TRIM19泛素化IGF2BP3對卵巢癌細胞增殖及遷移的影響

王琪 廖振蓉 羅德平 余瑛 李榮 (贛州市腫瘤醫院，江西 贛州 341000)

卵巢癌是發生在女性生殖器官的一種常見惡性腫瘤〔1〕，具有極高的死亡率，對女性生命具有極大的威脅〔2〕，病癥發生在盆腔深處，較為隱匿，且體積較小，無典型癥狀，因而早期較難發現〔3〕。而泛素化作為一種翻譯后可進行特異性修飾的過程〔4〕，對細胞的多種進程都具有調控作用，比如細胞的增殖、凋亡、周期等〔5〕。三方基序蛋白(TRIM)蛋白家族擁有進化保守的結構域〔6〕，被定義為細胞生物學中的一種關鍵調控子〔7〕，其對細胞的增殖、凋亡、免疫、遷移等生物學功能都具有一定的調節功能〔8〕。目前已有研究顯示TRIM3、TRIM16、TRIM21等在實體瘤中的功能〔9〕，但TRIM19對腫瘤的作用還未有報道，本研究就其對卵巢癌細胞的影響進行探究。

1 材料與方法

1.1實驗材料 卵巢癌細胞系 SKOV3(中國科學院細胞庫，hce-0155)，胎牛血清、DMEM培養液、雙抗(含100 U/ml青霉素及鏈霉素)、0.25%胰蛋白酶(美國Gibco公司)，MTT檢測試劑盒(上海酶聯生物)，Transwell小室(北京萌壯科技有限公司)，pmirGLO載體(北京華越洋生物)，轉染試劑：LipofectamineTM2000(北京科展生物科技有限公司)，胰島素樣生長因子-2 mRNA結合蛋白(IGF2BP)3質粒(上海羽朵生物，BAS6784)，TRIM19質粒(山東維真生物，CH849963)。

1.2細胞培養 將細胞系SKOV3在含有10%胎牛血清的DMEM培養液中進行培養，培養條件控制為37℃、5%CO2，恒溫培養箱中培養，2 d間隔更換1次培養液，3～5 d時使用0.25%的胰蛋白酶進行消化傳代，當細胞培養至3～5代且處于對數生長期時進行收集以繼續后續實驗。

1.3細胞轉染 將卵巢癌SKOV3細胞分為對照組、過表達TRIM19組(轉染 TRIM19)、敲減TRIM19 組(轉染TRIM19-inhibitor)，另對TRIM19與IGF2BP3進行共轉染。當細胞生長至融合度為70%～80%時，將其接種到細胞瓶中，按照LipofectamineTM2000試劑說明書進行轉染。通過RT-PCR檢測轉染效率，轉染成功即可用于后續實驗。

1.4Western印跡檢測IGF2BP3的表達 十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)收集轉染后SKOV3細胞中的總蛋白，通過BCA 法對蛋白總量進行測定，聚偏氟乙烯(PVDF)膜進行2 h的轉膜，加入5%的脫脂奶粉密封1 h，后加入一抗(稀釋比例均1∶1 000)，4℃下孵育過夜。TBST洗滌，去除非結合抗體，然后添加辣根過氧化物酶(HRP)標記二抗，室溫下孵育2 h。洗滌后加入顯色劑進行顯影。最后用凝膠成像軟件分析，得出表達結果。

1.5免疫共沉淀檢測泛素化情況 將卵巢癌SKOV3細胞分為A組(轉染HIS-TRIM19和MYC-IGF2BP3)、B組(轉染空載體)、C組(轉染HIS-TRIM19)、D組(轉染HIS-TRIM19)、E組(轉染HIS-TRIM19和HA-UB)、F組(轉染HA-UB)、G組(轉染HIS-TRIM19)、H組(轉染HIS-TRIM19和HA-UB)、I組(轉染HA-UB),當細胞生長至融合度為70%～80% 時，將其接種到細胞瓶中，按照LipofectamineTM2000試劑說明書進行轉染。將含目的基因的質粒與脂質體混合靜止約20 min后，緩緩滴入SKOV3細胞。通過RT-PCR檢測轉染效率，轉染成功即可用于后續實驗。按比例加入抗體(1∶200)孵育，加入蛋白A/G瓊脂糖珠進行孵育，洗滌。進行蛋白質變性后，在3 000 r/min，4℃的條件下進行離心。轉移上清液至新管，加入適量一抗，于振蕩器上緩緩振蕩過夜，免疫共沉淀孵育后，用HA抗體去免疫沉淀，進行SDS-PAGE，以β-actin作為內參蛋白，從而得出結果。

1.6噻唑藍(MTT)實驗檢測細胞的增殖情況 將轉染的各組SKOV3細胞接種到96孔板上，每孔100 μl，培養箱中培養，并且在培養結束之前的4 h加入20 μl MTT溶液(5 g/L)貼壁后進行收集，時間點分別是0 h、24 h、48 h、72 h，最終通過酶標儀來檢測其A490值。

1.7Transwell檢測SKOV3細胞的遷移情況 使用培養基對各組細胞進行重懸，調整密度至2×105個/ml，接種至Transwell小室的上室，在下室加入培養基，后在培養箱中培養1 d，培養后將細胞用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，擦凈上室表面，90%無水乙醇中固定后使用結晶紫染色，顯微鏡下觀察計數細胞個數。

1.8統計學分析 采用SPSS24.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗、F檢驗。

2 結 果

2.1過表達 TRIM19 對卵巢癌細胞增殖的影響 與對照組及敲減TRIM19組相比，過表達 TRIM19組48、72 h的細胞活力顯著下降(P<0.05)，與對照組相比，敲減TRIM19 組的細胞活力顯著上升(P<0.05)。見表1。

表1 各組卵巢癌細胞不同時間的細胞活力

2.2過表達TRIM19對卵巢癌細胞遷移的影響 與對照組〔(156.42±18.43)個〕及敲減TRIM19組〔(211.57±19.24)個〕相比，過表達TRIM19組細胞的遷移能力顯著下降〔(97.68±16.51)個，P<0.05〕，敲減TRIM19組與對照組相比遷移能力顯著上升(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組卵巢癌細胞的遷移情況(結晶紫染色，×200)

2.3TRIM19對IGF2BP3表達量的影響 如圖2所示，與對照組(0.82±0.05)相比，過表達TRIM19組內源IGF2BP3的表達量顯著減少(0.51±0.03，P<0.05)，敲減TRIM19組內源IGF2BP3的表達量顯著上升(1.09±0.06，P<0.05)。

圖2 各組細胞IGF2BP3的表達

2.4TRIM19與IGF2BP3之間的相互作用 如圖3所示，在僅轉染TRIM19及空載體中無法檢測到TRIM19的存在，而當HIS標記的TRIM19(HIS-TRIM19)與MYC標記的IGF2BP3(MYC-IGF2BP3)共轉染時可以檢測到HIS-TRIM19的存在，提示TRIM19與IGF2BP3之間存在一定的相互作用。

圖3 TRIM19與IGF2BP3之間的相互作用

2.5過表達 TRIM19 對IGF2BP3 泛素化程度的影響 如圖4所示，過表達TRIM19后會使免疫沉淀后的IGF2BP3多聚泛素化鏈有所增加，表明過表達TRIM19可增加IGF2BP3的泛素化程度。

圖4 過表達 TRIM19 對IGF2BP3 泛素化程度的影響

3 討 論

卵巢癌具有早期癥狀隱匿、侵襲能力強、惡性程度高等特點〔10，11〕，其發生與內分泌紊亂、精神壓力大、年齡等因素具有緊密的聯系〔12〕。而其增殖轉移對患者的臨床療效、預后等都具有較大的影響〔13〕，因而對其增殖及遷移的影響因素進行研究就極為必要。

泛素化過程中，泛素分子介導的信號傳導在癌細胞中會有所改變〔14〕。部分腫瘤抑制因子及癌基因同泛素-蛋白酶體途徑之間具有相互作用，并在泛素綴合及解耦聯之間起到一定作用，與腫瘤的發生進展具有一定的聯系〔15〕。TRIM19又稱為PML，是TRIM家族的成員之一，幾乎在所有可被檢測到的細胞系中都有所表達，定位于細胞核中〔16〕，有研究證明，其含有視黃酸受體(RAR)α，對于細胞防御具有一定的參與作用〔17〕。IGF2BP3又稱為IMP3，是一種可以對胰島素生長因子2及癌胚RNA進行調控的結合蛋白，在肺癌、乳腺癌、腎癌中呈高表達狀態，而在正常組織呈現低表達的狀態〔18，19〕。如王瑾等〔20〕在了解相關蛇鱗狀細胞癌及miR-299-3p的研究進展基礎上，對此細胞癌發展的相關機制進行研究，最終得出miR-299-3p對TRIM27具有靶向下調的作用，對蛇鱗狀細胞癌的遷移、增殖及侵襲具有一定的抑制作用。除此之外TRIM3、TRIM16、TRIM21等與癌癥進展的相關性均有所研究。

本研究結果提示，TRIM19與IGF2BP3之間具有相互作用，TRIM19會對IGF2BP3進行泛素化修飾；過表達TRIM19會增加IGF2BP3的泛素化程度。蛋白質泛素化是真核生物調控各個生物過程的翻譯后修飾過程，并且相關研究表明這種過程也會對癌基因蛋白產物及腫瘤抑制蛋白進行調節〔21〕。本研究結果提示，過表達TRIM19可能可以抑制卵巢癌細胞的增殖能力；過表達TRIM19可能可以抑制卵巢癌細胞的遷移能力。

綜上，TRIM19可增加IGF2BP3的泛素化程度，從而抑制卵巢癌細胞的增殖及遷移。但由于研究規模及時間的限制，其表達模式未進行探索，仍需擴大研究規模進一步探索。