白酒大生產(chǎn)過程中乙醇穩(wěn)定碳同位素變化特征研究

岳濤，王道兵，李安軍，姜利，李國輝，岳紅衛(wèi)，張洛琪，鐘其頂*

1(安徽古井貢酒股份有限公司，安徽 亳州，236820)2(國家市場(chǎng)監(jiān)管技術(shù)創(chuàng)新中心(輕工消費(fèi)品質(zhì)量安全)，北京，100015) 3(中輕食品檢驗(yàn)認(rèn)證有限公司，北京，100015)

白酒是中國特有的蒸餾酒產(chǎn)品，與白蘭地、蘇格蘭威士忌、伏特加、朗姆酒和杜松子酒并列為六大世界著名的蒸餾酒。白酒是傳統(tǒng)產(chǎn)品，也是滿足人們不斷進(jìn)步的物質(zhì)文化和精神文化需求不可或缺的、具有深厚歷史文化底蘊(yùn)的飲品。

近年來，隨著白酒理化分析技術(shù)和白酒現(xiàn)代勾調(diào)技術(shù)的進(jìn)步，助推了白酒產(chǎn)業(yè)高速發(fā)展，逐步形成了低端搶份額、中高端賺利潤的市場(chǎng)局面，但隨之而來的是競(jìng)爭(zhēng)壓力增大，一些不法分子摻入食用酒精冒充固態(tài)法白酒的現(xiàn)象禁而不絕，這種“摻雜”“以次充好”等違法行為嚴(yán)重干擾了白酒市場(chǎng)的健康有序發(fā)展。國內(nèi)學(xué)者很早就開始了對(duì)固態(tài)法白酒摻假的鑒別研究，并應(yīng)用了多種分析檢測(cè)技術(shù)[1-4]，但這些基于理化分析和感官特征的研究都是分析特征物質(zhì)的成分與含量，隨著檢測(cè)技術(shù)的蓬勃發(fā)展，白酒中特征物質(zhì)的成分與含量將逐一破解，制假者可以進(jìn)行“配方式”造假進(jìn)而勾兌出與品牌白酒特征相近的白酒，造成上述方法的局限性逐漸增大。

穩(wěn)定同位素技術(shù)是已被證實(shí)的可用于食品摻假檢測(cè)和真實(shí)性鑒別的有效技術(shù)手段，在葡萄酒[5]、蜂蜜[6-7]、果汁[8]等食品領(lǐng)域已得到成功應(yīng)用，而在食醋、牛奶、植物油等領(lǐng)域的研究也正在展開[9-14]。在白酒領(lǐng)域，國內(nèi)研究者也已取得一些關(guān)鍵性突破[15-16]，發(fā)現(xiàn)在白酒摻假鑒別領(lǐng)域的應(yīng)用可行性。但上述研究多是針對(duì)白酒產(chǎn)品或科研性樣品，而由于穩(wěn)定同位素的自然分餾特征以及白酒開放式、多糧多菌種混合發(fā)酵，鐘其頂?shù)萚15]曾提出應(yīng)用同位素?cái)?shù)據(jù)庫進(jìn)行白酒的真?zhèn)舞b別，也有研究[17-18]清晰分析了酒精發(fā)酵過程與蒸酒過程的影響，但白酒大生產(chǎn)條件下的同位素分餾特征和變化規(guī)律尚不明確?；诖?，本文利用該技術(shù)研究了白酒生產(chǎn)過程中乙醇穩(wěn)定碳同位素變化規(guī)律，為白酒的真?zhèn)舞b別方案制定提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2018年—2021年新生產(chǎn)的基礎(chǔ)酒(經(jīng)發(fā)酵、蒸餾而得到的未經(jīng)勾兌的酒)270個(gè)、酒醅23個(gè)、成品白酒58個(gè)，均由酒廠提供，產(chǎn)品真實(shí)性可保障。

丙酮(色譜級(jí))，上海麥克林有限公司；過二硫酸鈉、正磷酸(分析級(jí))，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；BCR 656標(biāo)準(zhǔn)品(δ13C=-26.91‰)，歐洲標(biāo)準(zhǔn)局。

1.2 儀器與設(shè)備

Trace GC Ultra氣相色譜儀、GC Isolink燃燒轉(zhuǎn)化裝置、Delta V Advantage穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜儀、DIONEX 3000液相色譜儀、LC Isolink轉(zhuǎn)化裝置，Thermo Fisher公司。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 氣相色譜-燃燒-穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜(gas chromatography-combustion-isotope ratio mass spectrometry,GC-C-IRMS)測(cè)定基礎(chǔ)酒乙醇δ13C

色譜條件：Wax毛細(xì)管柱(50 m×0.32 mm×0.20 μm)；載氣為氦氣；柱流速1.2 mL/min；進(jìn)樣口溫度 200 ℃；升溫程序：起始溫度40 ℃，保持5 min，以2 ℃/min升溫至50 ℃，然后以25 ℃/min速率升溫達(dá)到200 ℃，保持2 min。進(jìn)樣體積1 μL；分流比20∶1[17-18]。

燃燒轉(zhuǎn)化裝置：配備陶瓷(Al2O3)氧化管(填料為CuO，NiO和Pt)，工作溫度為1 000 ℃。

1.3.2 液相色譜-穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜(liquid chromatograph-isotope ratio mass spectrometry,LC-co-IRMS)測(cè)定酒醅乙醇δ13C[19]

色譜柱為Hyper REZ XP Carbohydrate H+柱(300 mm×7.7 mm，8 μm)；流動(dòng)相為超純水，流速350 μL/min；柱溫30 ℃，進(jìn)樣體積10 μL。磷酸溶液和過二硫酸鈉溶液作為反應(yīng)助劑，流速0.05 mL/min。

1.4 結(jié)果計(jì)算

由于自然界中各元素的輕重同位素比值(R)變化程度較小，國際上通常采用相對(duì)測(cè)量法表示物質(zhì)的同位素比值，碳元素的穩(wěn)定同位素特征均以國際基準(zhǔn)物質(zhì)為參照，δ(千分差，‰)的計(jì)算如公式(1)所示：

δ13C/‰=(R樣品/R標(biāo)準(zhǔn)-1)×1 000

(1)

式中：R=13C/12C；R樣品為被測(cè)樣品的同位素比值，R標(biāo)準(zhǔn)為國際基準(zhǔn)物質(zhì)的同位素比值。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒸酒過程對(duì)穩(wěn)定同位素特征的影響

MOUSSA等[20]研究Cadiot旋轉(zhuǎn)帶蒸餾系統(tǒng)提取溶液中乙醇時(shí)發(fā)現(xiàn)，回收率不同時(shí)乙醇的氫同位素特征是不同的，而是隨回收率的提高而偏負(fù)；BAUDLER等[21]研究白蘭地時(shí)發(fā)現(xiàn)乙醇的碳同位素特征隨著蒸酒過程進(jìn)行而逐漸偏負(fù)，這是由于蒸餾過程中發(fā)生了反蒸汽壓分餾作用，含13C的、質(zhì)量數(shù)大的乙醇分子優(yōu)先被氣化而存在于氣態(tài)乙醇中，該部分乙醇最先流出蒸餾器而顯示出相對(duì)偏正的碳同位素特征；張倩等[18]用不同的發(fā)酵液模擬蒸餾過程研究時(shí)也發(fā)現(xiàn)了上述變化。為研究白酒大生產(chǎn)過程中的乙醇碳同位素變化情況，選取一批酒醅和其蒸酒過程，每1 min取樣1次，測(cè)定各樣品的乙醇δ13C值，結(jié)果見圖1。其中第0次是酒醅中的乙醇δ13C值，并作為零點(diǎn)。

由圖1可知，白酒的蒸酒過程中，第15 min以前的流出液中乙醇δ13C均比酒醅偏正，之后才相對(duì)偏負(fù)，并且餾分乙醇δ13C呈現(xiàn)出逐漸偏負(fù)的趨勢(shì)，這說明白酒大生產(chǎn)條件下，蒸酒工藝也會(huì)使得乙醇碳同位素出現(xiàn)反蒸氣壓分餾效應(yīng)。本研究中各餾分乙醇δ13C最大差異可達(dá)2‰，與BAUDLER等[21]的研究結(jié)果一致。因此，若按照鐘其頂?shù)萚15]提出的基于真實(shí)樣品建立白酒數(shù)據(jù)庫的建議，在摘酒過程中取樣是不可行的，其不能代表白酒的真實(shí)特征。

圖1 白酒蒸酒過程中乙醇δ13C的變化Fig.1 Ethanol δ13C variation during distillation

2.2 酒醅與基礎(chǔ)酒的乙醇δ13C對(duì)應(yīng)關(guān)系研究

王道兵等[17]和張倩等[18]的研究表明發(fā)酵底物是乙醇δ13C分布特征的決定性因素。研究酒醅與基礎(chǔ)酒的乙醇δ13C對(duì)應(yīng)關(guān)系，分別選擇6個(gè)窖池進(jìn)行跟蹤研究，分別取上中下層酒醅，并從蒸酒后的混合樣中取基礎(chǔ)酒樣品，分別測(cè)定乙醇δ13C值，研究酒醅與基礎(chǔ)酒中乙醇δ13C對(duì)應(yīng)關(guān)系，結(jié)果見表1。

表1 基礎(chǔ)酒與酒醅的乙醇δ13C之間的差異分析(Δ13C ‰)Table 1 Ethanol δ13C difference between alcohol fermentative material and crude spirits (Δ13C ‰)

由表1可知，上中下3層酒醅與基礎(chǔ)酒乙醇δ13C之間的差異的平均值分別為0.01‰、0.06‰和-0.05‰，這說明酒醅與基礎(chǔ)酒具有很好的一致性，雖然2.1中表明蒸酒過程會(huì)導(dǎo)致乙醇碳同位素分餾，但由于基礎(chǔ)酒是不同酒段樣品的混合樣，涵蓋了比酒醅偏正和偏負(fù)的大部分餾分，因此蒸酒過程不會(huì)改變酒醅的乙醇δ13C分布特征，可通過分析酒醅推測(cè)其基礎(chǔ)酒的乙醇碳同位素特征。

2.3 糧食發(fā)酵過程中乙醇δ13C變化

白酒生產(chǎn)時(shí)會(huì)用到多種糧食，包括高粱、玉米、小麥、大米等，其淀粉含量、淀粉形態(tài)及顆粒的堅(jiān)硬程度均有所差異，選擇了1個(gè)窖池，在發(fā)酵過程中每隔7 d取酒醅，測(cè)定酒醅的乙醇δ13C值。以上層酒醅第1個(gè)樣品的乙醇δ13C值為零點(diǎn)，對(duì)比分析各酒醅的同位素特征，結(jié)果見圖2。

圖2 發(fā)酵過程中乙醇δ13C變化特征Fig.2 Ethanol δ13C variation during fermentation

圖2顯示出隨著發(fā)酵逐漸深入，乙醇δ13C值略有不同,并且呈現(xiàn)逐漸偏正的趨勢(shì)，這是由于白酒屬于復(fù)合菌群多糧發(fā)酵過程，糧食糊化入池發(fā)酵后與微生物的結(jié)合程度不同，可能存在某類糧食優(yōu)先被微生物利用的情況，但總的來說都在一定范圍內(nèi)(極差<1‰)，各樣品間的差異不大，因此取發(fā)酵過程酒醅可以作為質(zhì)量監(jiān)控的一環(huán)，用作發(fā)酵完成后酒醅乙醇δ13C值的參考。

2.4 基礎(chǔ)酒乙醇δ13C變化

作為各類型白酒產(chǎn)品基礎(chǔ)的基礎(chǔ)酒，其穩(wěn)定性決定了產(chǎn)品的特征。研究不同生產(chǎn)時(shí)間的基礎(chǔ)酒的乙醇δ13C特征，固定1個(gè)生產(chǎn)班組，每隔3 d共取樣112個(gè)，測(cè)定各酒樣的乙醇δ13C。以第1個(gè)樣品的乙醇δ13C值為零點(diǎn)作圖，結(jié)果見圖3。

圖3 不同基礎(chǔ)酒的乙醇δ13C特征Fig.3 Ethanol δ13C characteristics of crude spirits between different batches

由圖3可知本次跟蹤研究的基礎(chǔ)酒，不同樣品之間乙醇δ13C最大差異≤1‰，表明由于生產(chǎn)工藝條件相似、糧曲配比相同，乙醇的碳同位素特征是比較穩(wěn)定的；而在一定范圍內(nèi)波動(dòng)的原因可能是不同產(chǎn)地糧谷原料的同位素差異導(dǎo)致。

連續(xù)4年收集96個(gè)基礎(chǔ)酒樣品(n分別為7、43、9和36)，分別測(cè)定各樣品的乙醇δ13C值，分析結(jié)果見圖4(縱坐標(biāo)單位刻度為1%)。

圖4 不同年份基礎(chǔ)酒的乙醇δ13C分布Fig.4 Ethanol δ13C distribution of crude spirits in different year

圖4顯示，不同年份的基礎(chǔ)酒并無顯著性差異，但也不完全相同(極差分別為0.61‰、1.97‰、0.46‰和1.16‰)，這是由于白酒企業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)，生產(chǎn)用糧中碳水化合物的穩(wěn)定同位素特征隨產(chǎn)地、年份、品種而有差異的緣故。有研究表明，同一類含糖物料由于產(chǎn)地、年份不同時(shí)，δ13C值的最大差異可達(dá)5‰，因此，乙醇δ13C的實(shí)際應(yīng)用中需考慮此差異問題[22]。

2.5 白酒產(chǎn)品乙醇δ13C變化

收集了某酒廠2018/2019年度的多批次多糧(配比一致)釀造的同一品牌的白酒產(chǎn)品樣品58個(gè)，檢測(cè)各白酒樣品乙醇δ13C值，以第1個(gè)白酒樣品為零點(diǎn)作圖，結(jié)果見圖5。

圖5 同一酒廠2018/2019年度白酒乙醇δ13C變化Fig.5 Ethanol δ13C variation of Baijiu from one manufacture in 2018/2019

圖5顯示，該酒廠2018/2019年度生產(chǎn)的多批次白酒乙醇δ13C 均值最大差異為0.96‰，<1‰，并且標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.25‰，這說明同一酒廠釀酒糧食配比一致的情況下白酒乙醇δ13C無顯著影響。但是，也要注意到該類型產(chǎn)品呈現(xiàn)微小的逐漸偏正的趨勢(shì)，這可能是由于基礎(chǔ)酒的穩(wěn)定同位素特征存在自然波動(dòng)的緣故，而基礎(chǔ)酒的乙醇δ13C必然與其對(duì)應(yīng)的糧食有關(guān)?？紤]到此波動(dòng)性，白酒乙醇δ13C在用于外源食用酒精檢測(cè)時(shí)不能簡(jiǎn)單設(shè)置統(tǒng)一的判定閾值，而是應(yīng)以數(shù)據(jù)庫為前提開展真實(shí)性保障和摻假檢測(cè)應(yīng)用。

3 結(jié)論

通過長期跟蹤試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，基礎(chǔ)酒和成品酒的乙醇δ13C值均不是恒定值，而發(fā)生變化的原因在于乙醇δ13C值受釀酒原料的δ13C特征的影響，因此盡管白酒乙醇δ13C應(yīng)用于外源食用酒精檢測(cè)在理論上是可行的，但不能簡(jiǎn)單設(shè)置統(tǒng)一的判定閾值，而是應(yīng)以數(shù)據(jù)庫為前提或以原酒的δ13C真實(shí)值為基礎(chǔ)開展真實(shí)性保障和摻假檢測(cè)應(yīng)用。并且，蒸酒過程中會(huì)導(dǎo)致乙醇δ13C發(fā)生反蒸氣壓分餾效應(yīng)，因此蒸酒過程中的取樣可能導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果失真，但同批次酒醅蒸酒后混合的基礎(chǔ)酒，可作為“真實(shí)樣品”用于數(shù)據(jù)庫的建設(shè)。