復序列（simple sequence repeats,SSRs）己經(jīng)被用于基因流、種群分化和遺傳多樣性研究［29］。本研究從朱砂根葉綠體基因組中共檢測到207 個 SSR 位點，SSR 以單核苷酸重復為主，且隨著拷貝數(shù)目增加，SSR 數(shù)量明顯減少，朱砂根和紅涼傘的SSR 位點類型和數(shù)量基本一致，但略有不同，可為朱砂根分子標記開發(fā)或基原鑒定提供理論依據(jù)。朱砂根葉綠體基因組序列中單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸SSR 類型分別以A/T、AT/TA、AAT/ATT 為主，表明朱砂根葉綠體基因組序列中SSRs 主要由polyA 或 polyT 所構(gòu)成，與已有研究結(jié)果結(jié)論一致［30］。

Liu 等［31］利用形態(tài)特征和matK 分子標記對24種紫金牛屬的親緣關(guān)系進行研究，但由于形態(tài)特征不穩(wěn)定和遺傳信息不足，仍不能推斷紫金牛屬物種親緣關(guān)系。而完整的葉綠體基因組序列具有更高的分辨率，可以用于紫金牛屬物種鑒定及進化的分析，Xie 等［14］認為紫金牛屬與長柱金牛屬親緣關(guān)系較近。這與本文的研究結(jié)果不同，系統(tǒng)進化樹表明紫金牛屬可能是在蠟燭果屬和杜莖山屬基礎(chǔ)上進化的，支持率為100%。同時Xie 等［14］認為紫金牛屬為報春花科，但亦有說法紫金牛屬為紫金牛科。植物化學方面研究表明紫金牛科與報春花科在親緣關(guān)系上相近的科，目前紫金牛屬已合并到報春花科（http://www.iplant.cn/info/Primulaceae）。但本研究構(gòu)建的葉綠體系統(tǒng)發(fā)育樹，通過支持率可將紫金牛科和報春花科分為兩個分支，紫金牛屬是否可以劃分為報春花科值得進一步商榷，需要進一步結(jié)合貝葉斯樹及溯祖理論進行分析。

對朱砂根原植物的考證［32］，認為紅涼傘更符合《本草綱目》記載的朱砂根，吳征鎰?wù)J為紅涼傘與朱砂根在植株外形上無大差別，僅葉背、花梗、花芬及花瓣均帶紫紅色而有所不同，二者作為兩個單獨種并不適當，因此將紅涼傘作為朱砂根的變種，在最新版的Flora of China中紅涼傘已合并至朱砂根。葉綠體基因組系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果表明，朱砂根與紅涼傘親緣關(guān)系最為親密，在朱砂根的基礎(chǔ)上進化，這也為紅涼傘作為朱砂根變種提供了科學解釋。

4 結(jié)論

基于Illumina 測序平臺對不同地區(qū)朱砂根及變種紅涼傘葉綠體全基因組進行測序，psbA、matK、rpoC2、ropB等基因編碼區(qū)存在差異，為朱砂根和紅涼傘的分子鑒定提供了新的位點資源。系統(tǒng)發(fā)育表明朱砂根與紅涼傘親緣關(guān)系最為親密，紫金牛屬可能是在蠟燭果屬和杜莖山屬基礎(chǔ)上進化，為進一步研究紫金牛屬藥用植物的分子進化和親緣關(guān)系提供了充分的信息。但需要進一步結(jié)合貝葉斯樹及溯祖理論探討紫金牛屬與報春花科之間的關(guān)系，以明確紫金牛屬的劃分。