嗜鹽白蟻菌褐藻膠裂解酶的重組表達與改造優化

吳雯，朱風帥，俞嘉樂，李恒*，龔勁松，許正宏，史勁松

1(糖化學與生物技術教育部重點實驗室，江南大學 生命科學與健康工程學院，江蘇 無錫，214122)2(糧食發酵與食品生物制造 國家工程研究中心，江南大學，江蘇 無錫，214122)3(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)

褐藻膠是海洋多糖資源中含量最為豐富的一類多糖，由β-D-甘露糖醛酸(β-D-mannuronic，M)和α-L-古羅糖醛酸(α-L-guluronic，G)通過β-1,4糖苷鍵連接而成[1]。褐藻膠分子質量大、黏度高，對其充分利用開發的基礎是高效降解為較低分子質量的低聚糖。褐藻膠寡糖不僅改善了多糖物化性質的局限性，同時具有抗炎、抑菌、抗腫瘤、免疫與腸道菌群調節等多種生理活性[2-3]。我國首個獲批的通過靶向腦-腸軸治療阿爾茨海默癥的新藥——甘露特鈉膠囊(代號GV-971，商品名“九期一”)，即是以褐藻提取物為原料衍生制備得到的低分子酸性寡糖化合物，這也進一步推動了海洋功能糖資源開發方向的研究。

褐藻膠裂解酶是高效、特異性降解褐藻膠的一種重要工具酶[4-5]，所得寡糖產物在非還原端糖醛酸殘基C4與C5間形成的不飽和雙鍵有利于進一步結構改造和衍生開發。褐藻膠裂解酶可以廣泛地從海洋動物、海洋藻類及微生物等多種來源中分離得到，其中，微生物來源的酶最為豐富，已達上百種，如IsoptericolahalotoleransWX[6]、Sphingomonassp.MJ-3[7]和Flavobacteriumsp.S20[8]等。然而，野生菌產酶普遍存在酶活力低、穩定性差、難分離等問題，這些可借助基因工程技術對酶的高效表達而有效改善。褐藻膠裂解酶的重組表達體系以大腸桿菌(Escherichiacoli)為主。比較來看，枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)作為另一種表達外源蛋白的成熟工具菌株，具有更為突出的蛋白分泌能力[9-10]，且已被美國食品和藥物管理局和歐洲食品安全局批準為可食用的安全菌株[10]。目前，利用芽孢桿菌表達褐藻膠裂解酶的工作還較少，表達后的酶活力也普遍偏低，如來源于Flavobacteriumsp.strain A1的褐藻膠裂解酶A1-Ⅲ，在枯草芽孢桿菌中的表達量為0.3 g/L[11]；本課題組前期構建的一株產褐藻膠裂解酶的BacillussubtilisWB600/pMA5-aly-cob酶活力也僅21.71 U/mL，表明利用枯草芽孢桿菌體系重組表達褐藻膠裂解酶的研究還有待深入。

實驗室前期從腐爛海帶中分離得到一株I.halotoleransWX，野生菌產酶活力達到432 U/mL[12]，具有良好的降解褐藻膠的能力。本研究通過基因克隆的方法獲得了褐藻膠裂解酶產酶基因aly-ih，構建了枯草芽胞桿菌工程菌，并聯合通過啟動子改造、培養基優化的方法提高褐藻膠裂解酶的活力，為進一步推動該酶及其降解產物的應用提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

I.halotoleransWX、E.coliJM109、B.subtilisWB600和質粒pMA5保存在本實驗室；Taq、PrimerSTAR HS、DpnI、DNA聚合酶，TaKaRa公司；ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit，諾維贊生物科技股份有限公司；聚β-D-甘露糖醛酸(pM，>97%)和聚α-L-古羅糖酸(pG，>97%)，青島博智匯力生物技術有限公司；其余試劑均購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

UV-2100紫外分光光度計，美國尤尼柯儀器有限公司；T100熱循環PCR儀，美國Bio-Rad公司；NanoDrop One/OneC微量核酸蛋白濃度測定儀，美國Thermo Fisher科技公司；SW-CJ-2FD/2F超凈工作臺、SPX-250B-Z生化培養箱，上海博迅實業有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 褐藻膠裂解酶的異源表達

以菌株I.halotoleransWX基因組為模板，設計特異性引物為aly-ih-F:aaatcagggggatccATGAGACTCCACCGCA；aly-ih-R:acctctagaacgcgtTCAGGAGTGCTTGA(小寫字母為同源臂)，將擴增出的目的片段與酶切后的pMA5線性質粒進行同源重組連接，通過熱擊法將連接產物導入克隆宿主E.coliJM109感受態細胞，挑取轉化子進行PCR及測序驗證。對測序驗證正確提取質粒，導入表達宿主B.subtilisWB600中，挑取轉化子進行PCR驗證并測序驗證。將構建好的重組表達質粒命名為pMA5-aly-ih，工程菌命名為B.subtilis-pMA5-aly-ih。

1.3.2 工程菌發酵條件及酶活力測定

工程菌在含0.1%(體積分數)卡那霉素的LB培養基中過夜培養，之后按照1%(體積分數)的接種量接種于TB培養基中，37 ℃、220 r/min發酵36 h。離心分別收集上清液和菌體用于測定胞外與胞內酶活力。采用改良3，5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid，DNS)法[12]測量還原糖濃度。將0.1 mL酶液加入0.9 mL 10 g/L 海藻酸鈉溶液中，混勻后于45 ℃反應20 min，然后向體系中加入1 mL DNS，沸水浴3 min終止反應，迅速定容至10 mL，吸取200 μL 加入96孔板，于520 nm 處測定吸光值。對照組為去離子水。1個酶活力單位(U)定義：上述條件下，1 mL 的酶液每分鐘產生1 μg 還原糖所需的酶量。

1.3.3 SDS-PAGE分析驗證

將收集的胞外粗酶樣品與4倍 Loading Buffer混合，置于100 ℃金屬浴5 min，使蛋白變性。Maker與變性后的蛋白上樣量分別為5、20 μL。電泳條件為80 V，30 min以及120 V，70 min。最后用考馬斯亮藍染色2 h，再利用洗脫液[V(水)∶V(甲醇)∶V(冰醋酸)=6∶3∶1]脫至背景無色，拍照分析。

1.3.4 啟動子改造

從NCBI數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的B.subtilis168(ACCESSION:NC_000 964)基因組中獲得組成型或自誘導型啟動子的基因序列，包括trnQ、sigX、yolA、wapA、gapB、cdd、veg、mpr、nprE、aprE、epr、bpr、nprB、pst、gsiB、srfA共16條啟動子序列。以B.subtilis168 基因組為模板，分別采用表1所示的引物擴增啟動子序列，以 pMA5 質粒為模板，擴增去除原有啟動子HpaII的全質粒片段；之后利用同源重組的方法將待替換啟動子序列插入至原啟動子位置。將重組質粒轉化至E.coliJM109感受態細胞進行擴增和鑒定后，轉化至表達宿主B.subtilisWB600感受態細胞。通過酶活力比較，篩選合適的啟動子。進一步考查啟動子拷貝數的影響，以篩選得到的重組質粒mpr-pMA5-aly-ih為模板，擴增其全質粒片段，同上采用同源重組的方法將啟動子mpr添加到原有mpr序列后，獲得啟動子拷貝數為2的重組質粒mpr×2-pMA5-aly-ih，工程菌命名為B.subtilis-mpr×2-pMA5-aly-ih。啟動子拷貝數為3和4的構建方法以此類推。

表1 擴增啟動子的引物序列Table 1 Primer sequences for promoter amplification

1.3.5 褐藻膠裂解酶培養基優化

(1)碳源種類篩選及濃度優化:選擇初始質量濃度為4 g/L的甘油、玉米糊精、D-無水葡萄糖、D-麥芽糖、可溶性淀粉和蔗糖；對篩選得到的碳源進一步優化濃度，設置質量濃度為1、4、8、12、16、20、24、28 g/L。

(2)氮源種類篩選及濃度優化:初始質量濃度為12 g/L的胰蛋白胨、蛋白胨、棉籽餅粉、大豆蛋白胨、酵母浸膏、玉米漿；對篩選得到的氮源進一步優化濃度，設置質量濃度為1、4、8、12、16、20、24、28 g/L。

(3)金屬離子種類篩選及濃度優化:初始濃度均為2 mmol/L Na+、K+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Ca2+、Mn2+、Fe2+(對應的試劑分別為氯化鈉、硫酸鉀、硫酸鎂、硫酸鋅、無水硫酸銅、氯化鈣、五水合硫酸錳、七水合硫酸亞鐵)；對篩選得到的金屬離子進一步優化濃度，設置濃度為2、4、6、10、15、20、25、30 mmol/L。

分別按照上述培養基的配方優化褐藻膠裂解酶發酵培養基，發酵條件按照實驗步驟1.3.2。

1.3.6 褐藻膠酶解

配制質量濃度分別為1、5、10 g/L的海藻酸鈉底物溶液，酶解4 h，分別在0.2、0.5、1、1.5、2.0、2.5、3、3.5、4 h時取樣測定還原糖含量，方法同1.3.2。

1.3.7 褐藻膠寡糖平均聚合度測定

采用苯酚-硫酸法測定總糖濃度[13]，以總糖濃度與還原糖濃度的比值定義為平均聚合度，監測酶解過程。

2 結果與分析

2.1 重組褐藻膠裂解酶的構建與表達

2.1.1 工程菌的構建

從實驗室前期篩選的I.halotoleransWX中克隆得到一段大小為771 bp的序列(圖1-a)，編碼 256個氨基酸殘基，其中信號肽序列為Met 1-Ala 32(圖2)。以限制性內切酶BamH I和MluI對表達質粒pMA5進行雙酶切(圖1-b)，通過同源重組構建重組質粒，隨后轉化至表達宿主菌B.subtilisWB600感受態細胞中。結果表明，重組質粒的PCR產物在771 bp處有單一條帶(圖1-c)。測序正確的重組質粒命名為pMA5-aly-ih，工程菌命名為B.subtilis-pMA5-aly-ih。

2.1.2 重組褐藻膠裂解酶的表達及酶活力測定

將構建成功的B.subtilis-pMA5-aly-ih工程菌進行搖瓶發酵。分別測定發酵上清液及胞內酶活力，結果如表2所示，重組酶Aly-IH主要分泌到胞外，酶活力約30.3 U/mL。通過SDS-PAGE分析后發現，在25～35 kDa有1條單一、明亮的條帶(圖3)，與Aly-IH蛋白理論分子質量28 kDa吻合。依據文獻[14]中有關褐藻膠裂解酶分類，該酶屬于低分子質量的褐藻膠裂解酶。

a-褐藻膠裂解酶基因aly-ih擴增(M-2 000 bp DNA Maker；1-aly-ih擴增 產物)；b-雙酶切后的pMA5質粒(M- 10 000 bp DNA Maker；1-BamH I 和Mul I酶切后的pMA5質粒)；c-工程菌B.subtilis-pMA5-aly-ih 驗證(M-2 000 bp DNA Maker；1-B.subtilis-pMA5- aly-ih PCR驗證)圖1 重組表達載體的構建Fig.1 Construction of recombinant expression vector

圖2 褐藻膠裂解酶Aly-IH的氨基酸序列Fig.2 Amino acid sequence of Aly-IH 注:紅色方框表示信號肽

表2 工程菌發酵產酶活力Table 2 Enzymatic activity of recombinant enzyme

M-Marker；1-重組表達后的Aly-IH圖3 重組褐藻膠裂解酶SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of recombinant alginate lyase

2.2 褐藻膠裂解酶Aly-IH的啟動子改造

2.2.1 啟動子替換

將內源性啟動子HpaⅡ替換為B.subtilis168來源的16條啟動子。結果顯示，啟動子替換為sigX、P43、epr、bpr、nprB、pst、srfA后，Aly-IH的酶活力提高了20%～53%；替換為nprE和aprE后，酶活力提高至2.8倍；替換為veg和mpr后，酶活力提高最為顯著，特別是啟動子mpr，可以將酶活力提高至初始酶活力的4倍(圖4)。因此，選擇mpr作為進一步優化的啟動子序列。

圖4 啟動子替換對酶活力的影響Fig.4 Effect of promoter on enzymatic activity

2.2.2 啟動子拷貝數優化

通過啟動子串聯提高mpr拷貝數。相較于單啟動子，通過多拷貝啟動子優化后，酶活力隨拷貝數增加而增加，當拷貝數為3時，發酵36 h時Aly-IH酶活力最高可達到154 U/mL?？截悢颠M一步增加時酶活力降低。結合工程菌的生長曲線分析發現，高拷貝數影響菌體生長，隨拷貝數增加，OD600值逐漸下降，在發酵36 h時，OD600值由12.1降至10.2。依據酶活力，后續研究選擇mpr拷貝數為3的工程菌作進一步優化。

a-啟動子拷貝數優化后Aly-IH酶活力；b-啟動子拷貝數優化后工程菌生長曲線圖5 啟動子拷貝數的影響Fig.5 Effect of promoter copy number

2.3 褐藻膠裂解酶的培養基優化

2.3.1 碳源優化

選擇初始質量濃度為4 g/L的甘油、玉米糊精、D-無水葡萄糖、D-麥芽糖、可溶性淀粉和蔗糖作為碳源進行優化。相較其他碳源，甘油培養時OD600值最高，酶活力也略高于其他種類碳源(圖6)。進一步優化甘油濃度發現，質量濃度在16 g/L時酶活力最高，同時隨著甘油濃度的提高菌體生長量呈現下降趨勢。這說明甘油有利于菌體生長和產酶，但過高濃度可能會影響甘油代謝酶促反應進而影響菌株生長和產酶[15]。

a-碳源種類；b-甘油濃度優化圖6 碳源對生長與產酶的影響Fig.6 Effect of carbon source on strain growth and enzymatic activity

2.3.2 氮源優化

分別以初始質量濃度為12 g/L的胰蛋白胨、蛋白胨、棉籽粉、酵母浸膏、大豆蛋白胨和玉米漿作為氮源進行發酵優化培養。結果顯示，大豆蛋白胨為氮源時菌體生長與產酶情況均較好(圖7-a)。進一步優化得到大豆蛋白胨最優添加質量濃度為16 g/L。過高濃度的大豆蛋白胨引起酶活力和OD600值的下降(圖7-b)。經氮源優化后Aly-IH酶活力達到220 U/mL左右。

2.3.3 金屬離子優化

考查初始濃度為2 mmol/L的Na+、K+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Ca2+、Mn2+、Fe2+的不同金屬離子對酶活力的影響。添加K+、Zn2+、Mg2+、Ca2+、Mn2+可顯著提高酶活力(圖8-a)，特別是添加Mn2+時，酶活力和OD600值分別達到230 U/mL和9.6，效果最佳。繼續探究不同濃度Mn2+對酶活力的影響發現，Mn2+濃度的增加可促進酶活力的提高，當增加至25 mmol/L時酶活力達到最高，為320 U/mL，進一步提高濃度則表現出明顯的抑制作用(圖8-b)。說明過高濃度的Mn2+對產酶有一定的副作用。

a-氮源種類；b-大豆蛋白胨濃度優化圖7 氮源對生長與產酶的影響Fig.7 Effect of nitrogen source on strain growth and enzymatic activity

a-金屬離子種類；b-Mn2+濃度優化圖8 金屬離子對生長與產酶的影響Fig.8 Effect of metal ion on strain growth and enzymatic activity

2.4 褐藻膠裂解酶的酶解應用

為了探究Aly-IH降解海藻酸鈉的情況，分別選取1、5、10 g/L的底物進行酶解實驗。如圖9-a所示，酶解0～2 h，酶解液中還原糖濃度隨時間延長而迅速增加；2 h時，酶解速率降低，還原糖濃度增加緩慢；進一步延長時間并不能顯著促進酶解。不同底物濃度下酶解行為基本相同，酶解在3 h均達到終點。平均聚合度測定結果顯示，低濃度底物酶解時，底物快速降解，但隨酶解過程的進行，不同濃度底物酶解的最終產物平均聚合度均為2.3(圖9-b)。

a-還原糖產生量變化；b-平均聚合度變化圖9 海藻酸鈉的酶解與產物平均聚合度的測定Fig.9 Enzymatic hydrolysis of sodium alginate and determination of the average degree of polymerization of hydrolysates

3 結論與討論

褐藻膠裂解酶可高效且特異性降解褐藻膠制備褐藻膠寡糖，在海洋多糖利用開發中具有重要應用[16]。從海洋等環境樣本中獲得的大部分野生酶存在活力弱、產量低、難分離等問題，這在一定程度上限制了其推廣應用。利用基因工程技術進行酶的表達和改造是進一步提高褐藻膠裂解酶活力的有效途徑。目前，褐藻膠裂解酶的異源表達體系多為大腸桿菌，如來源于Vibriosp.NJ04的AlgNJ04比酶活力達2 416 U/mg[17]，來源于Microbulbifersp.BY17的BY17PV7比酶活力達(150.42±3.32) U/mg[18]。與此相比，枯草芽孢桿菌因其強大的蛋白分泌能力，可大大簡化重組酶下游分離的流程和投入，是食品、藥品行業中眾多重組酶分泌表達的理想宿主。但是目前報道的利用枯草芽孢桿菌成功表達的褐藻膠裂解酶還不多，且酶活力普遍不高。RHEIN-KNUDSEN等[19]最新報道了來源于北極大洋中脊(AMOR)宏基因組文庫里的嗜熱褐藻膠裂解酶AMOR-PL7 和AMOR-PL17，發酵50 h后還原糖濃度分別為3.5、2.5 mmol/L，酶活力換算約為315、225 U/mL(OD600值分別為9和7)?，F階段，借助發酵技術可顯著提高枯草芽孢桿菌產酶水平，如黃桿菌來源的褐藻膠裂解酶rFlAlyA在枯草芽孢桿菌表達后，通過高密度發酵OD600值達85，最高酶活力為2 550 U/mL[20]。南寧漢和生物與中科院天津工生所合作，采用枯草芽孢桿菌發酵產褐藻膠裂解酶實現酶活力全球最高。因此，進一步利用B.subtilis體系探究并提高褐藻膠裂解酶的催化性能具有良好的應用潛力。從實驗室前期篩得的一株高產褐藻膠裂解酶的菌株I.halotoleransWX中成功克隆出一段褐藻膠裂解酶基因aly-ih，基因全長771 bp，編碼256個氨基酸。進而構建了1株B.subtilis-pMA5-aly-ih工程菌，蛋白電泳結果顯示該重組褐藻膠裂解酶Aly-IH分子質量為28 kDa，與理論分子質量及野生菌產酶特性相符[12]，酶活力為30.3 U/mL。

在現代酶工程研究領域中，基因元件的精細表達與調控是高效提升酶的催化與應用性能的策略之一。啟動子序列是決定RNA聚合酶轉錄識別效率的重要因素，與目的蛋白的表達水平密切相關[21]。因此選擇合適的啟動子是提高蛋白產量的重要手段[22]。本研究中，采用啟動子替換及拷貝數優化的方法考查啟動子元件對褐藻膠裂解酶表達的影響。實驗從B.subtilis168基因組中獲得16種組成型或自誘導型啟動子序列，將內源性啟動子HpaⅡ換成mpr后，酶活力較初始增加至4倍。進一步優化啟動子拷貝數提高轉錄強度，發現串聯后的多拷貝啟動子能促進褐藻膠裂解的酶活力提升，但同時也一定程度上抑制菌體生長[23]，其中mpr拷貝數為3時，酶活力最高且生長未受顯著影響。在此基礎上，優化菌株培養條件，通過碳源、氮源和金屬離子的種類與濃度的優化，Aly-IH酶活力達到320 U/mL，較初始酶活力提高至10.7倍?？疾锳ly-IH酶解褐藻膠的性能，該酶在0.5 h內快速降解底物，3 h即完成酶解，所得寡糖產物的平均聚合度為2.3。由于該酶是內切酶，且酶解產物主要為2-6糖，結合其降解特性可推測酶解產物中含有大量二糖，說明該酶具有較高的酶解效率。酶解產物的定量分析以及酶進一步改造優化工作仍在進行中。

本研究構建B.subtilis-pMA5-aly-ih工程菌，通過同源重組方法對其進行啟動子改造，并通過培養基優化使褐藻膠裂解酶的酶活力由初始30.3 U/mL提高至320 U/mL，可高效酶解獲得平均聚合度為2.3的寡糖產物。這為進一步拓展褐藻膠裂解酶在枯草芽孢桿菌體系中的表達及其在食藥行業的應用奠定了基礎。