富硒牡蠣肽的制備及其抗氧化和血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性研究

夏珍，陳冰冰，黃文，康澳，梁興唐，尹艷鎮(zhèn)，唐德劍，孟莉，劉果，曹庸，苗建銀,,,4*

1(華南農(nóng)業(yè)大學 食品學院，廣東省功能食品活性物重點實驗室，廣東 廣州，510642)2(北部灣大學 石油與化工學院， 欽州市生物廢棄物資源富硒功能化利用重點實驗室，廣西 欽州，535000)3(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部富硒產(chǎn)品開發(fā)與質(zhì)量控制重點實驗室 富硒食品開發(fā)國家地方聯(lián)合工程實驗室 安康市富硒產(chǎn)品研發(fā)中心，陜西 安康，725000)4(廣西農(nóng)產(chǎn)資源化學與生物技術(shù)重點 實驗室，廣西 玉林，537000)

活性氧(reactive oxygen species, ROS)在細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)、信號轉(zhuǎn)導和各種生物反應中起著重要作用。然而，促氧化劑和抗氧化劑之間的不平衡會引起氧化應激，損害各種細胞成分(DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等)并導致系列疾病[1]。氧化應激已被證明與高血壓和其他慢性疾病(如關(guān)節(jié)炎、糖尿病和神經(jīng)退行性疾病)的發(fā)展有密切關(guān)系，開發(fā)兼具抗氧化、降血壓等多種活性功效的天然成分成為近年來研究的熱點[2]。食源性生物活性肽或蛋白酶解物因具有良好的抗氧化能力、環(huán)保、可持續(xù)性、低成本和無毒副作用等優(yōu)點引起了人們極大的興趣[3]。已有研究表明，許多抗氧化酶解物或多肽具有良好的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin converting enzyme,ACE)抑制活性[4-5]。牡蠣蛋白質(zhì)含量豐富，氨基酸組成完善，同時牡蠣作為我國傳統(tǒng)的藥食同源的食品原料，是開發(fā)具有抗氧化和ACE抑制活性的生物活性肽的良好來源。

硒是人體所必需的微量元素，是一些生物酶的輔助因子，如谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GPx)，硫氧還蛋白還原酶(thioredoxin reductase, TrxR)和脫碘酶(iodothyronine deiodinases, DIOs)等，在大多數(shù)生物體中表現(xiàn)出氧化還原酶的功能[6]。近年來，有機硒因其良好的安全性、良好的生物活性和生物利用度而受到世界范圍內(nèi)的廣泛關(guān)注，在均衡飲食的框架下，有機硒比無機硒更值得推薦[7]。與單一的硒化合物和普通的生物活性肽相比，硒肽具有更有效的生物活性，是生物活性肽領(lǐng)域中極具研究價值的新穎肽[8]。目前，利用富硒酵母[9]、大豆[6]、堇葉碎米薺[10]和黃粉蟲[11]等硒蛋白原料開發(fā)生物活性肽的研究已有報道。富硒生物活性肽具有多種功能活性，如堇葉碎米薺硒肽具有抗氧化和抗疲勞活性[10]，富硒黃粉蟲幼蟲經(jīng)堿性蛋白酶水解后的蛋白水解物顯示出良好的抗氧化和免疫調(diào)節(jié)活性[11]。然而，利用北部灣富硒牡蠣開發(fā)天然有機硒活性肽的研究尚無報道。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

富硒牡蠣蛋白，北部灣濱海富硒功能農(nóng)業(yè)研究院；堿性蛋白酶(2×105U/g)、中性蛋白酶(2×105U/g)、木瓜蛋白酶(2×105U/g)、胰蛋白酶(2 500 Usp U/mg)、胃蛋白酶(3 000 NF)，南寧龐博生物工程有限公司；血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(來源于兔肺)、N-[3-(2-呋喃基)丙烯酰]-L-苯丙氨酰-甘氨酰-甘氨酸(N-[3-(2-furyl)acryloyl]-L-phenylalanyl-glycyl-glycine, FAPGG)、4-羥乙基哌嗪乙磺酸[4-2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid,HEPES]、2′,7′-二氯熒光素二乙酸酯(2,2′-dichlorodihydrofluorescein diacetate, DCFH-DA)，美國Sigma公司；噻唑蘭[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5 diphenyl tetrazolium bromide, MTT]、DPPH、ABTS，上海麥克林生化科技有限公司；杜氏改良高糖培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified eagle medium,DMEM)、胎牛血清、雙抗(青霉素/鏈霉素)，美國Gibico公司；2,2′-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽(2,2′-azobis(2-methylpropionamidine)dihydrochloride，AAPH)，上海源葉生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

AL104電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；DF-101S數(shù)顯恒溫水浴鍋，鞏義予華儀器有限公司；PHS-3CW pH計，賽多利斯科學儀器(京)有限公司；L530臺式低速離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；FD-1型冷凍干燥機，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；S-433D全自動氨基酸分析儀，德國Sykam公司；AFS-9530原子熒光光度計，北京海光儀器有限公司；EnSpire2300多功能酶標儀，珀金埃爾默企業(yè)管理(上海)有限公司；CKX41倒置顯微鏡，日本Olympus公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 富硒牡蠣肽的酶法制備及工藝優(yōu)化

1.3.1.1 工藝流程

稱取一定量富硒牡蠣蛋白粉→按一定底物質(zhì)量濃度加去離子水充分溶解→調(diào)節(jié)pH(1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl溶液)→按照不同酶底比加入蛋白酶→水浴酶解→滅酶(95 ℃，10 min)→離心(4 000 r/min，20 min)→上清液(測定DPPH自由基清除率)→真空冷凍干燥→富硒牡蠣肽凍干粉

1.3.1.2 單因素試驗

采用單因素試驗研究了酶解條件對富硒牡蠣肽清除DPPH自由基的影響。單因素包括：酶種類(堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶)；酶解時間(0.5、1、2、3、4 h)；pH值(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0)；底物質(zhì)量濃度(1、3、5、7、9 g/100mL)；酶解溫度(30、35、40、45、50 ℃)、酶底比(0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%)。在優(yōu)化實驗因素的過程中，每次實驗都只改變1個因素而保持其他因素不變。

1.3.1.3 響應面試驗優(yōu)化

在單因素試驗的基礎上，以酶解溫度、酶解時間、酶底比為影響因素，各取3個水平值，以酶解物的DPPH自由基清除率為響應值，確定富硒牡蠣肽的最佳酶解工藝，試驗因素及水平見表1。

表1 響應面分析試驗因素水平Table 1 Factor and level of response surface experiment

1.3.2 硒含量測定

樣品的硒含量測定參照GB 5009.93—2017《食品中硒的測定 氫化物原子熒光光譜法》。

1.3.3 氨基酸組成測定

氨基酸含量測定參照GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的測定 氨基酸分析儀》。

1.3.4 抗氧化評價

1.3.4.1 DPPH自由基清除能力的測定

參考MIAO等[12]的方法進行測定。將100 μL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液和100 μL DPPH溶液加入96孔板中，混勻后于室溫、避光條件下反應30 min，立即測定其在517 nm處的吸光值。DPPH自由基清除率的計算如公式(1)所示：

(1)

式中：A0為100 μL無水乙醇+100 μL DPPH溶液的吸光值，Ai為100 μL樣品溶液+100 μL DPPH溶液的吸光值，Aj為100 μL樣品溶液+100 μL無水乙醇的吸光值。

1.3.4.2 ABTS陽離子自由基清除能力的測定

參考MIAO等[12]的方法配制ABTS工作液，依次加入100 μL ABTS工作液和100 μL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液于96孔板中，混勻，于37 ℃下避光反應10 min后，在734 nm處測定吸光值。ABTS陽離子自由基清除率的計算如公式(2)所示：

(2)

式中：A0為100 μL去離子水+100 μL ABTS工作液的吸光值，Ai為100 μL樣品溶液+100 μL ABTS工作液的吸光值，Aj為100 μL樣品溶液+100 μL去離子水的吸光值。

1.3.4.3 細胞培養(yǎng)及細胞毒性試驗

HepG2細胞培養(yǎng)參考LI等[13]的方法。富硒牡蠣肽對HepG2細胞的毒性檢測參照MIAO等[12]的方法略作修改。將100 μL HepG2細胞細胞懸液(1×105cells/mL)接種于96孔板中，37 ℃培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液，樣品組加入100 μL富硒牡蠣肽溶液(0.5、5、50、100、250、500、1 000、2 000、5 000 μg/mL)，對照組加入100 μL培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。用PBS清洗后，加入100 μL MTT溶液(0.5 mg/mL)繼續(xù)孵育4 h。棄去MTT溶液，加入100 μL 二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，振蕩10 min使藍紫色結(jié)晶全部溶解后，酶標儀檢測490 nm處的OD值。

1.3.4.4 細胞抗氧化活性(cellular antioxidant activity，CAA)測定

在黑色96孔板中每孔接種100 μL HepG2細胞懸液(6×105cells/mL)，分為對照孔(PC)，空白孔(NC)和處理孔(TC)，細胞培養(yǎng)24 h后，用PBS洗滌一遍。對照組和空白組中加入50 μL DCFH-DA(50 μmol/L)工作溶液和50 μL無菌水；樣品組中加入50 μL DCFH-DA(50 μmol/L)工作溶液和50 μL不同濃度的富硒牡蠣肽溶液，37 ℃下孵育1 h。棄去處理培養(yǎng)基，用PBS洗滌3次，在空白組中加入培養(yǎng)基，在對照組和處理組中加入100 μL 2,2′-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽[2,2′-azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride, ABAP](600 μmol/L)工作溶液。酶標儀測定波長528 nm的熒光值，激發(fā)波長為485 nm，測定時長為1 h，每5 min測1次。CAA的計算如公式(3)所示：

(3)

式中：AUC代表熒光強度-時間曲線下的積分面積。

1.3.4.5 對AAPH誘導損傷HepG2細胞的保護作用

將100 μL HepG2細胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中，得到每孔2×104個細胞，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h。棄去培養(yǎng)基，空白對照組加入100 μL培養(yǎng)基，實驗組加入100 μL含AAPH的培養(yǎng)基(AAPH濃度為0～16 mmol/L)，繼續(xù)孵育24 h，棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗后，采用MTT比色法測定細胞存活率，探索合適的AAPH濃度以構(gòu)建細胞適度損傷模型。

將100 μL HepG2細胞細胞懸液(2×105cells/mL)接種于96孔板中，分為空白對照組、損傷組和保護組，37 ℃孵育24 h。棄去培養(yǎng)基，空白對照組和損傷組加入100 μL培養(yǎng)基，保護組加入100 μL的富硒牡蠣肽溶液(5、10、25、50、100 μg/mL)繼續(xù)孵育24 h。然后，空白對照組加入50 μL培養(yǎng)基，損傷組和保護組加入50 μL含AAPH的培養(yǎng)基(AAPH終濃度為0.5 mmol/L)，繼續(xù)孵育24 h后，棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗后，采用MTT比色法測定細胞存活率。

1.3.5 ACE抑制率測定

根據(jù)等CAO等[14]的方法加以修改測定富硒牡蠣肽的ACE抑制活性。依次加入10 μL ACE(0.1 U/mL)溶液，40 μL樣品溶液，最后加入50 μL 1.0 mmol/L的FAPGG底物(用含有0.3 mol/L NaCl的80 mmol/L的HEPES緩沖液配制)。空白對照組使用等體積的80 mmol/L HEPES緩沖液代替樣品。混勻后，立刻測定在340 nm處的初始OD值，37 ℃保溫30 min后再測定其OD值。ACE抑制率的計算如公式(4)所示：

(4)

式中：ΔAb為空白對照組吸光度在30 min內(nèi)的變化，ΔAa為樣品組吸光度在30 min內(nèi)的變化。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有指標均重復測定3次，結(jié)果用平均值±標準差表示。采用Design-Expert v 8.0.6進行響應面實驗設計和數(shù)據(jù)分析。采用SPSS 26.0對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(ANOVA)，顯著性分析采用Duncan檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 富硒牡蠣肽的制備

2.1.1 單因素試驗

由圖1-a可知，在不同蛋白酶最優(yōu)條件下，胃蛋白酶酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率最高，達到(50.47±2.38)%，堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物對DPPH自由基的清除活性最低,為(28.43±2.22)%。因此，在后續(xù)的實驗中，以胃蛋白酶為最適用酶進一步優(yōu)化酶解工藝參數(shù)。

如圖1-b所示，隨著酶解時間的延長，酶解產(chǎn)物DPPH自由基清除能力逐漸增強，在酶解3 h時達到最大值，之后其清除DPPH自由基的能力略有下降。分析原因可能是隨著酶解時間的延長，底物特異性位點基本被完全反應，繼續(xù)反應不會導致額外的活性基團暴露，甚至會導致底物過度酶解，產(chǎn)生活性較低的酶解產(chǎn)物[15]。因此，選擇酶解時間3 h作為響應面優(yōu)化試驗的中心試驗點。

由圖1-c可知，利用胃蛋白酶酶解制備富硒牡蠣肽的最佳pH值為1.0。當pH值從1.0增加到3.0時，酶解物的DPPH自由基清除率呈下降趨勢，可能是由于胃蛋白酶的最適pH為1.0～2.0，在這一范圍內(nèi)，胃蛋白酶的活性高，酶解效果好。pH繼續(xù)升高會破壞蛋白酶的活性中心和空間結(jié)構(gòu)，使其催化活性降低，所以確定最佳酶解pH為1.0。

由圖1-d可知，在1～7 g/100mL的底物質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，酶解產(chǎn)物清除DPPH自由基的能力逐漸增加，但隨著底物質(zhì)量濃度的進一步增加，活性沒有明顯變化。由此可見，酶解早期，底物質(zhì)量濃度的增加促進酶解過程的進行。然而，底物質(zhì)量濃度過高會抑制分子的擴散和移動，限制蛋白酶的效率，導致酶解產(chǎn)生的活性抗氧化肽的相對含量降低[16]。考慮到節(jié)約成本，以7 g/100mL為最佳底物質(zhì)量濃度進行進一步研究。

如圖1-e所示，溫度在30～40 ℃范圍內(nèi)，酶解物的DPPH自由基清除率隨溫度升高緩慢升高，在40 ℃達到最大值后下降。這是因為在相對較低的溫度下，酶的活性較小，分子的動能較小，酶與底物之間的碰撞也較少，反應效率低。當超過其最適溫度后，蛋白酶逐漸變性，酶活性降低，導致酶解作用減弱。因此，選取酶解溫度35、40、45 ℃進一步響應面優(yōu)化。

如圖1-f所示，酶底比從0.1%增加到0.4%，酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除能力提高。而當酶底比進一步提高到0.5%時，酶解產(chǎn)物清除DPPH自由基的能力明顯下降。合適的酶添加可提高富硒牡蠣蛋白的利用率，促進抗氧化肽的生成，過高的酶用量可能造成過度酶解，導致活性抗氧化肽過度降解，產(chǎn)生活性較低的氨基酸或小分子肽。因此，選擇酶底比0.4%作為優(yōu)化的中心點。

a-酶種類；b-酶解時間；c-pH；d-底物質(zhì)量濃度；e-酶解溫度；f-酶底比圖1 酶解條件對富硒牡蠣肽的DPPH自由基清除率的影響Fig.1 Effect of enzymatic hydrolysis conditions on DPPH radical scavenging activity of selenium-enriched oyster peptides

2.1.2 響應面優(yōu)化結(jié)果及分析

以酶解溫度(X1)、酶解時間(X2)和酶底比(X3)3個因素為自變量，以DPPH自由基清除率為響應值(Y)，進行3因素3水平試驗設計，試驗設計和結(jié)果見表2。對實驗數(shù)據(jù)進行多元回歸分析，得到如下二階多項式方程，如公式(5)所示：

Y=58.26-0.54X1+0.53X2+0.080X3-0.96X1X2+0.063X1X3+0.54X2X3-1.61X12+0.10X22+1.34X32

(5)

回歸方程中各變量對響應值影響的顯著性由F檢驗來判定，概率P值越小，則相應變量的顯著程度越高。各因素對富硒牡蠣肽的DPPH自由基清除率的影響：酶解溫度>酶解時間>酶底比，且酶解溫度與酶解時間、酶解時間與酶底比交互作用影響顯著(P<0.05)，酶解溫度與酶底比交互作用影響不顯著(P>0.05)。

經(jīng)回歸模型預測，得到最佳酶解工藝參數(shù)為酶解時間3.96 h，酶解溫度36.71 ℃，酶底比0.5%，在此條件下DPPH自由基清除率預測值為60.979%。在實驗室驗證試驗中，為了便于操作，選取酶解時間4 h，酶解溫度37 ℃，酶底比0.5%，pH 1.0，底物質(zhì)量濃度7 g/100mL進行驗證實驗。在此工藝條件下所得富硒牡蠣肽的平均DPPH自由基清除率為(61.84±0.63)%，與模型預測值接近。

表2 響應面試驗設計及結(jié)果Table 2 Experimental design and corresponding results for respond surface analysis

表3 試驗結(jié)果方差分析Table 3 Results of variance analysis

2.2 硒含量及氨基酸組成分析

富硒牡蠣蛋白的硒含量為(1.30±0.07) mg/kg，高于DB45/T 1061—2014《富硒農(nóng)產(chǎn)品硒含量分類要求》中水產(chǎn)類硒含量指標(0.10～0.50 mg/kg)。經(jīng)胃蛋白酶酶解優(yōu)化后，所得富硒牡蠣肽的硒含量明顯增加，達到(1.62±0.20) mg/kg，為其原料蛋白的1.24倍，這一結(jié)果表明酶解優(yōu)化工藝使硒得到一定程度的富集，說明硒元素在酶解物活性方面發(fā)揮作用，特別對抗氧化活性起到關(guān)鍵作用。

由表4可知，富硒牡蠣肽中富含谷氨酸(15.51%)，天冬氨酸(9.66%)、組氨酸(8.52%)、亮氨酸(7.57%)、甘氨酸(7.44%)和精氨酸(7.44%)。研究報道，疏水性氨基酸殘基如亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸、脯氨酸及苯丙氨酸能夠提高抗氧化肽抑制脂質(zhì)過氧化的能力[17]，富硒牡蠣肽中疏水性氨基酸含量豐富(34.45%)，對肽的抗氧化活性有重要貢獻。酸性氨基酸和堿性氨基酸具有螯合促氧化的金屬離子的作用，能增強肽的抗氧化能力[17]，富硒牡蠣肽中酸性氨基酸和堿性氨基酸分別占總氨基酸含量的25.17%、18.85%，其中，谷氨酸含量最高，使富硒牡蠣肽具有較強的抗氧化活性。此外，有研究報道，富含谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸和較多的疏水性氨基酸殘基的肽通常具有很強的ACE抑制作用[18]。富硒牡蠣肽富含這些與抗氧化和ACE抑制活性相關(guān)的氨基酸，因此，富硒牡蠣肽在抗氧化和降血壓方面有極大的潛力。

表4 氨基酸分析Table 4 Amino acid analysis

2.3 富硒牡蠣肽的抗氧化活性

2.3.1 DPPH自由基清除活性

如圖2所示，在0.10～8.00 mg/mL質(zhì)量濃度下，富硒牡蠣肽對DPPH自由基的清除能力為3.98%～96.64%，且具有顯著的劑量效應。EC50值被廣泛應用于對比目標活性物的活性強弱，EC50值越低，表明清除自由基的能力越強。富硒牡蠣肽清除DPPH自由基的EC50值為1.365 mg/mL，與堇葉碎米薺硒蛋白酶解物[10][EC50:(1.14±0.11) mg/mL]接近，非常明顯低于尖吻鱸魚皮明膠水解物[19](EC50:60～87 mg/mL)和牛乳奶酪抗氧化肽[20](EC50:7.02～7.60 mg/mL)，表明富硒牡蠣肽具有較強的DPPH自由基清除活性，有機硒能增強活性肽的抗氧化效力。

圖2 富硒牡蠣肽對DPPH自由基清除活性的影響Fig.2 Effect of selenium-enriched oyster peptides on DPPH radical scavenging activity 注：不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)，相同代表差異不顯著(下同)

2.3.2 ABTS陽離子自由基清除活性

如圖3所示，富硒牡蠣肽表現(xiàn)出良好的ABTS陽離子自由基清除活性(EC50:1.074 mg/mL)，且在極低質(zhì)量濃度(0.1 mg/mL)時也顯示出ABTS陽離子自由基清除作用，具有顯著的劑量效應。富硒牡蠣肽清除ABTS陽離子自由基的能力優(yōu)于近江牡蠣多肽OP[21](EC50:6.77 mg/mL)。此外，富硒牡蠣肽清除ABTS陽離子自由基的EC50值低于清除DPPH自由基的EC50值，說明富硒牡蠣肽對ABTS陽離子自由基更敏感，能夠通過斷鏈反應防止脂質(zhì)氧化[13]。

圖3 富硒牡蠣肽對ABTS陽離子自由基清除活性的影響Fig.3 Effect of selenium-enriched oyster peptides on ABTS cation radical scavenging activity

2.3.3 細胞抗氧化能力測定

富硒牡蠣肽對HepG2細胞活力的影響結(jié)果見圖4-a，在0.5～500 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)富硒牡蠣肽對HepG2細胞無毒性作用。因此，選擇質(zhì)量濃度小于500 μg/mL的富硒牡蠣肽進行后續(xù)細胞實驗。由圖4-b可知，即使在極低的質(zhì)量濃度(0.5 μg/mL)下，富硒牡蠣肽也能發(fā)揮細胞抗氧化作用，并且隨著濃度的增加，CAA值不斷增加，呈現(xiàn)出極低的EC50值(1.114 μg/mL)，顯著低于兜唇石斛多肽DA-P[EC50=(2.88±0.14) mg/mL][22]，這進一步表明富硒牡蠣肽是極好的天然抗氧化劑來源。此外，細胞抗氧化結(jié)果與DPPH自由基、ABTS陽離子自由基清除活性結(jié)果高度一致，均表現(xiàn)出抗氧化劑濃度依賴性，證明了富硒牡蠣肽是一種穩(wěn)定高效的抗氧化劑。

a-不同濃度富硒牡蠣肽作用;b-細胞抗氧化活性圖4 富硒牡蠣肽對HepG2細胞活力的影響及其 細胞抗氧化活性Fig.4 Effects of selenium-enriched oyster peptides on the viability of HepG2 cells and its cellular antioxidant activity

2.3.4 對HepG2細胞氧化損傷的保護作用

如圖5-a所示，隨著AAPH作用濃度的增加，細胞活力逐漸降低，當用0.5 mmol/L濃度的AAPH處理細胞24 h，細胞增殖活力降至(75.72±1.12)%，與空白對照組相比具有顯著差異(P<0.05)，細胞處于適度損傷狀態(tài)(部分損傷，但未被完全殺死，有損傷修復的可能性)。因此，選擇0.5 mmol/L濃度的AAPH作用HepG2細胞24 h，建立AAPH誘導損傷HepG2細胞模型。

不同濃度的富硒牡蠣肽對HepG2細胞損傷保護的結(jié)果如圖5-b所示，當用不同濃度的富硒牡蠣肽預處理細胞時，細胞存活率隨富硒牡蠣肽的質(zhì)量濃度增加逐漸增加，表明其對氧化損傷細胞的保護作用也越強。當富硒牡蠣肽的濃度≥25 μg/mL時，細胞存活率顯著高于損傷組(P<0.05)，在100 μg/mL時細胞存活率達到(94.81±1.15)%，幾乎可以恢復到空白對照組正常細胞的水平。結(jié)果表明富硒牡蠣肽對HepG2細胞的氧化損傷具有很好的保護作用，再次證明牡蠣富硒肽具有優(yōu)異的抗氧化活性。

a-不同濃度AAPH處理;b-不同濃度富硒牡蠣肽預處理圖5 AAPH對HepG2細胞活力的影響和富硒牡蠣肽對 HepG2細胞氧化損傷的保護作用Fig.5 Effect of AAPH on the viability of HepG2 cells and protective effects of selenium-enriched oyster peptides on oxidative damage of HepG2 cells

2.4 ACE抑制活性

已有研究表明，天然活性物的抗氧化活性與降血壓活性密切相關(guān)，通常抗氧化活性強的活性物多數(shù)也具有良好的ACE抑制活性[4-5]。在上述體外化學抗氧化實驗和細胞抗氧化實驗中發(fā)現(xiàn)，富硒牡蠣肽表現(xiàn)出非常顯著的抗氧化活性，因此猜測富硒牡蠣肽具有潛在的ACE抑制活性。由圖6可知，樣品質(zhì)量濃度從0.10 mg/mL增加到8.00 mg/mL，富硒牡蠣肽的ACE抑制活性顯著升高(P<0.05)，其IC50值為2.162 mg/mL。富硒牡蠣肽的ACE抑制活性顯著高于富硒堿溶性茶蛋白酶解肽(IC50=17.07 mg/mL)[23]和蛋黃蛋白酶解物超濾組分EYUF-2[24](≤2 kDa, IC50=5.44 mg/mL)，這進一步確認了本研究的猜測，也與文獻已報道的情況相符。本研究表明，富硒牡蠣肽具有良好的ACE抑制活性，具有開發(fā)作為降血壓類藥物的潛力。

本實驗的研究結(jié)果表明相比于普通蛋白肽，富硒牡蠣肽具有更好的自由基清除能力和細胞抗氧化活性，并對氧化損傷細胞具有較強的保護作用，可作為一種穩(wěn)定有效的抗氧化劑使用。此外，富硒牡蠣肽表現(xiàn)出良好的ACE抑制活性。分析原因可能是：一方面，海洋來源的牡蠣生物活性肽本身具有優(yōu)異的抗氧化和降血壓效果；另一方面，富硒肽的活性優(yōu)于普通蛋白肽，有機硒對多肽的生物活性具有協(xié)同作用[9]。

圖6 富硒牡蠣肽對ACE抑制活性的影響Fig.6 Effect of selenium-enriched oyster peptides on ACE inhibitory activity

3 結(jié)論

本研究通過響應面方法優(yōu)化了富硒牡蠣肽的酶解制備工藝，得到最佳酶解條件為時間4 h、溫度37 ℃、酶底比0.5%、pH 1.0、底物質(zhì)量濃度7 g/100mL。氨基酸組成分析表明富硒牡蠣肽富含與抗氧化和ACE抑制活性相關(guān)的氨基酸。此外，酶解工藝優(yōu)化過程中硒的富集也可能是富硒牡蠣肽具有較好的抗氧化和ACE抑制活性的原因。從DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除能力，細胞抗氧化活性和細胞損傷保護方面對富硒牡蠣肽的抗氧化能力進行較全面的評價，并對富硒牡蠣肽的ACE抑制活性進行了探究，結(jié)果揭示了富硒牡蠣肽的抗氧化和ACE抑制效果與其濃度呈正相關(guān)，明確了富硒牡蠣肽具有較好的抗氧化和ACE抑制活性。本研究首次利用富硒牡蠣開發(fā)同時具有抗氧化和ACE抑制活性的富硒肽，后續(xù)將對富硒牡蠣肽進行純化鑒定、體內(nèi)外活性評價、構(gòu)效關(guān)系研究等，以明確其確切作用機制。