菌毒清提取物誘導人鼻咽癌細胞CNE-1、CNE-2凋亡及其機制

趙偉國 張海勇 唐蕾 辛玲 高珊 李運景 (中山市人民醫院藥學部，廣東 中山 528403)

菌毒清顆粒是中山市人民醫院的院內制劑，由板藍根、穿心蓮、金銀花等多味藥材經現代工藝精制而成，具有清熱解毒、鎮痛抗感染、涼血養陰、降火利咽等功效，治療流行性感冒、咽炎、上呼吸道感染等臨床應用效果較好〔1～3〕。鼻咽癌是我國南方地區最常見的頭頸部惡性腫瘤之一，其病情隱匿，惡性程度高并且較早地發生遠處轉移〔4,5〕。

早期患者常采用放射治療就能取得較好的療效，但中晚期患者常以化療為主。目前臨床使用的抗腫瘤化療藥物毒副作用較大，臨床應用受到了極大限制〔6,7〕。如何降低抗腫瘤藥物的毒副作用，已成為臨床亟待解決的主要問題。研究發現，菌毒清對抗呼吸道合胞病毒(RSV)，腺病毒(ADV)及柯薩奇病抗病毒CoxB3等具有廣泛的藥理作用〔8～10〕。菌毒清應用過程中，有臨床醫生反應，早期鼻咽癌患者長期服用菌毒清顆粒能改善相關癥狀，因此推測菌毒清可能具有抗鼻咽癌的潛在作用。但是關于菌毒清對鼻咽癌細胞的基礎研究鮮有報道。本研究探討菌毒清提取物對人鼻咽癌細胞CNE-1、CNE-2凋亡影響及其機制。

1 材料和方法

1.1一般材料 人鼻咽癌細胞CNE-1、CNE-2均購于中科院上海細胞庫。菌毒清提取物的制備：先取穿心蓮用85%乙醇滲漉提取，滲漉液回收乙醇，濃縮成稠膏；另取其余各藥去雜質，洗凈，加水，煎煮2次，每次1.5 h，煎液過濾、離心后，濃縮成稠膏,再與穿心蓮稠膏合并，混合均勻，低溫干燥既得。將咽癌細胞CNE-1、CNE-2分別分為4組：對照組、1.0、2.0、3.0 ng/ml菌毒清處理組。

1.2主要試劑和儀器 完全RPMI1640培養基(凱基生物 KGM31800S-500)；胎牛血清(BI生物有限公司，1552680)；膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)細胞凋亡檢測試劑盒(AP101-100-kit)、細胞周期染色試劑盒(CCS102)均購自聯科生物；聚偏氟乙烯(PVDF)膜(IPVH00010， Millipore)；超敏發光液(RJ239676，賽默飛)；大分子B細胞淋巴瘤(Bcl)-xl(ab32370)；髓樣細胞白血病蛋白(Mcl)-1 抗體(ab32087)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3抗體(ab184787)、Caspase-8抗體(ab25901)、Caspase-9抗體(ab32539)均購自Abcam公司；NovoCyteTM流式細胞儀(2060R)購自艾森生物(杭州)有限公司；顯微鏡(CX41 OLYMPUS公司)；蛋白垂直電泳儀(DYY-6C，北京市六一儀器廠)；超高靈敏度化學發光成像系統購自伯樂生命醫學產品(上海)有限公司。

1.3CCK8檢測 棄去培養上清，1×磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2遍，0.25%胰酶〔含0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)〕消化3 min，加入培養基終止消化并懸起細胞；收集細胞至10 ml離心管中，1 000 r/min離心3 min，棄盡上清，加入培養基用吸管吹勻；將上述細胞懸液稀釋至適宜細胞密度后加入96孔板中，每孔100 μl。于37℃5% CO2培養箱中培養。次日待細胞貼壁后進行加藥處理。棄上清，96孔板加入配置好的含藥培養基，到達藥物處理時間后，每孔加10 μl CCK8檢測試劑，在37℃孵育2 h；酶標儀在450 nm波長處檢測每孔的OD值計算存活率。

1.4細胞遷移 細胞按照“1.3”處理，直尺和marker筆在操作前紫外照射30 min(超凈臺內)。先用marker筆在24孔板背后，用直尺比著孔的正中央，均勻地劃橫線，橫穿過孔。在空中加入約5×105個細胞，具體數量因細胞不同而不同，掌握為過夜能鋪滿。第二天用槍頭比著直尺，盡量垂至于背后的橫線劃痕，槍頭要垂直，不能傾斜。用PBS洗細胞3次，去處劃下的細胞，加入無血清培養基。放入37℃ 5% CO2培養箱，培養48 h后，在熒光顯微鏡下對細胞劃線部分進行拍照。

1.5細胞侵襲 細胞按照“1.3”處理，常規消化、離心收集細胞，用低血清DMEM培養液〔含0.2%胎牛血清(FBS)〕混懸成密度為5×105/ml的單細胞懸液。將Transwell培養池放入24孔培養板中，上室內加入100 μl細胞懸液(約5×104細胞)，下室內加入500 μl含10% FBS的DMEM培養液。置于5% CO2，37℃孵箱培養24 h后，PBS洗2次，用棉球小心擦去上室內細胞，4%多聚甲醛固定20～30 min，PBS洗2次，0.1 %結晶紫染色30 min，PBS洗2次，去掉多余染料，顯微鏡下觀察拍照。

1.6細胞流式凋亡檢測 細胞按照“1.3”處理，收集1×106～3×106個細胞，加1 ml PBS 1 500 r/min離心3 min，洗2遍。用雙蒸水將5×結合緩沖液稀釋為1×結合緩沖液。取300 μl 預冷的1×結合緩沖液重懸細胞。每管各加入3 μl Annexin V-FITC和5 μl PI-PE。輕微混勻后，室溫避光孵育10 min。再向每管中加入200 μl 預冷的1×結合緩沖液?；靹蚝笊狭魇絻x檢測。

1.7Western印跡 取各組細胞加入組織裂解液，裂解30 min后，4℃，10 000 r/min離心10 min，小心吸取上清，即可獲得總蛋白。根據二喹啉甲酸(BCA)試劑盒測定蛋白濃度。蛋白變性后上樣，再進行十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳1～2 h，后濕法轉膜30～50 min。4℃孵育一抗過夜；二抗溶液中室溫孵育1～2 h。在膜上滴加電化學發光(ECL)曝光液，在凝膠成像系統中曝光。利用“Quantity one”軟件進行各抗體條帶灰度值的分析。

1.8熒光定量聚合酶鏈反應(PCR) 取各組細胞進行RNA的提取，提取RNA后根據逆轉錄試劑盒合成cDNA，以cDNA為模板，在熒光定量PCR儀上進行檢測，以GAPDH為內參，算出各組細胞中Bcl-xl、Mcl-1、Caspase-3、Caspase-8 和Caspase-9的相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列表

1.9統計學處理 采用GraphPad Prism6統計軟件進行單因素方差分析(One Way ANOVA)、t檢驗。

2 結 果

2.1不同濃度菌毒清提取物對各組細胞活力的影響 CCK-8 實驗結果顯示，經不同濃度菌毒清提取物處理CNE-1和CNE-2細胞后，處理12 h和24 h后，2.0、3.0 mg/ml組細胞活力與對照組相比顯著降低(P<0.05)，處理48 h和72 h后，1.0、2.0、3.0 mg/ml組與對照組相比均顯著降低(均P<0.05)。提示隨著菌毒清提取物濃度的增加對細胞活力的抑制率在逐漸升高。見表2。

表2 不同濃度菌毒清提取物對各組CNE-1、CNE-2細胞活力的影響

2.2不同濃度菌毒清提取物對各組細胞遷移的影響 通過細胞劃痕實驗，對不同濃度的菌毒清提取物處理24 h后的各組細胞的遷移情況見圖1。與對照組相比，一定濃度的菌毒清提取物均能顯著性抑制細胞發生的遷移，且隨著濃度的增加，抑制細胞遷移的效果越明顯(P<0.05)。見表3。

圖1 不同濃度菌毒清提取物處理后CNE-1、CNE-2細胞遷移情況(×40)

2.3不同濃度菌毒清提取物對各組細胞侵襲的影響 不同濃度的菌毒清提取物對各組細胞處理24 h后，通過結晶紫染色的方法對各組細胞的侵襲情況見圖2。與對照組相比，一定濃度的菌毒清提取物均能顯著性抑制細胞侵襲的發生，與遷移的結果一致，抑制效果表現出劑量依賴性(P<0.05)。見表3。

表3 不同濃度菌毒清提取物對各組CNE-1和CNE-2細胞遷移、侵襲及凋亡的影響

圖2 不同濃度菌毒清提取處理后對各組CNE-1、CNE-2細胞侵襲情況(結晶紫染色，×40)

2.4菌毒清提取物對各組細胞凋亡的影響 不同濃度的菌毒清提取物對各組細胞處理24 h后，通過細胞流式技術對各組細胞的凋亡情況見圖3。各組細胞經不同濃度的菌毒清提取物處理后，均促進了細胞凋亡。與對照組相比，除1.0 mg/ml 處理CNE-2組外，不同濃度的菌毒清提取物對各組細胞凋亡率的影響均顯著性高于對照組(P<0.05)。見表3。

圖3 不同濃度菌毒清提取物處理后各組CNE-1、CNE-2細胞的凋亡情況

2.5菌毒清提取物對各組細胞Bcl-xl、Mcl-1、Caspase-3、Caspase-8 和Caspase-9蛋白表達的影響 不同濃度的菌毒清提取物對各組細胞處理24 h后，通過蛋白免疫印跡技術對各組細胞的Bcl-xl、Mcl-1、Caspase-3、Caspase-8 和Caspase-9蛋白相對表達量。與對照組相比，一定濃度的菌毒清提取物都能使Bcl-xl、Mcl-1表達量顯著下降，Caspase-3、Caspase-8 和Caspase-9表達量顯著性升高，且其效果具有劑量依賴性(均P<0.05)。見表4、圖4。

表4 不同濃度菌毒清提取物對CNE-1、 CNE-2細胞Bcl-xl、Mcl-1、Caspase-3、Caspase-8 和Caspase-9蛋白表達的影響

1～4：對照組，1.0 mg/ml組，2.0 mg/ml組，3.0 mg/ml組圖4 各組CNE-1、CNE-2細胞Bcl-xl、Mcl-1、Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9蛋白表達

2.6菌毒清提取物對各組細胞Bcl-xl、Mcl-1、Caspase-3、Caspase-8 和Caspase-9 mRNA表達的影響 與對照組相比，除處理CNE-1的1.0 mg/ml 組Bcl-xl外，一定濃度的菌毒清提取物均能使Bcl-xl、Mcl-1 mRNA相對表達量顯著下降(P<0.05)；除處理CNE-1的1.0 、2.0 mg/ml組Caspase-9及CNE-2的1.0 mg/ml組Caspase-9外，其余處理組均顯著性促進了Caspase-3、Caspase-8 和Caspase-9 mRNA相對表達量(P<0.05)，其效果具有一定的劑量依賴性。見表5。

表5 不同濃度菌毒清提取物對CNE-1、CNE-2細胞Bcl-xl、Mcl-1、Caspase-3、Caspase-8 和Caspase-9 mRNA表達的影響

3 討 論

鼻咽癌發病率占頭頸外科腫瘤首位〔11〕。目前，鼻咽癌患者一般采用放療或化療作為主要的療法，也能取得較好的治療效果，但發生抗拒和化療耐藥及其副作用往往會導致治療的失敗。據文獻報道，傳統中藥具有增加化療療效、降低放療化療毒副作用的功效，近幾年國內外學者試圖尋找天然藥物或其活性成分用于鼻咽癌的治療〔12,13〕。菌毒清顆粒應用已久，得到了廣大醫生及患者的認可。本研究結果表明，菌毒清提取物對鼻咽癌CNE-1、CNE-2細胞的抑制作用呈濃度和時間依賴性。菌毒清提取物對鼻咽癌具有一定的抗腫瘤作用。并通過進一步分析表明，該藥具有誘導鼻咽癌細胞凋亡的作用。Mcl-1與Bcl-xl同屬于抗凋亡Bcl-2蛋白家族的一員，在內源性凋亡途徑中，Mcl-1可以作為上游的分子通過阻止cytochrome c的釋放從而抑制細胞凋亡的產生〔14～16〕， Bcl-xl通過阻斷Bax對線粒體外膜的破壞發揮抗凋亡作用〔17,18〕。通過Western印跡、熒光定量PCR法檢測表明，不同劑量的菌毒清提取物處理均降低了Mcl-1與Bcl-xl蛋白及mRNA表達水平，促進了凋亡。Caspase是天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶，在細胞凋亡過程中發揮重要的作用〔19～21〕。經不同劑量的菌毒清提取物處理后Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9蛋白及mRNA的表達水平都明顯升高，進而導致了細胞發生凋亡。

綜上，菌毒清提取物能夠顯著抑制鼻咽癌細胞CNE-1、CNE-2的活力、遷移和侵襲，并促進了凋亡；其促進凋亡的作用機制可能與細胞凋亡內源性途徑相關〔22～24〕。