七烯甲萘醌合成過程中關鍵蛋白的定位分析

陳奇，張智航，夏洪志，孫怡，金柯，呂雪芹，崔世修，劉龍*

1(江南大學,糖化學與生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)2(江南大學,未來食品中心，江蘇 無錫，214122) 3(南通勵成生物工程有限公司，江蘇 南通，226010)

維生素K2是一類重要的脂溶性維生素，根據側鏈異戊二烯基數目的不同，可以分為多種亞型，如四烯甲萘醌(menaquinone-4, MK-4)、七烯甲萘醌(menaquinone-7, MK-7)、八稀甲萘醌(menaquinone-8,MK-8)等[1]。維生素K2在治療骨質疏松和心血管硬化等疾病中發揮重要作用[2]。目前，維生素K2主要通過微生物發酵的方法獲取。菌種之間生理特性存在差異，導致不同的菌種合成的維生素K2類型不同，比如大腸桿菌(Escherichiacoli)主要合成MK-4和MK-8[3]，芽孢類細菌主要合成MK-7[4]。在維生素K2的眾多亞型中，MK-7在人體內的半衰期更長，具有良好的親和性[1]，且近期有研究表明MK-7能夠降低發生線粒體功能障礙與帕金森疾病的風險[5]。這些重要的功能使MK-7受到了越來越多的重視，但其生產效率的低下限制了其產業化的進程。

MK-7的結構由2-甲基-(1,4)-萘醌核(1,4-dihydroxy-2-naphthoic acid,DHNA)及C-3位的脂肪側鏈(C35)組成。在原核生物中，DHNA是由分支酸經過7步催化獲得，側鏈由丙酮酸和甘油醛-3-磷酸經過甲基赤蘚糖醇-4-磷酸途徑(methylerythritol-4-phosphate pathway, MEP pathway)獲得[6]。在1,4-二羥基-2-萘甲酸異戊二烯基轉移酶(1,4-dihydroxy-2-naphthoic acid prenyltransferase, MenA)的作用下將側鏈轉移到DHNA的C2的位置上，形成2-脫甲基甲萘醌[7]。然后，在甲基轉移酶(methyltransferase，MenH)的作用下在C3的位置上增加一個甲基，最終生成MK-7[8](圖1)。很多研究通過增加menA的表達量實現維生素K2的高效合成，比如在E.coli中組成型過表達menA和menD，相比于野生型菌株，八烯甲萘醌的產量提高了5倍[3]。在納豆芽孢桿菌(Bacillussubtilisnatto)中，HU等[9]確定了D78、D84、D208和D212位天冬氨酸在保持MenA活性發揮重要作用，并通過定點突變技術獲得Q67R突變體，提高MenA活力，促進了MK-7的合成。在枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)中，通過在不同位點增加menA開放閱讀框的拷貝數，MK-7的產量達到75 mg/L，相比于出發菌株提高了約2.3倍[10]。盡管MenA在MK-7的合成過程中起到重要作用，但是對MK-7合成途徑中關鍵基因性質的研究還較少，限制了MK-7產量的進一步提高。

研究表明MK-7是細胞膜的組成成分[11]，在電子傳遞的過程中起到電子載體的作用[12]，但是關于MK-7進出細胞膜的過程機制卻缺少相關報告[13]。針對此問題，結合前期實驗結果，我們發現MenA和MenH是MK-7合成途徑過程中的關鍵酶，并且通過(http:// www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預測MenA和MenH的結構特點，發現MenA具有8個明顯的跨膜結構域。為了確認MenA和MenH在細胞中的定位，我們將MenA、MenH與eGFP進行融合，通過綠色熒光蛋白分布確定MenA和MenH位于細胞膜中，進一步發現MenA和MenH在細胞膜上出現隨機聚集的現象。實驗結果表明，MenA與MenH位于細胞膜，并且MenH在細胞膜中呈現點狀分布。然后，利用表面活性劑Triton-100能夠破壞細胞膜結構的特性，驗證細胞膜的完整性對MK-7合成的影響。在發酵培養基中的Triton-100體積分數為0.1%時，MK-7的合成受到明顯的抑制。綜上所述，細胞膜的完整性是合成MK-7的前提，位于細胞膜上的MenA和MenH對MK-7在細胞膜中的合成發揮重要作用。

圖1 枯草芽孢桿菌中MK-7的合成途徑Fig.1 Synthetic pathway of MK-7 in B.subtilis

1 材料與方法

1.1 菌株和質粒

本實驗所用出發菌株為B.subtilis168，克隆菌株為E.coliJM109，穿梭質粒為pHT01。實驗所用菌株、質粒全部保藏于本實驗室。

1.2 重組菌株構建

以B.subtilis168的基因組為模板，擴增menA的開放閱讀框(open reading frame, ORF)，使用linker“GSGGGGS”將獲得的ORF與egfp進行融合，然后構建在質粒pHT01上。利用同樣的方式，分別構建其他蛋白與eGFP的重組表達質粒，使用天然啟動子對menA基因進行表達，使用Pveg啟動子對menH基因進行表達，用上述構建的質粒轉化B.subtilis168，得到重組菌株。

1.3 熒光蛋白的檢測

將重組菌株接種到LB培養基中，37 ℃下220 r/min培養12 h，然后8 000×g離心2 min收集菌體。在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察熒光的分布，其中eGFP的激發波長為488 nm，接收波長507 nm。將獲得的綠色熒光圖片使用軟件ImageJ 1.52進行處理。

1.4 MK-7的發酵

首先在14 mL圓底試管中加入3 mL LB培養基，接入獲得的重組菌株置于37 ℃搖床，220 r/min過夜培養。按照3%的接種量，把過夜培養的種子接入發酵培養基中，放入避光的搖床，220 r/min，40 ℃培養，定時取樣測量生長情況與MK-7的產量。發酵培養基的配方為(質量分數)：5%葡萄糖，5%蔗糖，5%大豆蛋白胨，0.06% KH2PO4。為檢測細胞膜對MK-7產量的影響，在發酵培養基中加入不同濃度的表面活性劑Triton-100，體積分數分別是0.05%，0.1%，0.2%，0.5%，1%。

1.5 MK-7的提取與檢測

吸取發酵液到棕色離心管中，使用異丙醇和正己烷的混合物(體積比1∶2)以體積比4∶1的比例(有機物∶發酵液)萃取細胞中MK-7。將混合物用渦旋振蕩器劇烈振蕩10 min，然后以5 000×g離心5 min以分離有機相和水相，收集有機上清液用來檢測MK-7含量。檢測MK-7含量的儀器是配備有光子二極管陣列紫外檢測器的高效液相色譜儀(Agilent 1260，Santa Clara，CA，USA)，色譜柱為C18 ODS色譜柱(5 μm，250 mm×4.6 mm，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)檢測波長為254 nm，柱溫為40 ℃。甲醇∶二氯甲烷(體積比9∶1)用作流動相，流速為1 mL/min。MK-7校準曲線在1～100 mg/L呈線性關系(R2=0.998)。

2 結果與分析

2.1 基于生物信息學分析MenA和MenH

課題組前期在強化MK-7合成實驗中，發現通過強化menA和menH的表達，能夠明顯促進MK-7的合成，從而確定menA是MK-7合成過程中的關鍵基因[10]。基于B.subtilis168的基因組數據，MenA的性質如下：MenA酶蛋白由311個氨基酸組成，其中帶有負電荷氨基酸(Asp+Glu)的總共有14個，帶有正電荷的氨基酸(Arg+Lys)總共有20個。MenA的分子質量為33.838 kDa，等電點為9.18，蛋白親水性平均值(grand average of hydropathicity, GRAVY)為0.718。對MenA的跨膜結構進行預測(http:// www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)，結果如圖2所示。MenA酶蛋白共具有8個跨膜結構，跨膜區集中在蛋白中部。

A-TMHMM預測MenA潛在的跨膜區域； B-TMHMM預測MenH潛在的跨膜區域圖2 生物信息學預測MenA和MenH的跨膜結構域Fig.2 Prediction of transmembrane domains of MenA and MenH by bioinformatics

使用同樣的方法預測了MenH的性質，結果如下：MenH酶蛋白由233個氨基酸組成，其中帶有負電荷氨基酸(Asp+Glu)的總共有29個，帶有正電荷的氨基酸(Arg+Lys)總共有31個。MenH的分子質量為26.576 kDa，等電點為8.27，GRAVY為-0.367。對MenH的跨膜結構進行預測，結果如圖2-B所示，MenH酶蛋白沒有明顯的跨膜結構。

2.2 MenA和MenH的定位

為了驗證MenA在細胞中的定位，首先在質粒pHT01上使用天然啟動子表達menA，獲得重組質粒pHT01-Pnative-menA-eGFP。將重組質粒轉化入B.subtilis168中，然后將重組菌株接種于LB液體培養基中，37 ℃下220 r/min培養12 h。發酵結果顯示，強化表達menA之后，細胞的生長并未受到影響(圖3-A)。利用激光共聚焦熒光顯微鏡觀察熒光的分布，發現熒光信號出現在細胞膜上，而且是均勻的分布在細胞膜上(分別利用CtaD和YuxO作為陽性和陰性對照)(圖3-C)，說明MK-7支鏈結構和骨架結構的結合是發生在細胞膜上的。

MenH在MK-7合成的過程中起到提供甲基的作用，催化整個過程中的最后一步。根據生物信息學的預測，MenH并沒有跨膜結構域，應該游離于整個細胞中。為了驗證MenH在細胞中的定位，使用同樣的方法構建重組質粒pHT01-Pveg-menH-eGFP。將重組質粒轉化入B.subtilis168中，然后將重組菌株接種于LB液體培養基中，37 ℃下220 r/min培養。結果顯示過表達menH對細胞的生長沒有明顯的影響(圖3-B)。培養12 h之后，在激光共聚焦熒光顯微鏡的下觀察熒光的分布，根據熒光定位實驗結果，MenH同樣位于細胞膜上，但是有些熒光在細胞中呈現聚集分布。這一分布特點與MenA不同，MenA均勻的分布在細胞膜上，而MenH則是隨機地在細胞中出現聚集(圖3-C)。

2.3 不同濃度表面活性劑對MK-7合成的影響

表面活性劑Triton-100是一類非離子型表面活性劑，能夠促進脂類物質的溶解，從而破壞細胞膜的結構。為了檢測不同狀態的細胞膜對MK-7合成的影響，我們在MK-7發酵培養基中加入不同濃度的表面活性劑Triton-100。由于加入不同濃度的表面活性劑之后，細胞的生長的受到不同程度的抑制，導致細胞的生長很難統一，所以只對最大生長OD600值進行統計。結果如圖4-A所示，當加入表面活性劑時，細胞的生長和MK-7的合成均受到不同程度的抑制。當Triton-100體積分數為0.1%時，MK-7的產量受到明顯的抑制，僅為野生型的36.9%。特別是當Triton-100的體積分數達到0.5%時，細胞的OD600值最高僅為5.6，且幾乎檢測不到MK-7的合成(圖4-B)。當細胞膜的結構受到破壞時，對MenA和MenH的定位產生影響，從而影響到MK-7的合成。這些結果表明，完整的細胞膜結構是高效合成MK-7的前提條件。

A-不同濃度Triton-100對菌株生長的影響； B-不同濃度Triton-100對菌株合成MK-7的影響圖4 不同濃度表面活性劑對細胞生長和MK-7合成的影響Fig.4 Effects of different concentrations of surfactants on cell growth and synthesis of MK-7

3 結論

MK-7作為脂溶性維生素K2的重要亞型，主要分布于細胞的細胞膜中，起到電子傳遞的作用[14]。然而，對于MK-7如何進入到細胞膜中并沒有明確的報道。MenA可能在MK-7進入細胞膜的過程中起著關鍵作用，其作用是使胞內游離的DHNA與不同長度異戊二烯組成的側鏈進行融合，形成2-脫甲基萘醌。MenA屬于異戊二烯轉移酶的UbiA家族(IPR000537)，包括了來源于細菌中的4-羥基苯甲酸酯八烯基轉移酶(UbiA)[15]，酵母中的對羥基苯甲酸酯聚異戊二烯基轉移酶(COQ2)[16]。根據已知晶體結構的UbiA家族的，通過同源比對發現包含兩個富含天冬氨酸的保守催化位點，能夠催化反式異戊二烯基轉移酶的活性，分別是NDXXDXXXD和DXXXD。

生物信息學的預測結果顯示MenA具有8個跨膜區，分布在細胞膜上。本研究將MenA與eGFP進行融合，通過熒光的位置確定MenA的分布。實驗結果顯示MenA位于細胞膜上，與生物信息學預測的結果一致。在E.coli中通過敲除回復突變實驗，并通過收集細胞膜碎片，在細胞膜碎片中發現了MenA的活性，證實了MenA位于細胞膜內，并證明含有MenA的細胞能夠在厭氧的環境中生長[17]。在結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)中，使用同位素1-3H標記的法尼基焦磷酸(farnesylpyrophosphate, FPP)或者香葉基焦磷酸(geranylgeranylpyrophosphate, GGPP)作為底物時，發現90%的MenA活力存在于富含細胞碎片的組分中，同樣也證實了MenA位于細胞膜中[18]。在本研究中，通過在發酵培養基中加入表面活性劑破壞細胞膜的結構，發現MK-7的合成受到明顯的抑制，說明細胞膜的存在對MK-7的合成具有重要作用。

MenH作為催化MK-7合成過程最后一步的關鍵酶，起到轉移甲基的作用。在恥垢分枝桿菌(Mycobacteriumsmegmatis)中，與甲萘醌合成相關的酶位于細胞內膜結構域上，包括甲基轉移酶MenG和甲萘醌還原酶MenJ[19]。其中MenG的分布與MenA并不相同，MenA分布在常規質膜(包含膜磷脂與細胞壁)上。研究證明僅當存在額外拷貝的menG時，才能夠在基因組上敲除menG，說明menG是恥垢分歧桿菌的必需基因[19]。在本研究中，我們依據生物信息學對MenH的結構進行了預測，發現MenH不具有跨膜結構域，但是熒光定位實驗顯示MenH同樣位于細胞膜上。推測MenH可能是與枯草芽孢桿菌的膜蛋白互作，然后錨定在細胞膜上。本研究證明MenA 和MenH均位于細胞膜上，對MK-7在細胞膜中合成的過程中發揮作用，而且細胞膜的完整性對MK-7的合成具有重要作用。由于MenA和MenH在定位在細胞膜中方式不相同，MenH是如何與膜蛋白進行互作，以及哪種因素影響MenA和MenH在細胞膜中的定位是下一步的研究重點。