三七莖葉-滇黃精速溶粉提取工藝及抗氧化活性分析

梁正維，王曉漫，劉小蘇，張雙艷，馬燕，陳軍文，張廣輝，姜薇薇，趙銀河*，趙明*

1(云南農業大學 農學與生物技術學院 龍潤普洱茶學院，云南 昆明，650201)2(西南中藥材種質創新與利用國家地方聯合 工程研究中心 云南省藥用植物生物學重點實驗室，云南 昆明，650201)

三七[Panaxnotoginseng(Burk.) F.H.Chen]是有超過400年藥用歷史的五加科人參植物，享有“南國神草”、“金不換”等美譽。三七的干燥塊根的藥用成分以四環三萜類皂苷為主，總皂苷含量為11.24%，具有抗炎、抗動脈粥樣硬化、止血、抗腫瘤、提高免疫力及改善心腦血管等藥理作用[1-2]，此外，習峰敏等[3]研究表明三七地上莖葉部分總皂苷含量為12.98%，比塊根高出1.74個百分點，同樣具有較大產量和利用價值。CAI等[4]報道，截止2017年，三七莖葉的年產量超過2 000 kg，但有效利用率不足5%，大部分依舊被拋棄在田間地頭，造成資源的極大浪費。百合科黃精屬植物滇黃精(PolygonatumkingianumColl.et Hemsl)的干燥塊根是中國傳統中藥材，也是重要的藥食同源物品之一，以滇黃精為原料開發出的食品主要有滇黃精飲片、滇黃精面條、滇黃精糕點、滇黃精日用品[5]等，但精深加工及綜合開發利用的工藝技術還需要進一步挖掘。

韓凌[6]研究表明，人參皂苷Rb1、Rb3等原二醇型人參皂苷[20(S)-protopanaxadiol type, PPD]是三七莖葉中主要活性成分，還含有類黃酮、三七素、揮發油及γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)等成分，具有活血化瘀，舒緩神經等多種功效。目前已開發出“七葉神安滴丸”等藥品，隨著云南食品安全地方標準DBS 53024—2017 干制三七莖葉的發布，已開發了“三七莖葉茶”、“三七莖葉顆粒飲片”相關食品。滇黃精主要成分為甾體皂苷、三萜皂苷、異黃酮、多糖、苯丙素類、生物堿及揮發油等多種活性成分，具有降血糖、抗炎等功能[7-8]。研究表明，經九蒸九曬炮制后的滇黃精多糖含量下降分解為單糖、二糖或寡糖，皂苷含量增加，揮發性成分的組成和含量降低，藥性變得平和，麻味消失，提升了其抗氧化、抗疲勞、抗菌、提高免疫的能力[9]。

三七莖葉提取液可通過噴霧干燥順利制取速溶粉，但由于其中的皂苷等成分具有一定的苦味，在農產品及食品開發領域還存在一定的局限性，而經九蒸九曬炮制后的滇黃精甜味得以提升，口感柔和，性味溫和，但由于糖類的存在，以噴霧干燥法制取滇黃精速溶粉較為困難。

為提升三七莖葉的食用口感，同時改善滇黃精的噴霧干燥性能，開發出質地均勻、溶解性好、組成成分豐富的復合提取物速溶粉，本實驗以三七莖葉-九蒸九曬滇黃精片為原料，以單因素-響應面模型優化其浸提工藝，將所得提取液噴霧干燥制取三七莖葉-滇黃精速溶粉，HPLC進一步檢測速溶粉中皂苷、可溶性總糖、多酚的組成及含量，同時以對ABTS陽離子自由基、DPPH自由基、超氧陰離子自由基、羥自由基的清除能力考察該速溶粉的抗氧化活性，為三七莖葉及滇黃精的開發利用提供基礎方案。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三七莖葉，西南中藥材種質創新與利用國家地方聯合工程研究中心提供，并鑒定為五加科植物三七[Panaxnotoginseng(Burk.) F.H.Chen]的干燥莖葉部分；九蒸九制滇黃精片，西南中藥材種質創新與利用國家地方聯合工程研究中心提供，并鑒定為百合科植物滇黃精[PolygonatumkingianumColl.et Hemsl]經過九蒸九曬后的干燥塊根切片。

色譜甲醇、乙腈、甲酸，MREDA公司；98%濃硫酸(分析純)、蒽酮(分析純)、甲醇(分析純)、99.7%(體積分數)食用乙醇、超純水(電阻率18.25 MΩ·cm)、正丁醇(分析純)、石油醚(分析純)、氯仿(分析純)，西隴化工股份有限公司；人參皂苷Rb3、Rb1、Ra3、三七皂苷Fa、Fc、Fe、Fd、沒食子酸(gallic acid, GA)、咖啡酸(caffeic acid, CA)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocahechin-3-gallate, EGCG)、表兒茶素沒食子酸酯(epicatechin-3-gallate, ECG)、茶堿(theophylline)等標準品，成都曼斯特生物技術有限公司；D101(0.3～1.25 mm)大孔樹脂，北京索萊寶科技有限公司；MCI GEL CHP 20P(75～150 μm)小孔樹脂，日本三菱公司；ABTS陽離子自由基清除能力試劑盒、DPPH自由基清除能力試劑盒、超氧陰離子自由基清除能力試劑盒、羥自由基清除能力試劑盒，蘇州格瑞思生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

DHG-9070 A型臺式鼓風干燥箱，上海東麓儀器設備有限公司；JMF-320 G多級閃蒸器，河南智晶生物科技股份有限公司；YM-3000 Y型噴霧干燥機，上海豫明儀器有限公司；K6600-A全波長酶標儀，北京凱奧科技發展有限公司；Agilent LC-1290 indentify Ⅱ 超高效液相色譜系統、Agilent LC-1200 高效液相色譜系統、色譜柱Agilent poroshell EC-C18(4.6 mm×150 mm, 4 μm)、色譜柱Agilent Poroshell 120(4.6 mm×100 mm, 2.7 μm)，美國安捷倫公司；島津M0C63U快速水分測定儀，日本島津公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 噴霧干燥優化實驗

三七莖葉-滇黃精配比：先前實驗表明，滇黃精提取液富含多糖，噴霧干燥熱融化現象導致無法順利獲取速溶粉，本實驗以三七莖葉代替糊精以改善噴霧干燥效率，分別設置三七莖葉-滇黃精的質量比為8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8共6個梯度，每個梯度物料質量合計100 g，重復3次，以50%(體積分數)乙醇為浸提溶劑，料液比(g∶mL)為1∶20，浸提2次，合并過濾液，減壓濃縮至原體積1/3，于YM-3000 Y型噴霧干燥機制取速溶粉，以得粉率考察三七莖葉-滇黃精的最佳配比。

1.3.2 浸提工藝優化實驗

單因素實驗：根據上述優化的配比結果制備三七莖葉-滇黃精混合物2 000 g，粉碎后過200目標準篩，備用。準確稱取三七莖葉-滇黃精混合粉末1.00 g，分別以乙醇體積分數、料液比(g∶mL)和浸提時間為考察因素，確定不同單因素條件下的最佳浸提率。

乙醇體積分數：分別設置5個梯度的乙醇體積分數20%、30%、40%、50%、60%，以料液比(g∶mL)1∶10，浸提48 h，重復2次，以浸出率考察最佳乙醇體積分數。

料液比：依據上述結果，分別設置料液比(g∶mL)1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25，以50%體積分數的乙醇，浸提48 h，重復浸提2次，以浸出率考察最佳料液比。

浸提時間：分別設置浸提時間24、36、48、60、72 h，以料液比1∶20，50%(體積分數)乙醇浸提2次，以浸出率考察最佳浸提時間。

響應面優化實驗：根據上述單因素實驗結果，以浸出率為指標：以乙醇體積分數(A)、料液比(B)、浸提時間(C)為變量，根據WANG等[10]報道的響應面原理設計Box-Behnken中心組合試驗數學模型優化三七莖葉-滇黃精的最佳浸提工藝浸出率的計算如公式(1)所示：

(1)

式中：M0，三七莖葉-滇黃精的質量，g；M1，發皿的質量，g；M2，干燥后蒸發皿及三七莖葉-滇黃精浸膏的總質量，g；C，三七莖葉-滇黃精的含水率，%。

1.3.3 感官審評

參照WEN等[11]報道的有關速溶茶的審評方法，設置感官審評表，邀請10位具有評茶員資質的專家對三七莖葉-滇黃精速溶粉進行感官審評，以百分制計總分。

1.3.4 成分分析及抗氧化活性分析

皂苷標準溶液配制：以70%(體積分數)甲醇為溶劑，分別配制成1 mg/mL的人參皂苷Rb3、Rb1、Ra3、三七皂苷Fa、Fc、Fe、Fd單體標準品及0.1 mg/mL的混合標準品溶液。

速溶粉樣品制備：參照GUO等[12]報道的三七莖葉皂苷的純化方法，準確稱取三七莖葉-滇黃精速溶粉1.00 g，加入70%甲醇溶液50 mL，振蕩10 min，轉入D101大孔樹脂及MCI小孔樹脂反復層析至淡黃色溶液，離心取上清液，定容至50 mL，0.45 μm微孔濾膜過濾，4 ℃保存待測。

色譜條件：Agilent LC-1290 indentify Ⅱ 超高效液相色譜系統，色譜柱：Agilent poroshell EC-C18(4.6 mm×150 mm, 4 μm)。分析條件：流動相由H2O(A)和乙腈(B)組成，洗脫梯度為0～20 min，24%～25%B；20～45 min，25%～45%B；45～55 min，45%～50%B；55～60 min，50%～55%B；60～65 min，55%～60%B；65～75 min，60%B；75～75.5 min，60%～80%B；75.5～78 min，80%B。流速0.5 mL/min；進樣體積10 μL；柱溫30 ℃，檢測波長203 nm。由保留時間確定化合物，使用外標法根據峰面積定量。

可溶性總糖待測液：配制0.1 mg/mL的三七莖葉-滇黃精速溶粉溶液，參照KANG等[13]報道的0.2%蒽酮-硫酸法測定人參中可溶性總糖，于全波長酶標儀624 nm下檢測吸光度值，并通過回歸方程曲線計算可溶性總糖的含量。

多酚檢測：參照NIAN等[14]報道的兒茶素高效液相色譜分析法，制備2 mg/mL的三七莖葉-滇黃精速溶粉待測液，于Agilent LC-1200 高效液相色譜系統280 nm下檢測分析多酚組成及含量。

抗氧化活性分析：根據XIA等[15]報道的黃精抗氧化活性測定方法，測定三七莖葉-滇黃精速溶粉的抗氧化活性，且以IC50值考察其抗氧化能力。

1.3.5 數據分析

2 結果與分析

2.1 三七莖葉-滇黃精配比優化

根據三七莖葉-滇黃精質量比為8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8 六個不同條件下的噴霧干燥實驗，所得速溶粉百分比可知(圖1)，當三七莖葉與滇黃精的質量比為6∶4、含水率為10.42%時顯著高于質量比5∶5、4∶6、3∶7、2∶8條件下的得粉率(P<0.05)，與質量比為8∶2、7∶3的得粉率無顯著性差異(P>0.05)，通過初步的感官審評，質量比為6∶4所得速溶粉在口感、甜味及香味優于其他組分，因此，本實驗擬以三七莖葉-滇黃精質量比為6∶4展開浸提工藝優化實驗。

圖1 不同質量比條件下三七莖葉-滇黃精浸提液噴霧 干燥得粉率Fig.1 Rate of stems and leaves of Panax notoginseng- Polygonatum kingianum extract by spray drying at different mass ratios 注：不同小寫字母表示存在統計學上的顯著性差異(下同)

2.2 單因素優化實驗

設置乙醇體積分數為20%、30%、40%、50%、60%，料液比(g∶mL)為1∶10，浸提48 h，浸提2次。如圖2所示，在乙醇體積分數為30%積分數時，浸提率達到(49.83±0.02)%，顯著高于體積分數20%時47.56%的浸出率(P<0.05)，隨著乙醇體積分數增加至40%、50%、60%，浸出率呈下降趨勢且與體積分數為30%時的浸出率存在顯著性差異(P<0.05)，表明在此濃度下，三七莖葉-滇黃精的浸提率達到較理想的浸出率。

根據乙醇單因素試驗結果，以30%(體積分數)乙醇為溶劑，設置料液比(g∶mL)為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25共5個梯度，浸提三七莖葉-滇黃精48 h，浸提2次。如圖3所示，浸出率隨著料液比增加而呈上升趨勢，當料液比為1∶20時，均與料液比1∶15、1∶10、1∶5的浸出率存在顯著性差異(P<0.05)，但與1∶25時的浸出率差異不顯著 (P>0.05)，說明在料液比為1∶20時，可溶性成分已被大部分浸出，因此，最佳料液比將確定為1∶20。

圖2 不同體積分數的乙醇中三七莖葉-滇黃精浸出率Fig.2 Leaching rate of stems and leaves of Panax notoginseng- Polygonatum kingianum with different ethanol volume fraction

圖3 不同料液比三七莖葉-滇黃精浸出率Fig.3 Leaching rate of stem and leaves of Panax notoginseng- Polygonatum kingianum with different solid-liquid ratio

根據上述單因素結果，以30%(體積分數)乙醇、料液比(g∶mL) 1∶20，分別設置24、36、48、60、72 h浸提三七莖葉-滇黃精，浸提2次。如圖4 所示，浸提36 h時浸出率達到(49.5±0.01)%，顯著高于其他時間條件下的浸出率，因此，以浸提36 h為最佳結果。

圖4 不同浸提時間三七莖葉 - 滇黃精浸出率Fig.4 Leaching rate of stems and leaves of Panax notoginseng-Polygonatum kingianum in different times

2.3 響應面優化實驗

為進一步確定三七莖葉-滇黃精的最佳浸提工藝，參照WANG等[10]報道的Box-Behnken中心組合設計模型，以乙醇體積分數(A，20%、30%、40%)，料液比(B，1∶15、1∶20、1∶25)和浸提時間(C，24、36、48 h)的交互作用對三七莖葉-滇黃精浸出率進行響應面優化試驗，結果如表1所示。

表1 三七莖葉-滇黃精響應面優化結果Table 1 Response surface optimization results of stems and leaves of Panax notoginseng-Polygonatum kingianum

分析對各因素對本實驗結果的影響，經回歸擬合得到相應的二次回歸方程模型：浸出率(%)=52.2-0.383 8A+0.418 7B+0.245C-0.025AB+0.007 5AC+0.267 5BC-2.28A2-1.27B2-1.76C2，為進一步確證三七莖葉-滇黃精提取工藝最佳響應值，對回歸方程取一階偏導為0，求解方程得A=29.16%，B=20.87，C=37.00，理論浸出率52.27%，即理論優化條件為29.16%(體積分數)乙醇，料液比(g∶mL)為1∶20.87，浸提37.00 h，重復浸提2次。

表2 回歸模型方差分析表Table 2 Variance analysis of regression model

根據響應3D 曲面分析各因素交互作用對三七莖葉-滇黃精浸出率的影響，圖5-C的坡度最為陡峭，斜率最大，因而料液比(B)和浸提時間(C)對三七莖葉-滇黃精的浸出率有極顯著影響，這與方差分析結果相吻合(P<0.01)；由圖5-A可知，乙醇體積分數(A)和料液比(B)對三七莖葉-滇黃精浸出率也具有顯著性影響(P<0.05)，因此，料液比也決定著浸出率的高低。總之，在常溫條件下，適宜的乙醇體積分數、料液比及浸提時間均影響三七莖葉-滇黃精的浸出率，本響應面模型能較大限度地提取其中的內含物成分。

為了驗證本模型的可靠性和準確性，稱取1.00 g三七莖葉-滇黃精樣品，根據實際操作的可行性，將上述條件優化為29%(體積分數)乙醇，料液比(g∶mL)1∶21，浸提37 h，重復浸提2次，測得實際浸出率為(46.34±0.01)%，與理論浸出率52.27%存在微小波動，但是差異不大，具有一定的可用性。

為進一步將該工藝技術推廣應用，在本實驗基礎上放大1 000倍進行，即準確稱取制備好的三七莖葉-滇黃精1 kg(質量比為6∶4)作為物料(圖6-A)，以上述方法得到三七莖葉-滇黃精提取液，經90 ℃減壓濃縮至原體積的1/3，在溫度120 ℃、風速75%、進料速度8 mL/min條件下噴霧干燥，得到黃色至棕黃色的三七莖葉-滇黃精速溶粉(圖6-B)。每1 kg物料可得到(374.23±6.81) g速溶粉，得粉率37.42%，較上述優化結果偏低，根據SOBULSKA等[16]報道的有關富糖原料噴霧干燥原理，一方面可能是噴霧干燥過程中一部分粉末隨著氣流排出，另一方面可能是速溶粉掛在干燥缸壁、管道壁等部位，造成了一定的損失。

圖5 三七莖葉-滇黃精響應面優化等高線及3D曲面Fig.5 Response surface optimization contour and 3D surface of stems and leaves of Panax notoginseng- Polygonatum kingianum

2.4 感官審評

根據WEN等[11]報道的方法對三七莖葉-滇黃精速溶粉進行感官審評，棕黃色酥松粉末，質地均勻，冷熱水溶解性好，滋味微苦帶甜，入口滋味微苦回甘，香味濃郁飽滿，具有三七的特殊微苦味和九曬滇黃精的焦糖甜味，感官評分80.24分(圖6-C)。由于滇黃精富含可溶性糖、多糖等成分，該提取物久置有吸潮現象，因此需要注意干燥保存。

A-三七莖葉-滇黃精；B-三七莖葉-滇黃精速溶粉； C-三七莖葉-滇黃精速溶飲料圖6 三七莖葉-滇黃精及其速溶粉Fig.6 Stems and leaves of Panax notoginseng- Polygonatum kingianum and its instant powder

2.5 成分檢測及抗氧化活性分析

由圖7-A可知，從三七莖葉-滇黃精速溶粉中定量分析出7種皂苷化合物，含量較高的分別是三七皂苷Fa、Fd、Fc等四環三萜類皂苷，累計含量為(13.73±0.04) mg/g。

通過全波長酶標儀檢測經0.2%硫酸-蒽酮法處理后的三七莖葉-滇黃精速溶粉待測液，回歸方程為Y=3.009 5X+0.231 6,R2=0.980 6，通過吸光度計算出可溶性總糖含量為(55.44±3.21) mg/g。HPLC檢測分析到5種酚類化合物，含量最高的是CA[(3.6±0.44) mg/g]，ECG[(2.94±0.59) mg/g]及EGCG[(1.67±0.15) mg/g](圖7-B)。

通過抗氧化能力實驗及其IC50值計算結果，發現三七莖葉-滇黃精速溶粉對自由基的清除能力隨著濃度上升而增加，對ABTS陽離子自由基、超氧陰離子自由基及DPPH自由基均具有較強的清除能力，其中對ABTS陽離子自由基的清除能力最佳，其IC50值為0.41 mg/mL，與陽性對照Trolox的0.23 mg/mL較為接近(圖7-C)。

A-速溶粉中6種單體皂苷的含量；B-速溶粉中5種多酚單體含量；C-速溶粉抗氧化活性檢測，Trolox為陽性對照圖7 三七莖葉-滇黃精速溶粉成分及抗氧化活性分析Fig.7 Analysis of component and antioxidant activity in stems and leaves of Panax notoginseng-Polygonatum kingianum instant powder

3 討論

3.1 工藝優化

三七莖葉作為云南地方特色食品，深受廣大消費者的追捧，但其多功能的精深加工產品開發還不足。滇黃精作為藥食同源產品，富含多糖、薯蕷皂苷、甾體皂苷等活性成分，具有降血糖、改善身體機能等多重功效[17-18]，目前已有一些的開發利用案例，如滇黃精茶、滇黃精超微粉等。本實驗以三七莖葉-滇黃精 (質量比6∶4)為原料，通過單因素-響應面模型優化出乙醇體積分數(%)、料液比(g∶mL)及浸提時間(h)對物料浸出率的工藝，進一步在80～90 ℃條件下經減壓所得濃縮提取液，可較好地實現噴霧干燥，得到質地均勻、口味獨特、易于存儲的提取物，即三七莖葉-滇黃精速溶粉，但得粉率較理論值偏低，今后需要對噴霧干燥工藝進一步優化調整。

3.2 成分分析

三七莖葉-滇黃精速溶粉中定量分析出三七皂苷Fa等7種皂苷，TOHDA等[19]報道，Fa對退化后的腦功能可能具有一定的激活和恢復潛能，但對其功能的研究報道還較少，在今后的研究中需要進一步探索其功能和作用機制。據WANG等[20]研究表明，三七皂苷Fd通過抑制Akt/p38MAPK/NF-κB信號通路，改善反應性星形膠質細胞增生導致的神經炎癥性疾病。LIU等[21]揭示了三七皂苷Fc通過PPAR-γ途經對糖尿病引起的心血管損傷具有一定改善作用；LAI等[22]報道，人參皂苷Rb1通過抑制脂肪變性等途經減輕酒精性肝損傷。LI等[8]研究表明，滇黃精多糖通過增加小鼠胰島素受體底物-1 (insulin receptor substrate, IRS-1)、磷脂酰肌醇3激酶 (phosphatidylin-ositol-3-kinase, PI3K)和蛋白激酶B(Akt)的表達，改善糖尿病癥狀和脂質代謝，具有降血壓、提高機體免疫力、恢復身體機能的功效。本實驗未對這些標志成分進行相應分析，這在今后的實驗中需要進一步完善。

3.3 抗氧化活性分析

利用自由基試劑盒測定三七莖葉-滇黃精速溶粉的抗氧化能力，對ABTS陽離子自由基和超氧陰離子自由基的清除能力優于對羥自由基自由基的清除能力。朱玉昌等[23]報道，ABTS陽離子自由基與抗氧化劑的生物活性相關性強，表明三七莖葉-滇黃精速溶粉具有較好的生物活性。JIE等[24]表明，超氧陰離子自由基是機體內壽命最長的自由基，與許多炎癥性疾病密切相關，而三七莖葉-滇黃精速溶粉對其具有較好的清除能力，表明其抗氧化效果是較為理想的。

4 結論

以三七莖葉-滇黃精(質量比6∶4)為原料進行開發工藝研究，最佳浸提工藝為：29%(體積分數)乙醇，料液比(g∶mL) 1∶21，浸提37 h，重復浸提2次，每1 kg物料所得提取液經噴霧干燥可得三七莖葉-滇黃精速溶粉374.23 g，得粉率37.42%。速溶粉中富含皂苷、多酚、可溶性糖等活性成分，其中三七皂苷Fa、Fd、Fc、Rb3，CA、ECG、EGCG等含量較為豐富，通過抗氧化實驗反映了本實驗所得速溶粉具有較好的抗氧化能力。本研究三七莖葉-滇黃精浸提工藝為食品開發提供了基礎模型支持，所得速溶粉活性成分豐富，具有較好的食用保健價值，為三七及滇黃精的產業發展提供了科學依據。