MMP-9、Myosin-9及LGR4在老年非小細胞肺癌中表達及臨床意義

王寶 趙暉 賈春祎 趙鑫 鄒勤光 孫少林 王啟文 (吉林省腫瘤醫院，吉林 長春 130000)

肺癌是臨床中最為常見的惡性腫瘤，目前在已知的惡性腫瘤中，發病率和死亡率均居首位，每年全球超過90萬人因該病死亡，已成為嚴重的公共健康問題〔1〕。肺癌本身具有侵襲、轉移能力強的特點，在疾病早期易發生轉移，大部分肺癌患者就診時多已發生區域淋巴結轉移〔2〕。隨著現代分子生物學的發展，肺癌發病機制已成為研究熱點，但該病發病機制復雜，至今未能完全闡明其發病的深層機制〔3,4〕。非小細胞肺癌(NSCLC)占肺癌發生的大多數，小細胞肺癌患者手術療效不佳，故本研究選取NSCLC患者為研究對象。基質金屬蛋白酶(MMP)-9可促進腫瘤內新生血管的形成，為腫瘤組織供給血液，對腫瘤細胞的侵襲、轉移起到促進作用〔5〕。肌球蛋白重鏈(Myosin)-9是非肌肉肌球蛋白家族一員，其與細胞的多重生物學功能有關，是新發現的腫瘤轉移相關蛋白，Myosin-9對NSCLC臨床病理學影響并未見系統研究〔6〕。富含亮氨酸重復序列G耦聯蛋白受體(LGR)4，屬于哺乳類基因中最大的蛋白超家族，原癌基因Wnt異常時，可增加LGR4蛋白表達，加速腫瘤細胞分裂、增殖〔7〕。本研究探討MMP-9、Myosin-9及LGR4在老年NSCLC中表達及臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇吉林省腫瘤醫院于2019年3月至2021年3月進行手術的老年NSCLC患者53例，平均(71.87±5.46)歲；納入標準：均經手術病理證實為NSCLC患者；年齡≥60歲；未進行化療、放療及激素治療者。排除標準：具有明顯炎癥細胞浸潤癌旁組織；合并其他腫瘤者。

1.2試劑與儀器 主要試劑：兔抗人MMP-9、兔抗人Myosin-9、兔抗人LGR4(北京百奧萊博科技有限公司)；二氨基聯苯胺(DAB)試劑盒(武漢博士德公司)，SP法組化試劑盒(福州邁新生物技術有限公司)，Trizol試劑盒(碧云天生物技術公司)，逆轉錄試劑盒(碧云天生物技術公司)，二喹啉甲酸(BCA)試劑盒(上海雅吉生物科技有限公司)。主要儀器：光學顯微鏡(日本Olympus)，移液槍(美國Thermo)，石蠟切片機(美國Thermo)，PCR儀(力康生物醫療科技控股有限公司)，電泳儀(北京六一儀器廠)。

1.3取樣 將入組患者術中切除腫瘤組織部分進行取樣，一部分送往病理科進行病理觀察及免疫組化染色；另一部分液氮保存用于MMP-9、Myosin-9和LGR4蛋白及mRNA檢測。另取入組患者經病理證實為癌旁5 cm以上的肺組織作為對照。

1.4免疫組化法測定MMP-9、Myosin-9和LGR4蛋白 取所有標本以10%多聚甲醛液固定，采用石蠟包埋，以4 μm厚連續切片。石蠟切片，應用二甲苯常規脫蠟，并采用酒精復水，蒸餾水沖洗；應用蘇木素染色5 min，應用自來水沖洗5 min；返藍15 min；再以蒸餾水沖洗，伊紅染液染色3 min；應用自來水沖洗，鏡下觀察。石蠟切片經烤箱烤片、常規二甲苯脫蠟，并采用不同梯度酒精水化；應用3%H2O2室溫修復10 min，再以磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，2 min/次；微波抗原修復，應用PBS沖洗3 min；加入一抗放置于4℃孵育過夜，放于室溫條件下，應用PBS沖洗3次，2 min/次；應用DAB顯色5～10 min；脫水、透明和封片。結果判定：MMP-9、Myosin-9和LGR4主要定位于細胞膜或細胞質內。選取5個視野置于顯微鏡下觀察，按陽性細胞數量和顯色強度分級。其中以無著色為陰性(-)，以陽性細胞數25%并顯色強度為淡黃色為弱陽性(+)，以陽性細胞數25%～60%并顏色強度介于強陽性與弱陽性之間為中度陽性()，以陽性細胞數〉60%并多數細胞呈棕褐色或棕黃色為強陽性()。

1.5實時熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)測定MMP-9、Myosin-9和LGR4表達 采用Trizol法提取癌組織及癌旁組織總RNA，RNA濃度和純度采用分光光度計測定，以逆轉錄試劑盒反轉錄成cDNA。以cDNA作為模板，分別擴增MMP-9基因、Myosin-9基因、LGR4基因和GAPDH。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司。PCR條件：94℃預變形5 min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個循環，72℃延伸7 min，設置3個復孔。應用2-△△Ct計算MMP-9、Myosin-9和LGR4相對表達量。

1.6Western印跡測定MMP-9、Myosin-9和LGR4蛋白表達 采用RIPA裂解液提取癌組織及癌旁組織蛋白，根據BCA法測定蛋白濃度，加入緩沖液后變性蛋白。按每泳道以50 μg蛋白12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，蛋白轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，再采用5%脫脂奶粉37℃封閉1 h。加入MMP-9一抗(1∶500)、Myosin-9一抗(1∶200)和LGR4一抗(1∶500)后放置于4℃孵育過夜。應用TBST溶液漂洗3次后，再加入二抗，室溫孵育1 h。再采用TBST洗滌3次，10 min/次。應用電化學發光(ECL)液暗室發光顯影，采集圖像并分析，內參選GAPDH。

1.7統計學方法 采用SPSS26.0軟件進行t檢驗、χ2檢驗，運用Logistic多因素回歸分析NSCLC發病影響因素。

2 結 果

2.1癌組織與癌旁組織 MMP-9、Myosin-9和LGR4蛋白陽性率及mRNA表達比較 癌組織MMP-9、Myosin-9和LGR4蛋白陽性率、mRNA表達及蛋白灰度值明顯高于癌旁組織(P<0.05)。見圖1、表1。

表1 癌組織及癌旁組織MMP-9、Myosin-9和LGR4蛋白陽性率、mRNA表達及蛋白灰度值比較

圖1 MMP-9、Myosin-9及LGR4蛋白在癌組織與癌旁組織中表達

2.2不同病理特征癌組織MMP-9、Myosin-9和LGR4蛋白陽性率及mRNA表達比較 不同性別、年齡、腫瘤類型和分化程度癌組織MMP-9、Myosin-9和LGR4蛋白陽性率及mRNA表達明顯比較無明顯差異(P>0.05)；Ⅲ期癌組織MMP-9、Myosin-9和LGR4蛋白陽性率及mRNA表達明顯高于Ⅰ～Ⅱ期(P<0.05)；淋巴結轉移癌組織MMP-9、Myosin-9和LGR4蛋白陽性率及mRNA表達明顯高于無淋巴結轉移組織(P<0.05)；吸煙史癌組織MMP-9、Myosin-9和LGR4蛋白陽性率及mRNA表達明顯高于無吸煙史(P<0.05)。見表2。

表2 不同病理特征癌組織MMP-9、Myosin-9和LGR4蛋白陽性率及mRNA表達比較〔n(%)〕

2.3不同病理特征癌組織MMP-9、Myosin-9及LGR4蛋白表達比較 不同性別、年齡、腫瘤類型和分化程度癌組織MMP-9、Myosin-9和LGR4蛋白灰度值比較無明顯差異(P>0.05)；Ⅲ期癌組織MMP-9、Myosin-9和LGR4蛋白灰度值明顯高于Ⅰ～Ⅱ期(P<0.05)；淋巴結轉移癌組織MMP-9、Myosin-9和LGR4蛋白灰度值明顯高于無淋巴結轉移組織(P<0.05)；吸煙史癌組織MMP-9、Myosin-9和LGR4蛋白灰度值明顯高于無吸煙史組織(P<0.05)。見表3。

表3 不同病理特征癌組織MMP-9、Myosin-9和LGR4蛋白灰度值比較

2.4多因素Logistic回歸分析老年NSCLC發病危險因素 吸煙史、MMP-9、Myosin-9和LGR4高表達為影響老年NSCLC發病危險因素。見表4。

表4 多因素Logistic回歸分析老年NSCLC發病危險因素

3 討 論

目前，關于NSCLC具體發病原因尚未完全明確，認為大氣污染、吸煙、室內燃煤、石棉暴露、高濃度砷等均可增加肺癌風險〔8～10〕。由于NSCLC癥狀較為隱匿，通常就診時已屬中晚期，以此導致患者錯失了最佳根治時機〔11〕。因此，及時有效地診斷和治療NSCLC方法對提高療效及預后具有重要意義。

MMPs是細胞外基質的重要調控因子，并且參與了腫瘤細胞外間質的分解，以此促進腫瘤的侵襲，而在腫瘤反復中侵襲性被認為是重要因素。MMP-9是MMPs家族中重要一員，是降解腫瘤細胞外基質的一種酶類，其成分主要為Ⅳ型膠原，而其中細胞外基質的降解是微淋巴管生成、腫瘤微血管生成及腫瘤侵襲轉移的必要條件。多項研究證實，MMP-9在多種惡性腫瘤中高表達，并參與了腫瘤細胞的轉移與侵襲，通過抑制MMP-9表達，從而達到抑制腫瘤生長并轉移的目的〔12，13〕。彭煒東等〔14〕研究發現，MMP-9主要表達于腫瘤細胞，MMP-9表達與肺腺癌分化程度呈負相關，且與4年無進展生存期呈負相關。本研究表明，MMP-9在老年NSCLC患者中高表達；且MMP-9表達與臨床分期、淋巴結轉移和吸煙史密切相關。

Myosin-9是非肌肉肌球蛋白家族一員，并且作為參與細胞運動和遷移、細胞骨架重建的核心成員，其作用在腫瘤中越來越受人們關注〔15〕。Myosin-9主要由2條調節輕鏈、2條必需輕鏈和2條重鏈組成的一種留聚體，在炎癥、血栓性疾病及遺傳性疾病方面發揮作用。近年來研究發現，Myosin-9在多種惡性腫瘤中高表達，可見Myosin-9與人類各種疾病發生具有一定關系，并且認為可能與某種腫瘤發生、發展具有促進作用〔16，17〕。本研究表明，Myosin-9在老年NSCLC患者中高表達；且Myosin-9表達與臨床分期、淋巴結轉移和吸煙史密切相關。

LGR4是G蛋白耦聯受體家族成員之一，稱為富含亮氨酸重復序列的GPCR4，并且為重要的一種細胞膜受體，其組成包含17個內含子和18個外顯子，在成人和胚胎各種組織中廣泛表達，具有多種生物學功能，如促進器官發育、介導細胞信號傳導與激活，在多種惡性腫瘤發生發展中發揮促癌作用〔18，19〕。王春梅等〔20〕研究發現，胃癌患者血清LGR4表達高于胃良性腫瘤患者，低～中分化LGR4表達高于高分化，Ⅲ期LGR4表達高于Ⅰ～Ⅱ期，淋巴結轉移患者LGR4表達高于無淋巴結轉移患者。本研究表明，LGR4在老年NSCLC患者中高表達；且LGR4表達與臨床分期、淋巴結轉移和吸煙史密切相關。

綜上，MMP-9、Myosin-9和LGR4在老年NSCLC中表達，與臨床分期、淋巴結轉移和吸煙史密切相關，且為影響老年NSCLC發病危險因素。