鹽酸戊乙奎醚預處理對失血性休克致急性肺損傷大鼠肺組織保護作用及對炎癥因子的影響

胡乃元 歐陽華 徐巧精 王丹風 田毅

(中南大學湘雅醫學院附屬海口醫院麻醉科，海南 海口 570208)

急性肺損傷(ALI)是常見的呼吸系統危重病癥，臨床表現以低氧血癥、彌漫性肺泡損傷、肺不張為主，可由肺內(肺炎、膿毒癥等)和肺外(創傷等)等多種因素引起〔1〕。大量研究表明，ALI的發生機制主要與機體炎性因子釋放過度、導致抗炎和促炎反應失衡有關〔2,3〕。目前用于ALI治療的常用藥物包括前列環素、一氧化氮、非甾體抗炎藥和糖皮質激素等，但療效欠佳且存在不良反應發生率高等問題。抗膽堿藥治療是ALI輔助治療的傳統手段之一，其能通過抑制炎性細胞的活化，減少白細胞介素(IL)-1等炎性因子釋放，減輕ALI的臨床癥狀〔4〕。但在臨床實踐過程中研究者們發現，目前應用的抗膽堿藥受體特異性較差，不良反應多，從而限制了其推廣應用。研究發現，鹽酸戊乙奎醚(PHC)作為一種新型選擇性膽堿藥，不僅具有一定的抗炎作用，且可選擇性抑制M1和M3受體，為抗膽堿藥治療ALI提供了新的方向〔5〕。為進一步探究ALI發病機制及PHC對ALI的應用效果，本研究以失血性休克致大鼠ALI模型研究對象，探討PHC預處理對失血性休克致大鼠ALI中肺組織和血清中IL-10、腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-1β等炎性因子表達的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1大鼠 選取50只健康SD大鼠，雄性，6～8周齡，體重200～250 g，由成都達碩生物科技有限公司提供，生產許可證號：SCXK(川)2018-24，適應性飼養1 w，期間給予自由飲水和飲食，光照12 h。所有程序均經醫院倫理委員會批準，每個實驗程序按照相關規定進行。

1.1.2主要實驗試劑 PHC(規格：1 ml∶0.5 mg，批準文號：H20051948，生產批號：20180511-1，生產廠家：成都力思特制藥股份有限公司)；IL-10、TNF-α、IL-1β酶聯免吸附試驗(ELISA)試劑盒(規格均為96T，產品貨號分別為：E-EL-R0016c、E-EL-R0019c、E-EL-R0012c，生產廠家均為武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司)；抗NF-κB、抗IκB激酶(IKK)、抗p65抗體(規格均為100 μl，產品貨號分別為：8242S、2697S、3033S，生產廠家均為Cell Signaling Technology)；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(規格均為96T，產品貨號分別為：DEIA3918、CED026、NATE-0380，均購自北京安必奇生物科技有限公司)。

1.1.3主要儀器和設備 -80℃超低溫冰箱：青島海爾集團；4℃、-20℃冰箱：合肥美菱股份有限公司；H1650-W離心機：湖南湘儀實驗室儀器有限公司；TGL-20M高速臺式冷凍離心機：湖南湘儀實驗室儀器有限公司；CKX41倒置顯微鏡：日本Olympus光學工業株式會社；IX-71熒光倒置顯微鏡：日本Olympus光學工業株式會社；Infinite M1000 Pro 全波長酶標儀:TECAN公司；TANKPE060高純水機：美國Millipore公司。

1.2動物分組 50只大鼠，適應性飼養1 w后，稱取體重，根據體重分層隨機分成：對照組(A 組)、模型組(B 組)和PHC低劑量組(C 組，0.3 mg/kg)、中劑量組(D 組，1.0 mg/kg)和高劑量組(E 組，3.0 mg/kg)，每組10只。

1.3實驗動物模型建立 腹腔注射的水合氯醛(濃度10%，給藥劑量3.5 ml/kg)進行麻醉。所有大鼠于右側頸動脈行穿刺置管，用于監測平均動脈壓(MAP)。選擇大鼠左側股動、靜脈進行穿刺置管，用于給藥、放血和血液回輸。A組僅行動、靜脈穿刺，不予放血；其余各組插管后，監測MAP，待MAP穩定10 min后，經動脈置管開始緩慢放血，MAP降至35～45 mmHg后，維持該MAP值60 min，回輸血液和等量生理鹽水，制備急性肺損傷模型〔6〕。C、D、E 組PHC均在放血前30 min采用股靜脈注射依劑量給予，然后按照B組方法制備急性肺損傷模型。

1.4取材 依照實驗設計方案，在大鼠復蘇4 h后，采用10%濃度水合氯醛對大鼠進行過量麻醉，股動脈放血處死大鼠，留取血樣，靜置30 min后，4℃，1 500 r/min離心20 min，取上清，-80℃冰箱保存備用。剪取大鼠右肺置于-4%濃度的甲醛溶液保存備用，剪取大鼠左肺置于-80℃冰箱保存備用。

1.5蘇木素-伊紅(HE)染色 (1)固定：將取得的肺組織標本放置在4%濃度的甲醛溶液中充分浸泡48 h。(2)脫水：分別用70%、80%、90%、95%、100%酒精進行梯度脫水；(3)透明：用二甲苯將標本透明2次，以替換標本組織內酒精，此過程需不斷觀察，直至標本透明似琥珀。(4)浸蠟：將透明標本組織放置在溶化好的石蠟里，置于溶蠟箱在65℃下保溫2 h；(5)包埋：觀察石蠟完全浸入到組織中以后進行包埋，待其冷卻凝固以后便成為蠟塊；(6)編號：記錄為標本來源大鼠編號；(7)切片：標本組織蠟塊用切片機在其中部自動橫行切取3張4 μm厚的薄片；(8)貼片：將切片在熱水中燙平，然后再貼在玻片上，置于烤箱58℃恒溫保持4 h。(9)染色：在脫蠟和水洗之后，采用蘇木素進行染色，保持3 min，繼續水洗之后再藍化，保持10 min，使用1%濃度的鹽酸酒精再進行分化，保持20 s，最后伊紅染色，保持5 min；(10)封片：使用70%、80%、90%、95%、100%酒精依次進行脫水，各自保持3 min，使用二甲苯進行透明，保持5 min，最后使用中性樹脂膠完成封片。

1.6免疫熒光 利用免疫熒光技術檢測肺組織中NF-κB蛋白表達，使用1.5方法中的石蠟包埋的肺組織，抗體濃度(一抗：NF-κB抗體；1∶200 二抗：1∶400)。

1.7Western印跡 對IKK、p65肺組織中的表達進行定量檢測。具體步驟：(1)取出大鼠肺組織，立即在研磨器內加細胞裂解液放置在冰上進行研磨，持續30 min，將混合液小心吸入到離心管中；(2)將離心管置于低溫高速離心機內，11 000 r/min，4℃離心，持續15 min，棄沉淀，取上清；(3)將上清液收集起來，二喹啉甲酸(BCA)法定量檢測蛋白濃度，依照3∶1的比例加入上樣緩沖液，再經過沸水浴持續5 min，進行滅活，在-20℃下儲存，以備后續使用；(4) 在110 mV下，用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)進行蛋白質分離，溴酚藍區帶到達分離膠以后，電壓調至200 mA，持續2 h，溴酚藍區帶進入分離膠末端，并即將泳出分離膠底部，轉至硝酸纖維膜上；(5) 按照20∶1的比例在PBST溶液中加脫脂奶粉，室溫條件下封閉1 h。依照一抗的推薦濃度和用量，加入奶粉對一抗進行稀釋。將硝酸纖維膜置于雜交袋，加一抗工作液在袋中，然后封口，4℃條件下，孵育過夜；(6)采用辣根過氧化物酶(HRP)標記好的二抗(抗兔IgG抗體，1∶2 000稀釋)工作液，再封口，37℃條件下，孵育1 h；(7)凝膠成像分析儀掃描并分析結果。繪制標準曲線，并計算濃度，結果用相對灰度值表示。

1.8統計學方法 采用 SPSS22.0 軟件，多組數據的比較采用ANOVA分析，采用 Bonferroni校正的t檢驗進行多重比較。

2 結 果

2.1PHC對ALI大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-10、MDA、SOD、LDH水平及肺W/D值的影響 與A組相比，B、C、D、E組血清中TNF-α、IL-1β、IL-10、MDA、SOD、LDH水平及W/D值均明顯升高(P<0.05)；與B組相比，C、D、E組TNF-α、IL-1β、IL-10、MDA、SOD、LDH水平及W/D值明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組血清中TNF-α、IL-1β、IL-10、MDA、SOD、LDH水平及肺W/D值比較

2.2PHC對ALI大鼠肺組織病理的影響 A組肺表面光滑，鏡下肺泡規則，細胞形態正常；B組肺組織較A組明顯增大，肺表面可見散在的紅色斑點，鏡下肺泡壁較A組明顯增厚，肺泡腔內存在大量中性粒細胞浸潤和紅細胞滲出，病理結果提示ALI大鼠模型造模成功。C組、D組和E組肺組織的炎癥病理改變較B組明顯減輕，中性粒細胞等炎細胞浸潤顯著減少。見圖1。

圖1 各組肺組織病理學改變(HE染色，×400)

2.3PHC對ALI大鼠肺組織中NF-κB通路蛋白表達的影響 Western印跡結果表明，B、C、D、E組肺組織中IKK(2.03±0.28、1.42±0.15、1.35±0.09、1.12±0.10)、p65表達(1.78±0.21、1.67±0.22、1.36±0.18、1.22±0.14)較A組IKK(1.00±0.09)和p65表達(1.00±0.12)明顯增加，而C、D、E組IKK、p65表達量較B組明顯下降(均P<0.05)。免疫熒光結果顯示，A組肺支氣管管壁周圍存在少量p65綠色熒光表達，B組中綠色熒光強度較A組明顯增加，C、D、E組綠色熒光強度較B組明顯減弱，提示NF-κB表達下降。見圖2、圖3。可推斷大鼠失血性休克可誘導NF-κB通路激活，使IKK、P65蛋白表達增加，預防性給予PHC可以抑制NF-κB通路激活。

圖2 Western印跡檢測肺組織IKK、p65蛋白表達

圖3 免疫熒光檢測各組肺組織NF-κB蛋白表達(×200)

3 討 論

有流行病學研究表明，ALI在我國ICU患者中的發病率高達10.2%，且病死率接近11.3%〔7〕。因此，進一步探究ALI的發病機制，尋找預防和治療ALI新的安全有效的藥物具有重要的臨床意義。目前ALI發病機制尚不完全清楚，但多數研究認為氧化應激水平過高和炎癥反應失控在ALI 發病中起著關鍵作用〔8～10〕。NF-κB是Rel家族二聚體蛋白的一種，在調節機體炎癥介質中具有核心轉錄因子的作用〔11〕。當機體氧化應激水平升高時，可激活NF-κB通路，使通路下游的抗氧化酶(MDA、SOD、LDH)、炎性細胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-10)及選擇素等基因表達增加，從而使肺血管內皮遭到破壞，滲透性變大，引起肺組織水腫〔12～14〕。因此，阻斷NF-κB的活化對阻止炎癥介質大量產生，預防ALI 的發生、發展具有一定效果。

PHC具有抗膽堿、抗感染、抗氧化、抑制胃酸分泌等多種藥理作用〔15～17〕，已廣泛用于麻醉前給藥、有機磷中毒、慢性阻塞性肺病、內臟平滑肌痙攣等疾病的治療〔18〕，但在ALI中的報道尚少。本研究結果提示本動物模型造模機制為大鼠失血性休克后造成NF-κB通路激活引起下游抗氧化酶和炎性細胞因子基因轉錄增加。IKK和p65是NF-κB 通路中的重要蛋白成員，抑制p65和IKK活性可以減少NF-κB 激活〔19,20〕。免疫熒光結果證實了實驗推測。通過對比PHC給藥組結果可部分說明PHC對降低ALI的發生率具有一定的預防價值，但其機制是否與抑制NF-κB通路激活、減少下游抗氧化酶和炎性細胞因子基因的轉錄有關，尚需進一步驗證。而進一步研究結果顯示，PHC組中NF-κB、P65 和 IKK 表達水平較B組明顯下降，驗證以上推測。

綜上，PHC可明顯減輕肺組織含水量，改善ALI大鼠肺組織中炎性細胞浸潤和肺水腫情況，減輕肺部病理損傷，其機制可能與抑制NF-κB通路激活、減少下游抗氧化酶和炎性細胞因子基因的轉錄有關。PHC具有較好的預防失血性休克致ALI的作用。本研究由于樣本量有限，實驗方法單一，且ALI發病復雜，仍需更大的樣本量、更豐富的實驗方法進行驗證。