miR-34a-5p對H2O2誘導兔源性晶狀體上皮細胞凋亡的作用機制

王凡寅 張桐 祝天輝 彭艷陽 彭玲 姜曉丹 賴銘瑩

(1深圳市南山區蛇口人民醫院(深圳市前海蛇口自貿區醫院)眼科，廣東 深圳 518067；2暨南大學附屬深圳市眼科醫院)

白內障作為老年疾病的一種，其發病機制尚不明確〔1〕。研究表明，白內障疾病的發生與氧化應激反應有著密切的聯系〔2〕。氧化應激在白內障發病機制中具有重要的調節作用，能夠導致晶狀體上皮細胞的凋亡〔3〕。晶狀體上皮細胞能夠維持晶狀體的透明度，因此在晶狀體中有著重要的作用〔4〕。而經過氧化氫(H2O2)誘導晶狀體上皮細胞后，出現晶狀體上皮細胞凋亡及晶狀體渾濁的表現，在白內障的發生發展中有著明顯作用〔5〕。隨著醫療科技的發展及對白內障中晶狀體上皮細胞的不斷研究，發現miRNA在白內障的發生機制中占據重要作用，更是在人晶狀體上皮細胞中起到調節氧化損傷的作用〔6〕。研究已證實miR-34a-5p表達上調參與在老年性核性白內障中〔7〕。本研究探討miR-34a-5p對H2O2誘導兔源性晶狀體上皮細胞凋亡的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 家兔36只，由深圳市南方科技大學動物實驗中心提供，2～4月齡，體重1.5～2.6 kg，雌雄兼有，均無眼疾，經檢查確認健康。miR-34a-5p抑制物，miR-34a-5p陰性對照物(Sigma公司)，DMEM培養基、胎牛血清和青霉素、鏈霉素溶液購于(Hyclone公司)，H2O2購于(Sigma公司)，超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(CSH-Px)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒(Invitrogen公司)，磷酸鹽緩沖液(PBS，Gibco公司)，722型光柵分光光度計(上海醫用儀器分析廠)，活性氧熒光探針(DCFH-DA)(Abcam公司)，B細胞淋巴瘤(Bcl)-2試劑盒、SIRT1試劑盒(Cell Signaling Technology公司)。

1.2細胞培養 36只家兔行空氣栓塞處死，將全部家兔雙眼球立即摘取，確保眼球無菌無損壞后，進行晶狀體剝離，放在盛有培養液的6孔培養板中〔培養液為10 ml極限必需培養基(MEM)，含有10%胎牛血清、青霉素為100×103U/L、鏈霉素0.1 g/L，并加入100 μmol/L H2O2〕，在溫度37℃，濕度為95%濕度、含體積分數5%的CO2的孵箱內進行培養24 h。將透明兔晶狀體挑選出，準備實驗使用。建立H2O2誘導兔源性晶狀體上皮細胞凋亡模型。

1.3miR-34a-5p轉染及分組 將透明兔晶狀體采用隨機數字表法分為H2O2組、上調miR-34a-5p組與下調miR-34a-5p組各9個晶狀體，將各組晶狀體在37℃、5%CO2的培養箱內進行培養。將細胞分為3組，其中H2O2組不進行任何處理，上調miR-34a-5p組進行轉染miR-34a-5p陰性對照物，下調miR-34a-5p組進行轉染miR-34a-5p抑制物。進行轉染24 h后，對各組標記待測。

1.4細胞增殖檢測 噻唑藍(MTT)法檢測各組細胞增殖能力。將各組細胞加入96孔板中，分別于24、48、72 h后再每孔中加入30 μl的MTT液，37℃孵育4 h，棄培養液，加入150 μl的二甲基亞砜(DMSO)，酶標儀在498 nm波長處檢測每孔的OD值。

1.5TUNEL法檢測細胞凋亡情況 常溫環境中使用20 μg/ml蛋白酶K培養0.5 h后去除蛋白，使用PBS進行徹底清洗，之后將平衡緩沖液100 μl加入其中，室溫環境中平衡10 min，之后滴入末端脫氧核苷酸轉移酶(TDT)反應液100 μl，避光、室溫環境中孵育1 h，加入100 μl檸檬酸鈉緩沖液(SSC)，常溫環境中靜置20 min后進行清洗3次，之后使用DAPI進行復染，避光培養10 min后再次進行浸洗，封片觀察。DAPI復染細胞核呈藍色，凋亡細胞細胞核呈綠色，取每切片3視野進行觀察、計算細胞凋亡率，計算平均值。

1.6SOD、CSH-Px、MDA水平檢測 使用722型光柵分光光度計比色對SOD、CSH-Px、MDA水平進行檢測，檢測液體積(ml)設定比例為500∶1同時行冰上超聲對細胞裂解，3 000 r/min，在4℃條件下，進行10 min離心處理，取出上清，放置冰上檢測。在波長550 nm測定SOD水平，波長532 nm測定MDA水平，波長412 nm測定CSH-Px水平。

1.7活性氧(ROS)水平檢測 通過DCFH-DA所激發的熒光對ROS水平進行檢測，首先使用無血清培養基對DCFH-DA進行稀釋，比例為1∶1 000，將濃度稀釋10 μmol/L。將收集好的細胞放置在DCFH-DA溶液上，在37℃條件下的培養箱內培養30 min，以5 min進行混勻1次。在無血清的培養基內對細胞洗滌3次，對未入細胞內的DCFH-DA進行清除。采用熒光酶標儀對熒光的強度進行檢測，后以熒光強度對ROS水平進行計算。

1.8Bcl-2、SIRT1檢測 使用Western印跡對Bcl-2、SIRT1表達進行檢測。挑選生長狀態較良好無污染對數的細胞，且在生長期，將原培養液去除，以適量的胰酶進行消化后，放到15 ml無菌離心管內，保持溫度為4℃，進行1 000 r/min,5 min的離心處理，去除上清，在冰PBS 5 ml進行3次洗滌，然后加1 ml的PBS對細胞進行充分混懸，在微量離心管內，保持溫度為4℃，800 r/min，離心5 min。將上清去除。放入預冷后的細胞裂解液，并加入蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(PMSF)。對Eppendorf管進行吹打處理，將其混勻，在冰上進行30 min靜置，在此期間繼續吹打數次。后在4℃條件下，離心處理30 min，將上清輕輕取出，去除沉淀。提取出蛋白均使用二喹啉甲酸(BCA)對Bcl-2、沉默調節蛋白(SIRT)1進行測量。

1.9統計學處理 采用SPSS21.0軟件行F檢驗、獨立樣本t檢驗。

2 結 果

2.1各組活性率、凋亡率比較 與H2O2組相比，上調miR-34a-5p組活性率低于H2O2組，凋亡率高于H2O2組，具有統計學差異(P<0.05)；與H2O2組、上調miR-34a-5p組相比，下調miR-34a-5p組活性率較高，凋亡率較低，具有統計學差異(P<0.05)。見表1。

2.2各組MDA、ROS水平比較 與H2O2組相比，上調miR-34a-5p組MDA、ROS水平較高，具有統計學差異(P<0.05)；與H2O2組、上調miR-34a-5p組相比，下調miR-34a-5p組MDA、ROS水平較低，具有統計學差異(P<0.05)。見表1。

2.3各組SOD、CSH-Px水平比較 與H2O2組相比，上調miR-34a-5p組CSH-Px、SOD水平較低，具有統計學差異(P<0.05)；與H2O2組、上調miR-34a-5p組相比，下調miR-34a-5p組CSH-Px、SOD水平較高，具有統計學差異(P<0.05)。見表1。

表1 各組miR-34a-5p表達在兔源性晶狀體上皮細胞中活性率、凋亡率MDA、ROS、SOD、GSH-Px水平比較

2.4各組Bcl-2、SIRT1表達比較 與H2O2組相比，上調miR-34a-5p組Bcl-2表達較高，SIRT1表達較低，具有統計學差異(P<0.05)；與H2O2組、上調miR-34a-5p組相比，下調miR-34a-5p組Bcl-2表達較低，SIRT1表達較高，具有統計學差異(P<0.05)。見表2、圖1。

表2 各組miR-34a-5p表達在兔源性晶狀體上皮細胞中Bcl-2、SIRT1表達比較

1～3:H2O2組、上調miR-34a-5p組、下調miR-34a-5p組圖1 Western印跡檢測各組Bcl-2、SIRT1表達

3 討 論

白內障是世界上第一致盲原因，有相關調查顯示，在全球致盲因素中，由白內障造成的失明患者占50%左右〔8〕。在65歲以上的老年人中的群體，白內障發病率較高。因此，通過探究白內障發病的機制，尋找出經濟有效的防治途徑除具有學術意義外，更具有廣泛的社會效益〔9〕。在晶狀體中晶狀體的上皮細胞結構及功能在維持晶狀體透明性中有著關鍵作用。通過在培養液內觀察晶狀體中發現，ROS自由基是導致晶狀體內的水不溶性蛋白的增加，進而導致白內障的發生〔10〕。相關研究認為，H2O2是引起白內障發生的主要氧化物〔11〕。microRNA作為內源性非編碼的小RNA分子，在近幾年被發現能夠在靶基因3′-UTR互補配對或者降低靶基因的翻譯及對靶基因介導達到調節基因表達的作用。在細胞的發育、增殖及衰老、凋亡中均有microRNA通過定位多個mRNA進行參與〔12〕。通過miR-34a-5p對H2O2誘導兔源性晶狀體上皮細胞凋亡的研究，達到尋找出治療白內障的目的，具有重要意義及價值。

晶狀體上皮細胞在晶狀體前囊內的表面緊密吸附，與晶狀體纖維連接較為疏松，但一直分化為晶狀體纖維。細胞凋亡被分為兩類，一類是細胞死亡受體途徑，另一類是線粒體途徑。成熟的晶狀體上皮細胞相比較正常晶狀體上皮細胞，平均密度較低〔13〕。在過熟期白內障中有56%重疊細胞，在正常時，白內障重疊細胞只在晶狀體細胞分裂生發帶。相關研究顯示，白內障晶狀體前囊中央區域出現重疊細胞，可能由于觸發細胞增殖機制致使〔14〕。H2O2誘導晶狀體上皮細胞出現凋亡，一直在研究白內障中被認為是經典模型。由H2O2誘導后的晶狀體上皮細胞會出現氧化損傷，使其出現嚴重細胞凋亡〔15〕。本研究結果說明，通過miR-34a-5p下調，能夠提升晶狀體上皮細胞的活性，降低細胞的凋亡。

在晶狀體上皮細胞中，由于各種刺激因子引起氧自由基是導致白內障發生發展的主要因素〔16〕。在白內障發病機制中，由于氧化應激在其中具有重要作用。經過外源性或內源性的ROS對細胞信號進行轉導系統的綜合作用作為氧化應激損傷的主要表現〔17〕。當ROS的過度表達，致使細胞受到嚴重的氧化應激，進而晶狀體上皮細胞出現衰老、凋亡及壞死的后果。當H2O2誘導后的晶狀體上皮細胞后，ROS會出現明顯表達，能夠使正常晶狀體上皮細胞受到破壞，從而導致〔18〕。本研究結果說明，通過miR-34a-5p下調，能夠降低H2O2誘導兔源性晶狀體上皮細胞氧化應激損傷。

當晶狀體細胞膜上出現大量脂質過氧化物堆積，使其膜上相關酶活性降低，損害晶狀體屏障功能，導致晶狀體的光學性質與晶狀體中環境出現變化，脂質過氧化物同時能夠引起晶狀體出現混濁〔19〕。氧化應激在白內障的發病中有著重要作用，是關鍵性的調節因子，能夠導致晶狀體上皮細胞的凋亡〔20〕。經過H2O2誘導晶狀體上皮細胞增加ROS含量，從而使細胞中的抗氧化物質降低，如SOD、CSH-Px等，在白內障的形成中占據重要作用〔21〕。SOD作為在正常機體中存在的抗氧化酶，能有效地清除自由，抵抗機體內氧化應激損傷及維持正常的代謝白內障形成〔22〕。本研究結果說明，通過miR-34a-5p下調，能夠抵抗H2O2誘導兔源性晶狀體上皮細胞造成的氧化應激，說明miR-34a-5p在H2O2誘導兔源性晶狀體上皮細胞中的作用機制。

Bcl-2是重要的抗凋亡基因，能夠抑制超氧離子產生過多的程序化死亡誘導因子釋放，以達到抑制細胞凋亡的目的〔23〕。SIRT1作為哺乳動物內重要煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)具有依賴性的乙酰化酶，在多種細胞的衰老、凋亡等生理過程中均有參與〔24〕。本研究結果說明，通過miR-34a-5p下調，能夠抵抗H2O2誘導兔源性晶狀體上皮細胞的凋亡、衰老等情況。

綜上，當H2O2誘導后的晶狀體上皮細胞中下調miR-34a-5p表達能夠提升細胞的活性，抵抗細胞凋亡，能夠顯著改善氧化應激，同時減輕氧化應激造成的損傷，并具有抗衰老的作用。