靖宇平貝母浸出物通過調節(jié)腸道菌群失調緩解DSS誘導潰瘍性結腸炎

張 彤，李 玥，楊 霞，白 冰，李一權，房金波，韓繼成，李 霄，金寧一，朱羿龍，朱光澤

（長春中醫(yī)藥大學吉林省院士工作站，長春 130117）

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種慢性腸炎炎癥性疾病，其病因尚不明確。現(xiàn)已知炎癥損傷和腸道菌群失調對UC的發(fā)生發(fā)展起到了至關重要的作用[1-2]。在UC的發(fā)展過程中，異常活化的炎癥信號通路會分泌大量的促炎因子，這些促炎因子能夠聚集于受損的腸組織[3-4]，并持續(xù)性損傷腸黏膜導致腸黏膜屏障減弱[5]，進而使得相關腸道微生物侵入腸黏膜[6]。在絕大多數UC患者受損的結腸粘膜樣本中都發(fā)現(xiàn)了腸道微生物[7]，這些微生物代謝產物中的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）能夠激活toll樣受體以調節(jié)炎癥細胞因子的分泌，進而激活相應的促炎反應以加劇炎癥損傷[8-9]。因此，腸道菌群失調會促進炎癥損傷加劇UC患者的病程，甚至可能會誘發(fā)癌變[10-11]。總之，腸道菌群失調對UC患者的病程進展與康復速度有著重要的影響。

平貝母是百合科貝母屬多年生草本植物，其干燥鱗莖具有止咳化痰、潤肺散結的功效，主產于遼寧、吉林和黑龍江。平貝母中含有多種活性成分，包括生物堿類、生物堿苷、腺苷類和多糖類等，其中異甾體生物堿是其主要的生物活性成分[12]，具有止咳[13]、祛痰[14]、抗腫瘤[15]、抗炎[16]、抗菌和抗?jié)僛13]等功效。貝母屬異甾體生物堿具備的抗炎、抗菌和抗?jié)兓钚钥赡苁蛊涑蔀轭A防或治療潰瘍性結腸炎的潛在藥物。平貝母作為吉林省道地藥材，以靖宇平貝母的質量最佳。因此，本研究以靖宇平貝母浸出物作為研究目標，通過探討其對DSS誘導潰瘍性結腸炎小鼠癥狀及腸道菌群的影響，明確靖宇平貝母浸出物抗?jié)冃越Y腸炎效果，并分析其引起的腸道菌群變化在抗?jié)冃越Y腸炎上所發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

C57BL/6J雄性小鼠，體質量22～24 g，由斯貝福（北京）生物技術有限公司提供，動物許可證號碼：SCXK（京）2019-0010。

1.2 試劑

靖宇平貝母浸出物由吉林省鼎信檢測有限公司提供，浸出物由DMSO溶解，并用玉米油稀釋。葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）（36，000-50，000 M.Wt.）購自MP Biomedicals公司；玉米油購自MedChemExpress公司。

1.3 實驗動物分組、造模與給藥

將雄性C57BL/6J小鼠隨機分成4組，即DSS組、DSS+浸出物組（8 mg·kg-1灌胃）、浸出物組（8 mg·kg-1灌胃）和對照組，每組8只。每天記錄小鼠疾病活躍指數（disease activity index，DAI）。15 d后，取各組的腸組織拍照并測量結腸長度，分離結腸內容物，用于后續(xù)實驗分析。具體實驗流程見圖1。

1.4 疾病活躍指數評分

每天記錄小鼠的疾病活躍指數，DAI評分總分=體質量下降百分比+糞便黏稠度+糞便潛血，評分細則詳見文獻[17]。

1.5 腸組織HE染色

取實驗小鼠腸組織，分離結腸和盲腸，分別置于4%多聚甲醛組織固定液中，HE染色與腸組織病理學評分由武漢賽維爾生物科技有限公司完成。組織病理學評分=上皮組織損傷評分+炎性浸潤評分[18]。

1.6 16S rRNA分析

所有結腸內容物樣品的16S rRNA分析由北京百邁客生物科技有限公司完成。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行數據統(tǒng)計，并且以均數±標準差（±s）表示，組間比較均采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 靖宇平貝母浸出物抑制模型小鼠體質量變化

靖宇平貝母浸出物對潰瘍性結腸炎小鼠體質量變化影響見圖1。結果表明在第12天，DSS組和浸出物+DSS組體質量出現(xiàn)明顯的下降趨勢。從第13天到第15天，浸出物+DSS組體質量下降率顯著性低于DSS組（P＜0.05）。從第0天到第15天，浸出物組與對照組體質量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。這些結果表明靖宇平貝母浸出物可以顯著性抑制DSS誘導潰瘍性結腸炎小鼠體質量減輕，但對正常小鼠的體質量無顯著性影響。

2.2 靖宇平貝母浸出物降低模型小鼠DAI評分

靖宇平貝母浸出物對潰瘍性結腸炎小鼠DAI評分變化影響見圖2。結果表明在第11天，DSS組和浸出物+DSS組DAI評分出現(xiàn)明顯的上升趨勢。從第14天到第15天，浸出物+DSS組DAI評分顯著性低于DSS組（P＜0.05）。從第0天到第15天，浸出物組與對照組小鼠DAI評分無顯著性差異（P＞0.05）。這些結果表明靖宇平貝母浸出物可以顯著性改善DSS誘導潰瘍性結腸炎小鼠癥狀（如體質量損失率、腹瀉、便血等），但對正常小鼠的DAI評分無顯著性影響（P＜0.05）。

圖2 靖宇平貝母浸出物對DSS誘導潰瘍性結腸炎小鼠DAI評分的影響

2.3 靖宇平貝母浸出物抑制模型小鼠結腸長度

靖宇平貝母浸出物對潰瘍性結腸炎小鼠結腸長度縮短的抑制效果見圖3，與浸出物+DSS組（5.77±0.64）cm 比 較，DSS組（5.05±0.39）cm結腸長度顯著性縮短（P＜0.01），但是浸出物組（8.02±0.24）cm與對照組（8±0.23）cm結腸長度比較無顯著性差異（P＞0.05）。這些結果表明靖宇平貝母浸出物可以顯著性抑制DSS誘導潰瘍性結腸炎小鼠結腸縮短，但對正常小鼠的結腸長度無顯著性影響（P＞0.05）。

圖3 靖宇平貝母浸出物對DSS誘導潰瘍性結腸炎小鼠結腸長度的影響

2.4 靖宇平貝母浸出物減輕模型小鼠腸組織損傷

通過實驗小鼠結腸和盲腸HE染色病理分析，靖宇平貝母浸出物對潰瘍性結腸炎小鼠腸組織損傷的抑制效果見圖4。DSS組的結腸組織黏膜層可見大面積潰瘍，腸上皮被破壞，固有層腸腺消失，并伴有大量多量的炎性細胞浸潤；浸出物+DSS組的結腸組織黏膜層可見多處潰瘍，腸上皮被破壞，固有層腺體數量減少，并伴有部分炎性細胞浸潤。DSS組結腸組織病理學評分顯著性高于浸出物+DSS組（P＜0.001）。DSS組的盲腸組織可見多處潰瘍，腸上皮被破壞，固有層腸腺消失，并伴有部分炎性細胞浸潤；浸出物+DSS組的盲腸組織黏膜層可見基礎潰瘍，固有層腸腺數量減少，并伴有少量炎性細胞浸潤。DSS組盲腸組織病理學評分顯著性高于浸出物+DSS組（P＜0.001）。但浸出物組與對照組的結腸或盲腸組織都是皺襞結構清晰，黏膜層腸上皮結構完整，上皮細胞形態(tài)結構正常，固有層腸腺數量豐富等，未見明顯炎癥，且浸出物組結腸或盲腸組織病理學評分與對照組相比無顯著性差異（P＞0.05）。這些結果表明靖宇平貝母浸出物可以顯著性減輕DSS誘導潰瘍性結腸炎小鼠腸組織損傷和炎性細胞浸潤，但對正常小鼠的腸組織無顯著性的病理損傷。

圖4 靖宇平貝母浸出物對DSS誘導潰瘍性結腸炎小鼠腸組織損傷的影響（放大50×和100×）

2.5 靖宇平貝母浸出物改善模型小鼠腸道菌群結構

靖宇平貝母浸出物對潰瘍性結腸炎小鼠腸道菌群結構的影響見圖5。其中稀釋性曲線如圖5A所示，測序量到達一定數值后，OUT數量穩(wěn)定，樣本曲線趨于平穩(wěn)，表明本次實驗每個樣本的稀釋性曲線充分反映了樣本的多樣性。通過Alpha多樣性分析反映腸道菌群的豐富度和多樣性，其中ACE指數衡量物種豐富度，Shannon指數衡量物種多樣性。浸出物+DSS組的ACE指數和Shannon指數均顯著性高于DSS組（P＜0.05），該結果表明靖宇平貝母浸出物能夠顯著性增加DSS誘導潰瘍性結腸炎小鼠的腸道菌群豐富度和多樣性。

圖5 靖宇平貝母浸出物對DSS誘導潰瘍性結腸炎小鼠腸道菌群結構的影響

2.6 靖宇平貝母浸出物影響模型小鼠腸道菌群組成

靖宇平貝母浸出物對潰瘍性結腸炎小鼠腸道菌群組成的影響見圖6。在門類水平上（圖6A）與DSS組比較，DSS+浸出物組Firmcutes相對豐度顯著性升高（P＜0.000 1），Proteobacteria相對豐度顯著性降低（P＜0.000 1）。在屬類水平上（圖6B）與DSS組比較，DSS+浸出物組Escherichia和Bacteroides相對豐度顯著降低（P＜0.05），Parasutterella、Lachnospiraceae_NK4A136_group、Ruminococcaceae_UCG-014和Faecalibaculum相對豐度顯著性升高（P＜0.01）。在種類水平上（圖6C）與DSS組比較，DSS+浸出物組Escherichia_coli和Bacteroides_vulgatus相對豐度顯著性降低（P＜0.0001），F(xiàn)aecali-baculum_rodentium相對豐度顯著性升高（P＜0.0001）。這些結果表明靖宇平貝母浸出物能夠改善DSS誘導潰瘍性結腸炎模型小鼠的腸道菌群失調，具體表現(xiàn)在增加潛在有益菌豐度，降低潛在有害菌豐度。

圖6 靖宇平貝母浸出物對DSS誘導潰瘍性結腸炎小鼠腸道菌群組成影響

3 討論

越來越多的研究表明，腸道菌群組成的變化能夠顯著性影響腸道免疫和UC進程[19-20]。腸道黏膜固有層含有大量炎性效應細胞和抑制炎癥反應的調節(jié)細胞，二者都處于高度動態(tài)平衡的狀態(tài)[21]。然而，腸道菌群組成和多樣性的失調會嚴重影響腸黏膜的炎癥反應并打破這種平衡[22]，進而導致腸黏膜相關炎癥因子過度激活造成炎性損傷[23]。因此，腸道菌群失調引起的長期或慢性炎癥與UC發(fā)展密切相關[24]。

正常情況下，UC患者腸黏膜內的微生物組成和細菌總數會發(fā)生顯著性變化，且細菌多樣性明顯減少[25]。與健康個體相比，UC患者體內促炎細菌顯著性增加，抗炎細菌顯著性減少[26]。研究發(fā)現(xiàn)，在UC的發(fā)展過程Proteobacteria（大多數為已知致病菌）豐度顯著性升高[27]，F(xiàn)irmicutes和Bacteroidetes（可以產生短鏈脂肪酸調節(jié)脂代謝、保護腸黏膜損傷和抑制致病菌生長）豐度顯著性下降[28-29]。在UC患者的糞便菌群中，一些潛在有害細菌（如Escherichia-Shigella、Helicobacter、Campylobacter和Fusobacterium）豐度顯著性升高，這些潛在有害菌能夠顯著性影響腸道炎癥和腸上皮細胞通透性[30]；此外，潛在有益菌Firmicutes成員的數量顯著性下降，特別是 Ruminococcus bromii、Eubacterium rectale、Roseburia和Akkermansia，這些潛在有益菌可以產生大量具有抗炎作用的丁酸和丙酸鹽[31]。

在本研究中，與DSS組相比，浸出物+DSS組潛在有益菌Parasutterella、Ruminococcaceae_UCG-014、Lachnospiraceae_NK4A136_group和Faecalibaculum（Faecalibaculum_rodentium）與潛在有害菌Escherichia（Escherichia_coli）和Bacteroides（Bacteroides_vulgatus）均發(fā)生了顯著性變化。其中Parasutterella能夠產生琥珀酸，細菌來源的琥珀酸鹽通過促進嚴格厭氧細菌的定殖，對宿主產生有益作用[32]。Ruminococcaceae_UCG-014[33]、Lachnospiraceae_NK4A136_group[34]和Faecalibaculum（Faecalibaculum_rodentium）[35]可以通過產生丁酸鹽來改善UC；Escherichia（Escherichia_coli）為機會致病菌能夠產生LPS來激活促炎反應并增加炎性損傷。Bacteroides（Bacteroides_vulgatus） 被認為是致病菌能夠產生Bacteroides_vulgatus蛋白酶來加劇腸道損傷[36]。靖宇平貝母浸出物可以通過改善腸道菌群失調，增加潛在有益菌（Parasutterella、Ruminococcaceae_UCG-014、Lachnospiraceae_NK4A136_group和Faecalibaculum）豐度，降低潛在有害菌（Escherichia和Bacteroides）豐度，來緩解DSS誘導潰瘍性結腸炎癥狀，具體表現(xiàn)為體質量變化減輕、DAI評分降低、結腸縮短長度。