壯醫藥線點灸通過PI3K/Akt/mTOR信號通路調節MMP對膝骨性關節炎大鼠的治療作用

張燕珍 梁超 鮑春齡 陳少萍

(1海口市中醫醫院，海南 海口 570216；2上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院)

膝骨性關節炎(KOA)是一種退行性疾病，是由于膝關節軟骨細胞的增殖和凋亡平衡失調所致，近年來KOA的發病率有上升趨勢〔1〕。在細胞凋亡的過程中磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(P13K/Akt/mTOR)信號通路起著關鍵的作用〔2〕。基質金屬蛋白酶(MMPs)能夠使得軟骨細胞外基質被降解，使得軟骨細胞暴露在炎性物質中，在KOA中MMPs存在高表達，軟骨細胞因此加速凋亡，軟骨進而被破壞〔3〕。壯醫藥線點灸療法是壯醫的特色醫技療法，已經在多種疾病中有長期的實踐應用〔4〕。本實驗探討PI3K/Akt/mTOR信號通路對MMP-13的調節及其進一步影響KOA模型大鼠壯醫藥線點灸的治療作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 SD大鼠60只，雌雄各一半，體重140～160 g。按5只/籠進行群養，屏障環境動物室，空氣流通，相對濕度60%，光照條件恒定，以基礎飼料常規喂養，自由飲水。適應性飼養7 d后，隨機數字表法分為：對照組、模型組、藥線組，每組20只。整個實驗過程遵照中華人民共和國科技部2006年頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》中的相關條款。

1.2主要試劑和儀器 木瓜蛋白酶、二喹啉甲酸均購自阿拉丁上海阿拉丁生化科技股份有限公司，壯醫藥線由廣西中醫藥大學壯醫藥研究中心提供，酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自美國云克隆公司武漢云克隆科技股份有限公司，MMP-13(貨號：MA5-14238)、PI3K(貨號：PA5-83748)、Akt(貨號：44-621G)、p-Akt(貨號：PA5-36780)和mTOR(貨號：PA5-34663)單克隆抗體及相應二抗均購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司、PI3K/Akt抑制劑(LY294002，貨號：L9908-1MG)購自美國Sigma公司。

1.3建立大鼠KOA模型 參照段文秀等〔5〕的方法制備KOA大鼠模型：選擇剃須刀剔除大鼠雙膝關節及其周邊鼠毛，消毒皮膚表面后，僅對模型組和藥線組注射0.2 ml木瓜蛋白酶至雙膝關節腔內(第1,4,7天各1次)，對照組注射等量生理鹽水，利用KOA疲勞易發生的特點，迫使實驗大鼠在動物試驗跑臺每天至少跑動30 min，2 w后可得KOA大鼠模型。

1.4干預治療方法〔6〕(1)取穴方法：整體取穴：根據壯醫整體治療原則，每次取腎俞、脾俞、下關元、足三里(雙)、食背(雙)、趾背(雙)、勞宮、涌泉。局部取穴：根據壯醫“寒手熱背腫在梅，各疾施灸不離鄉”的原則，受累關節取梅花穴。(2)操作手法：采用2號藥線，點燃后甩動手腕，火焰熄滅，將呈珠狀炭火的線頭對準應灸部位或經穴快速點灸，如雀啄食，一觸即起，此為一壯，一般一穴灸1～3壯。10 d為1個療程，休息3 d開始第2個療程，治療3個療程。

1.5取材 藥線組干預治療后，處死各組大鼠，手術切開膝關節腔，切取右側股骨內側髁處厚度約2 mm關節軟骨，將取出的膝關節軟骨組織立即進行4%多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片在-20℃冰箱保存；取炎癥關節軟骨組織，用于免疫蛋白印跡法檢測；剝取右后膝關節軟骨后分離軟骨細胞，在高糖DMEM培養基(含體積分數10%的胎牛血清)中培養和細胞傳代，待細胞傳至第2代后行后續實驗。取關節腔內提取關節液,并以2 000 r/min 離心10 min用于炎癥因子水平測定。

1.6大鼠膝骨關節軟骨組織形態觀察 將組織切片室溫靜置15 min，分別經二甲苯脫蠟，乙醇梯度脫水，進行蘇木素-伊紅(HE)染色后，并在光學顯微鏡下對染色結果進行拍照，觀察各組大鼠關節軟骨組織形態變化情況。

1.7ELISA檢測軟骨中炎癥因子含量 所取炎癥關節軟骨組織加入磷酸鹽緩沖液(PBS)置于勻漿器中充分研磨，于4℃，2 000 r/min，離心30 min，收集上清液。依照ELISA試劑盒說明書對軟骨中腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-1β、IL-6進行檢測。

1.8免疫蛋白印跡法檢測相關蛋白表達 用液氮研磨所取炎癥關節軟骨組織，加入裂解液以提取組織的總蛋白，并采用二喹啉甲酸(BCA)法對蛋白進行定量。取30 μg待測樣本蛋白在10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，之后把凝膠轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，加入5%脫脂奶粉封閉2 h后加入一抗后于4℃冰箱孵育過夜或于搖床上振搖2 h。其中一抗分別加入MMP-13、PI3K、Akt、p-Akt、mTOR和MMP-13(工作濃度1∶1 000)抗體。再用PBS漂洗3次后，加入相應的二抗孵育2 h。洗膜后在暗室中X線曝光、顯影，利用Quality One對蛋白條帶灰度進度分析，以β-actin為內參計算樣本蛋白相對表達量。

1.9細胞實驗

1.9.1軟骨細胞制備及干預分組 將僅注射生理鹽水大鼠的第二代軟骨細胞分為正常組，未進行干預治療的KOA大鼠第二代軟骨細胞分為兩組：(1)實驗組：僅予以含體積分數10%胎牛血清的高糖DMEM培養基培養；(2)實驗+LY組：培養基中加入50 μmol/L PI3K通路抑制劑LY294002溶液干預(配制方法：5 μmol LY294002溶于100 ml無菌生理鹽水中)。

1.9.2免疫蛋白印跡法檢測相關蛋白表達 分別收集各組細胞用PBS洗3遍，棄上清。加3倍體積細胞裂解液于冰上裂解后再用超聲破碎細胞，離心后取上清，加入等體積上樣緩沖液，煮沸后進行如1.8同樣操作。

1.10統計學方法 采用SPSS22.0軟件，符合正態分布的計量資料多組均值比較用單因素方差分析，兩兩比較用LSD檢驗。

2 結 果

2.1關節軟骨組織形態變化 對照組軟骨細胞分布均勻，軟骨層平整，滑膜結構完整；模型組軟骨細胞減少且排列雜亂，軟骨層不平整；藥線組關節軟骨邊緣不平整，軟骨細胞排列雜亂；藥線組軟骨細胞增生且分布不均，關節軟骨表面不規則欠光滑。見圖1。

圖1 各組關節軟骨組織形態變化(HE染色，×200)

2.2壯醫藥線點灸對膝骨關節炎癥因子的影響 3組關節軟骨組織中的炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平差異均具有統計學意義(均P<0.05)。與模型組比較，對照組和藥線組TNF-α、IL-1β、IL-6含量均顯著降低(均P<0.05)，且與對照組比較，藥線組TNF-α、IL-1β、IL-6含量均顯著升高(P<0.05)。見表1。

2.3壯醫藥線點灸對PI3K/Akt/mTOR信號通路的影響 3組關節軟骨組織的PI3K、p-Akt和mTOR蛋白表達水平差異均具有統計學意義(均P<0.05)。與模型組比較，對照組和藥線組PI3K蛋白、p-Akt蛋白和mTOR蛋白相對表達量均顯著升高(均P<0.05)，且與對照組比較，藥線組PI3K、p-Akt和mTOR蛋白相對表達量均顯著降低(均P<0.05)。各組間AKT蛋白相對表達量差異無統計學意義(P>0.05)。見表1、圖2。

2.4壯醫藥線點灸對MMP的影響 3組關節軟骨組織的MMP-13蛋白表達水平差異具有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，對照組和藥線組MMP-13蛋白的相對表達量均顯著降低(均P<0.05)，且與對照組比較，藥線組MMP-13蛋白相對表達量顯著升高(P<0.05)。見表1、圖2。

圖2 各組MMP、PI3K/Akt/mTOR信號通路蛋白表達

表1 各組關節軟骨組織中炎癥因子含量、PI3K、Akt、p-Akt、mTOR蛋白及MMP-13蛋白表達水平的比較

2.5抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路對MMP蛋白的影響 3組關節軟骨細胞中的PI3K、p-Akt、mTOR和MMP-13蛋白表達水平差異均具有統計學意義(均P<0.05)。與正常組比較，實驗組和實驗+LY組的PI3K、p-Akt和mTOR的蛋白表達水平顯著降低(均P<0.05)，MMP-13蛋白表達水平顯著升高(均P<0.05)；且與實驗組比較，實驗+LY組PI3K、p-Akt和mTOR的蛋白表達水平顯著降低(均P<0.05)，MMP-13蛋白表達水平顯著升高(均P<0.05)。見表2、圖3。

表2 各組關節軟骨細胞中PI3K、Akt、p-Akt、mTOR和mmp-13蛋白表達水平的比較

圖3 PI3K/Akt/mTOR信號通路對MMP的調節

3 討 論

KOA是世界上較為常見的關節疾病，是指關節面軟骨發生病變及結構破壞，進而出現膝關節活動功能障礙，臨床上有膝部酸痛、膝關節腫脹等癥狀〔7〕，同時有修復能力逐年降低、不可逆等特點〔8〕，且發病群體主要為中老年人，嚴重損害了中老年人的生活質量。而目前KOA患者除接受耗費人力財力的手術治療外，暫時沒有特別有效的治療方法，有關壯醫藥線點灸針對KOA療法的研究報告還鮮有報告，暫時缺乏實驗基礎研究和機制研究。

壯醫藥線點灸法是傳統壯醫的療法之一，是壯族人民在長期臨床實踐中總結出來的獨具民族風格的智慧結晶。陳攀〔9〕的研究稱，壯醫理論認為：人的大病小病都不是憑空而來，是因為氣血的平衡關系被打破而導致的，因此氣血是壯醫尤其關注的因素，在臨床上也是通過各種療法來調節氣血的平衡。壯醫認為〔10〕，穴位是人體氣血進出之處，也是邪毒出入之處，通過藥線點灸可以祛毒，進而使氣血趨向平衡，從而使人身體健康。以往研究表明，壯醫藥線點灸法對KOA有一定的療效〔11〕，KOA與PI3K/Akt/mTOR信號通路有一定聯系〔12〕。

此前有多項研究表明〔13～15〕，TNF-α、IL-1β、IL-6能夠作為KOA發展過程中的觀測指標，判斷KOA的進展。本實驗結果表明壯醫藥線點灸法在一定程度上抑制炎癥反應，對KOA模型大鼠有一定的治療作用。PI3K/Akt/mTOR信號通路被認為在細胞發展過程中具有重要的作用，能夠調控細胞分化、增殖和凋亡。mTOR作為PI3K和Akt的下游信號分子，當PI3K被激活后，首先募集和激活Akt信號分子，Akt再使得mTOR活化。當PI3K/Akt/mTOR信號通路被激活后，會促進細胞的增殖，這在KOA中表現為能促進軟骨細胞的增殖，抑制軟骨細胞的丟失和軟骨層的脫落，進而起到治療KOA的效果。MMPs作為依賴Ca2+、Zn2+等金屬離子的一類蛋白家族，可降解除多糖外細胞外的所有基質，這在關節軟骨中表現為軟骨細胞外基質被降解，進而導致軟骨層脫落。研究結果顯示〔16〕，在KOA中MMP-13可能是主要影響因子之一。本研究結果提示，PI3K/Akt/mTOR信號通路能夠通過下調上游信號分子PI3K最終抑制MMP-13蛋白的表達，這與此前高瑞林等〔17〕研究結果類似。本研究結果顯示在KOA中，PI3K/Akt/mTOR信號通路被抑制，MMP-13高表達會導致軟骨細胞凋亡加速，進而使得軟骨層脫落，炎癥加重。

綜上，壯醫藥線點灸法對于治療KOA有一定的效果，同時提示其作用機制可能與激活PI3K/Akt/mTOR信號通路抑制MMP-13的表達有關，在一定程度上為KOA的臨床治療提供了理論參考。