shRNA沉默SGK3基因抑制MB-474細(xì)胞凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移潛能

彭芯 韓敬文 張雪寧 吳成偉 張生 郭紅艷

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院 1 2017級(jí)影像2班，黑龍江 齊齊哈爾 161000；2生物化學(xué)教研室)

在復(fù)雜的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中，血清/糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)激酶(SGK)3是細(xì)胞磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)的一個(gè)交匯點(diǎn)，其參與多條轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在腫瘤發(fā)生發(fā)展、惡性轉(zhuǎn)化、浸潤(rùn)、遷移等過程中發(fā)揮作用〔1～3〕，可能作為治療某些腫瘤的潛在或判斷預(yù)后標(biāo)志物〔4〕。本課題組前期對(duì)SGK3在乳腺癌組織中的表達(dá)情況，與雌、孕激素受體、TNM分期等病理特征關(guān)系及其過表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為影響等方面進(jìn)行了研究〔5,6〕，在此基礎(chǔ)上，課題組構(gòu)建SGK3基因RNAi慢病毒載體，進(jìn)而觀察SGK3基因沉默后MB-474乳腺癌細(xì)胞的黏附、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞遷移等生物學(xué)行為的變化，為進(jìn)一步闡明SGK3在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1材料 MB-474細(xì)胞、293T 細(xì)胞購自上海中科院細(xì)胞庫，靶向SGK3的shRNA序列慢病毒載體PGC-LV3-SGK3由Gene Pharma構(gòu)建制備；細(xì)胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板、tanswell培養(yǎng)板為Nunc公司產(chǎn)品；胎牛血清購自Gibco 公司；基質(zhì)膠購自BD公司；二甲基亞砜(DMSO)購自Sigma公司；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG為Santa Cruz公司產(chǎn)品；甘油醛-3-磷酸脫氫酶抗體(GAPDH antibody)購自CST公司；SGK3多克隆抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；蛋白抽提、定量試劑盒購自Beyotime技術(shù)公司；膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡檢測(cè)試劑盒購自Jiamay生物技術(shù)有限公司。

1.2重組慢病毒感染MB-474細(xì)胞 構(gòu)建靶向SGK3基因的shRNA慢病毒表達(dá)載體，人SGK3基因的特異性shRNA 分別為：SGK3-shRNA-1序列GGTATCCAGAACTTTATAACC；SGK3-shRNA-2序列GCATTGGGTTACTTACATTC；SGK3-shRNA-3序列GGGCTGTTCTGTATGAAATGC，通用序列(NC)作為陰性對(duì)照，將人乳腺癌MB-474細(xì)胞以7.5×105/孔的密度接種于6孔板培養(yǎng)，細(xì)胞50%以上融合時(shí)用5 μg/ml的聚凝胺(polybrene)介導(dǎo)以上重組慢病毒分別轉(zhuǎn)染MB-474細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后72 h倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)情況，經(jīng)2 μg/ml嘌呤霉素篩選，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆。各組細(xì)胞分別命名為474-LV3-NC組、PGC-LV3-SGK3-1組、PGC-LV3-SGK3-2組和PGC-LV3-SGK3-3組。

1.3免疫印跡檢測(cè)MB-474細(xì)胞SGK3蛋白表達(dá) 將各組細(xì)胞進(jìn)行蛋白提取及含量測(cè)定，每組40 μg總蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)至NC膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，TBST洗膜后4℃一抗孵育過夜(SGK3抗體1∶1 000稀釋，GAPDH 抗體1∶2 000稀釋)，1∶5 000稀釋二抗室溫孵育1.5 h，TBST洗膜，電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色，蛋白表達(dá)以SGK3/GAPDH積分光密度表示。

1.4黏附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞黏附性 在96孔培養(yǎng)板每孔中分別鋪上25 μg基質(zhì)膠4℃過夜，每孔加入2%BSA 20 μl，置于22℃ 1 h，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，取 MB-474、474-LV3-NC、PGC-LV3-SGK3-1細(xì)胞2×104個(gè)/孔接種于96孔板(每組3個(gè)復(fù)孔)，37℃孵育90 min，用PBS洗掉未黏附的細(xì)胞，每孔加入MTT 10 μl，37℃培養(yǎng)孵育4 h，棄去MTT，每孔加入100 μl DMSO，酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm吸光度值，作為細(xì)胞黏附的指標(biāo)。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 細(xì)胞培養(yǎng)48 h，0.25% 胰酶消化后PBS洗滌，進(jìn)行Annexin V-FITC/PI染色(按試劑盒說明書操作)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，記錄488 nm激發(fā)波長(zhǎng)下的紅/綠熒光值，CellQuest軟件分析檢測(cè)結(jié)果。

1.6細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng) 將細(xì)胞按1×105個(gè)/孔植于6孔培養(yǎng)板上， 細(xì)胞長(zhǎng)至60%～70%匯合，形成單細(xì)胞層，用20 μl無菌槍頭進(jìn)行細(xì)胞劃痕(2條/孔)，PBS洗掉脫落細(xì)胞，繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)，劃痕后0、24、48 h顯微鏡下拍照，觀測(cè)劃痕修復(fù)情況，Image Pro-plus 軟件分析劃痕面積。

1.7細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 細(xì)胞撤血清饑餓24 h，常規(guī)消化細(xì)胞，PBS洗2遍，用含0.2%血清培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)為1×105/ml，Transwell小室上室中加入200 μl細(xì)胞懸液，下室加入10%血清培養(yǎng)基600 μl，每組3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48 h后取出Transwell小室，將小室中培養(yǎng)液棄去，棉簽輕拭擦去未遷移細(xì)胞后PBS洗3遍，穿過膜的細(xì)胞在膜下層，甲醇固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，PBS沖洗，顯微鏡下隨機(jī)5個(gè)視野觀察細(xì)胞并計(jì)數(shù)、拍照。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0 軟件進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)、方差分析、LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1重組慢病毒感染乳腺癌MB-474細(xì)胞 將慢病毒載體轉(zhuǎn)染乳腺癌MB-474細(xì)胞，72 h后熒光顯微鏡下可見各組細(xì)胞90%以上胞質(zhì)中有較強(qiáng)的綠色熒光，即慢病毒成功轉(zhuǎn)染MB-474細(xì)胞，且轉(zhuǎn)染效率較高。見圖1。

圖1 重組慢病毒轉(zhuǎn)染MB-474細(xì)胞后熒光顯微鏡下觀察GFP(×40)

2.2慢病毒轉(zhuǎn)染后下調(diào)SGK3的蛋白表達(dá) 與474-LV3-NC組(0.815±0.079)相比，PGC-LV3-SGK3-1組(0.174±0.076)、PGC-LV3-SGK3-2組(0.415±0.043)、PGC-LV3-SGK3-3組SGK3蛋白表達(dá)量(0.438±0.026)均顯著降低(P<0.01)，PGC-LV3-SGK3-1組SGK3蛋白表達(dá)水平抑制效果最佳，與其他組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖2。

1～4：474-LV3-NC組,PGC-LV3-SGK3-1組,PGC-LV3-SGK3-2組,PGC-LV3-SGK3-3組圖2 Western印跡檢測(cè)MB-474細(xì)胞SGK3蛋白表達(dá)

2.3SGK3基因沉默對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 MB-474組和474-LV3-NC組細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)(P>0.05)，而PGC-LV3-SGK3-1 組細(xì)胞的凋亡率較前兩組明顯升高(P<0.05)。見圖3、表2。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組MB-474細(xì)胞凋亡

表2 各組細(xì)胞黏附性、凋亡率、遷移能力比較

2.4SGK3基因沉默抑制細(xì)胞黏附 與MB-474組、474-LV3-NC組比較，PGC-LV3-SGK3-1組細(xì)胞的黏附性明顯降低(P<0.05)。見表2。

2.5SGK3基因沉默對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響 劃痕后24、48 h MB-474組和474-LV3-NC組細(xì)胞遷移面積無明顯差異(P>0.05)，PGC-LV3-SGK3-1組細(xì)胞與前兩組比較，遷移面積顯著更小(P<0.05)。見表2、圖4。表明SGK3基因沉默能抑制MB-474細(xì)胞的侵襲。

圖4 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組MB-474細(xì)胞遷移能力(×10)

2.6SGK3基因沉默對(duì)細(xì)胞侵襲的影響 將細(xì)胞加入tanswell小室48 h后，MB-474組和474-LV3-NC組穿過微孔膜的細(xì)胞數(shù)分別為(27.8±5.02)個(gè)、(30.2±7.23)個(gè)，兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，PGC-LV3-SGK3-1組穿膜細(xì)胞數(shù)為(21.67±4.82)個(gè)，數(shù)量明顯低于前兩組(P<0.01)。見圖5。表明SGK3基因沉默細(xì)胞遷移的過程。

圖5 Transwell檢測(cè)各組MB-474細(xì)胞侵襲能力(結(jié)晶紫染色，×20)

3 討 論

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，目前該病被認(rèn)為是影響女性身心健康“殺手”之一，該病的發(fā)生受到眾多因素的影響，涉及多種基因參與及改變〔7～9〕，生物靶向治療是目前乳腺癌治療領(lǐng)域的熱點(diǎn)和活躍領(lǐng)域，并逐漸成為乳腺癌綜合治療的一部分。

近年來學(xué)者們針對(duì)SGK3與包括乳腺癌在內(nèi)的多種人類疾病及腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系等問題進(jìn)行廣泛研究，研究結(jié)果提示，SGK3在多種小膠質(zhì)細(xì)胞系中表達(dá)， SGK抑制劑可增強(qiáng)脂多糖誘導(dǎo)的炎癥調(diào)節(jié)因子誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)和腫瘤壞死因子(TNF)α的表達(dá)并增強(qiáng)核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB的轉(zhuǎn)運(yùn)，SGK可能在調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞活力和炎癥反應(yīng)中起重要作用；SGK3是由雌激素受體(ER)調(diào)控的一種激酶，通過維持肌漿/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATP酶(SERCA)2b功能介導(dǎo)ER信號(hào)傳導(dǎo)，其在腫瘤血管生成、惡性轉(zhuǎn)化過程中起到重要作用，有可能作為某些腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)和預(yù)后標(biāo)志物〔10～13〕。本研究結(jié)果提示：SGK3基因沉默對(duì)MB-474細(xì)胞黏附能力具有抑制作用，SGK3基因沉默后可使乳腺癌細(xì)胞凋亡率升高，侵襲、遷移能力降低，提示SGK3基因沉默能有效抑制乳腺癌的部分惡性生物學(xué)行為。

乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程非常復(fù)雜， SGK3作為磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)下游的獨(dú)立信號(hào)分子，在該病中發(fā)揮的具體作用和機(jī)制仍處于探索和研究階段，研究者們力求從多角度闡述SGK3與乳腺癌的關(guān)系。本課題組雖然已經(jīng)進(jìn)行了部分研究工作，但SGK3 基因沉默對(duì)乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為產(chǎn)生影響的具體機(jī)制還要需要進(jìn)行進(jìn)一步后續(xù)研討和研究，該基因與乳腺癌臨床病理特征的相關(guān)性、是否與乳腺癌發(fā)生發(fā)展和預(yù)后相關(guān)，是否可以作為乳腺癌治療的有效靶點(diǎn)及預(yù)后標(biāo)志物等問題，是課題組今后的研究方向。